温阳解毒方治疗结直肠癌的核心靶基因筛选及其机制分析

陈伊伦，钱力汇，李文迪，孙磊涛，丁书凝

1 浙江中医药大学第一临床医学院，杭州 310053；2 浙江中医药大学附属第一医院 浙江省中医院肿瘤科

结直肠癌是世界上病死率最高的第三大肿瘤类型，近十年来大部分国家结直肠癌的发病率和病死率日益上升，严重威胁着人类的健康［1-2］。目前，结直肠癌的治疗方式以手术、放疗、化疗及靶向治疗等为主。中医药对提高结直肠癌患者的免疫功能、减少肿瘤复发转移等均具有积极作用，且中医存在辨证思维、治疗法则丰富，在治疗过程中具有一定的优势［3］。中医将结直肠癌归入“肠积”“积聚”“肠覃”等，其发病病因包括外感湿热、饮食不节、情志所伤或正气亏虚等，阳虚是其发病的关键内在因素之一。阳气虚损，气不能化，亦不能温运，致邪毒羁留，壅滞不散，使大肠传导失司，日久积生于内，发为癌毒，故“温阳解毒”是中医治疗结直肠癌的主旨［4］。针对临床中“脾肾阳虚”和“湿热下注”证型的结直肠癌患者，“四逆汤”和“三黄汤”为主的化裁验方表现出良好疗效，能有效缓解腰膝酸软、肛门灼热、腹部阵痛、畏寒肢冷等症状。2021年9月—2023年3月，本研究以四逆汤合三黄汤为基础，提出“温阳解毒方”，包括附子、炙甘草、干姜、黄连、黄芩、黄柏等6种中药，并基于网络药理学及分子对接技术探讨温阳解毒方治疗结直肠癌的有效成分及核心靶基因，并分析其可能的机制，为结直肠癌的治疗提供更多新思路。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 结直肠癌相关疾病靶基因获取 在Genecards数据库（https：//www.genecards.org/）中，以“Colorectal Cancer”为关键词进行检索，筛选得到Score值＞中位数的结直肠癌相关疾病靶基因。

1.2 温阳解毒方有效成分及相关靶基因获取 在TCMSP数据库（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）中分别以附子、干姜、炙甘草、黄芩、黄连、黄柏为关键词进行检索，设置条件为口服生物利用度（OB） ≥30%、类药性（DL） ≥ 0.18，筛选并获取温阳解毒方有效成分，OB、DL值越高提示药物发挥作用特效性越强。根据Related Targets导出有效成分对应的靶基因，与UNIPROT数据库（https：//www.uniprot.org/）导出的人类相关靶基因进行匹配，获得温阳解毒方有效成分的相关靶基因。

1.3 温阳解毒方治疗结直肠癌的潜在靶基因筛选 将“1.1”获得的结直肠癌相关疾病靶基因与“1.2”获得的温阳解毒方有效成分的相关靶基因取交集，并进行标准化处理，转化为基因名称，获得药物—疾病共同靶基因，即为温阳解毒方治疗结直肠癌的潜在靶基因。将其导入Cytospace3.7.2软件，构建有效成分—靶基因调控网络图。

1.4 温阳解毒方治疗结直肠癌的核心靶基因筛选 将“1.3”获得的温阳解毒方治疗结直肠癌的潜在靶基因导入STRING数据库（https：//string-db.org/），物种限定为“智人（Homo sapiens）”，设置Score值＞0.4，其他参数保持默认值，得到温阳解毒方治疗结直肠癌潜在靶基因的蛋白质互相作用网络（PPI）图。将数据导入Cytoscape软件进行拓扑学分析，利用Network Analyze功能分析交集基因，综合参考Degree值、中介中心度和接近中心性，以Degree值＞平均值为筛选条件，确定网络中的关键靶基因。

1.5 核心靶基因的相关功能及机制分析 在String数据库对所得的预测靶基因进行分析，通过基因本体（GO）数据库（http：//geneontology.org/）进行核心靶基因的GO功能分析，包括生物过程（BP）、细胞组成（CC）、分子功能（MF）；通过KEGG数据库（https：//www.genome.jp/kegg/）进行核心靶基因的KEGG通路富集分析。

1.6 温阳解毒方关键活性成分与核心靶基因的结合效能分析 采用分子对接技术。基于TCMSP数据库，利用R软件得到6种中药重复的关键活性成分。基于PubChem数据库，下载重复活性化合物的3D结构，利用OpenBabelGUI转化为mol2格式。从RSCBPDB数据库下载温阳解毒方治疗结直肠癌的核心靶基因结构，将上述靶蛋白文件导入PyMOL软件，进行去水、加氢。使用AutoDock进行分子对接，并计算关键活性成分与核心靶基因之间的结合能。配体与受体的结合稳定性与分子对接的结合能呈负相关关系［5］，结合能的绝对值＞5.0表示结合稳定性良好，绝对值＞7.0则表示结合稳定性很高。

2 结果

2.1 温阳解毒方治疗结直肠癌的潜在靶基因筛选结果 在Genecards数据库筛选得到结直肠癌相关疾病靶基因1 349个。在TCMSP和UNIPROT数据库筛选得到温阳解毒方中附子有效成分21种（对应靶基因29个）、干姜有效成分5种（对应靶基因48个）、黄柏有效成分37种（对应靶基因377个）、黄连有效成分14种（对应靶基因110个）、黄芩有效成分36种（对应靶基因399个）、炙甘草有效成分92种（对应靶基因1 518个）；去重后共计相关靶基因269个，与1 349个结直肠癌相关疾病靶基因取交集后，得到温阳解毒方治疗结直肠癌的潜在靶基因131个。有效成分—靶基因调控网络图见OSID码图1。

2.2 温阳解毒方治疗结直肠癌的核心靶基因筛选结果 温阳解毒方治疗结直肠癌潜在靶基因的PPI图见OSID码图2。拓扑学分析结果显示，温阳解毒方治疗结直肠癌的核心靶基因有6个，分别是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（Akt1）、p53、JUN、表皮生长因子受体（EGFR）、雌激素受体1（ESR1）、肿瘤坏死因子（TNF）。见表1、OSID码图3。

表1 温阳解毒方治疗结直肠癌潜在靶基因PPI图的拓扑学分析结果（排名前15位）

2.3 核心靶基因的相关功能及机制分析结果 GO功能富集分析结果显示，在BP中核心靶基因对刺激反应调节的反应显著性最高，其次是对细胞移动、细胞定位、生物黏附及细胞分化等；在CC中核心靶基因主要与膜区、质膜微区、膜筏有关；在MF中核心靶基因对酶结合方面的显著性最高，其次是与独立蛋白结合、药物结合、受体信号结合、蛋白质二聚化等；见OSID码图4～6。KEGG通路富集分析结果显示，核心靶基因主要作用于综合肿瘤信号通路、细胞衰老信号通路、p53信号通路、TNF信号通路、PI3K/Akt信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制信号通路、白细胞介素17（IL-17）信号通路等。见OSID码图7。

2.4 温阳解毒方关键活性成分与核心靶基因的结合能分析结果 6种中药的关键活性成分共11种，见表2。分子对接结果显示，Akt1、TNF、EGFR与11种关键活性成分均有较低的结合能，见表3；其中TNF与甲基黄连碱、EGFR与β-谷甾醇是温阳解毒方关键活性成分与核心靶基因结合能最低（结合稳定性最高）的两组，分别为-6.78、-6.56，其分子对接可视化图见OSID码图8、9。

表2 温阳解毒方6种中药的关键活性成分筛选结果

表3 温阳解毒方关键活性成分与其治疗结直肠癌核心靶基因的结合能

3 讨论

结直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，主要临床表现为排便习惯改变、便血、腹泻、局部腹痛等，晚期则表现贫血、体质量减轻等全身症状。温阳解毒方由四逆汤及三黄汤化裁而来，方中附子、干姜可温补脾肾之阳，黄连、黄芩、黄柏能够清热解毒。四逆汤出自《伤寒论》，主治少阴心肾阳衰寒厥证。药理研究表明，四逆汤可以通过调节肠道免疫力、减少肿瘤数量和大小、保护结肠黏膜屏障等途径，干预结直肠癌的发展［6］。此外，四逆汤亦有“深固阳根”之用，其有效成分分别在降低肿瘤细胞增殖活性、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长等方面发挥作用［7］。三黄汤出自《太平圣惠方》，主治火热内壅、三焦虚烦作渴等。已有研究表明，三黄汤能抑制肿瘤细胞增殖、转移及其耐药性，从而发挥增效减毒的效果，有助于改善肿瘤晚期患者的预后［8］。

本研究利用网络药理学的方法，筛选得到温阳解毒方治疗结直肠癌的潜在靶基因131个，其PPI图相关数据的拓扑学分析结果显示，温阳解毒方治疗结直肠癌的核心靶基因主要为Akt1、p53、IL-6、TNF、EGFR、MYC，其中以Akt1的Degree值最高。p53是人类常见的癌变基因之一，携带突变型p53蛋白的肿瘤病情进展相对较快，放化疗反应差，预后不良［9］。研究显示，黄芩提取物黄芩素能够通过降低突变p53表达来抑制结直肠癌的进展［10］。这与我们的研究结果一致。同时，p53与黄柏、黄连、黄芩中的活性成分小檗碱、豆甾醇具有高亲和性，能诱导细胞凋亡，抑制肿瘤发生［11-12］。 IL-6是与包括肿瘤在内的多种炎症病变相关的典型细胞因子，经STAT3蛋白上调靶基因表达，可以通过阻滞细胞生长周期来影响肿瘤细胞增殖，或可作为肿瘤的预后标志物之一［13］。TNF基因家族被认为是预测结直肠癌预后、免疫特征和免疫应答率的有效指标［14］。多项研究显示，附子可通过抑制IL-6、TNF表达，对脾肾阳虚型的结直肠癌患者发挥良好的治疗效果［15-16］。黄芩可通过抑制IL-6/STAT3信号通路活化，对湿热下注型结直肠癌有较好的治疗效果［17］。以上研究提示，临床上可以将IL-6、TNF作为温阳解毒方治疗结直肠癌临床效果的评价指标。

EGFR在多种肿瘤组织中的表达均升高，且通常与肿瘤进展及预后不良有关，EGFR磷酸化阳性的肿瘤患者生存时间更长［18］。研究显示，黄连素可通过抑制结肠巨噬细胞中促炎因子IL-6的产生，导致其驱动的EGFR/ERK信号通路受到抑制，有效抑制了EGFR的磷酸化水平，从而发挥抗肿瘤作用［19］。温阳解毒方或可通过抑制EGFR磷酸化途径，从而干预结直肠癌的病理变化，这一点未来需进一步研究。MYC在肿瘤细胞中过表达，与谷氨酰胺酶（GLS）、嘌呤代谢酶（PFAS和CAD）、胱硫硫氨酸-β-合酶（CBS）抑制剂之间存在合成致死作用，可能也是温阳解毒方治疗结直肠癌的一种作用机制［20］。因此，温阳解毒方的有效活性成分作用于Akt1、p53等核心基因，可能在抑制结直肠癌发生发展的过程中发挥了关键作用，但其具体作用机制尚不明了。

本研究GO功能和KEGG通路富集分析结果显示，温阳解毒方治疗结直肠癌的核心基因在PI3K/Akt信号通路具有高显著性，且通路关联最多的靶基因为Akt1、EGFR、p53等。PI3K/Akt信号通路突变及表观遗传变异是结直肠癌发生的重要分子基础之一，该信号通路的异常激活会促进肿瘤细胞增殖［21］。Akt1是Akt的主要亚型之一，参与包括细胞代谢、增殖、存活在内的多种生物学过程，是调节细胞存活信号通路的中心节点［22］。研究显示，黄柏及炙甘草的共有活性成分槲皮素可通过影响Akt1磷酸化，以及下调Akt1激酶表达，从而抑制结直肠癌细胞上皮—间质转化，并促进内源性大麻素受体（CB1-R）表达，从而抑制PI3K/Akt信号通路激活，发挥控制结直肠癌进展的作用［23］。研究显示，黄芩素可通过调节PI3K/Akt信号通路中的关键酶PTEN活性，抑制缺氧诱导的Akt磷酸化，从而发挥抗肿瘤作用［24］。另有研究显示，甘草有效成分甘草素能直接抑制PI3K/Akt信号通路活化，减轻结直肠癌患者的炎症反应，从而抑制肿瘤细胞EMT过程，减少肿瘤转移［25］。因此，温阳解毒方发挥抗肿瘤的作用与PI3K/Akt信号通路密切相关，然而其作用于结直肠癌的药动学、药代学研究等仍需进一步探讨。本研究分子对接结果显示，温阳解毒方治疗结直肠癌的11种重要成分与6个核心靶基因蛋白之间具有良好的结合能力，其中甲基黄连碱、β-谷甾醇、黄连碱与6个核心靶基因蛋白之间的结合能均较高。因此，甲基黄连碱、β-谷甾醇、黄连碱是温阳解毒方治疗结直肠癌的核心成分，但是其具体作用机制还有待进一步挖掘。

综上所述，温阳解毒方治疗结直肠癌的核心靶基因有Akt1、p53、JUN、EGFR、ESR1、TNF，其机制可能与调控p53、TNF、PI3K/Akt等信号通路有关。温阳解毒方主要通过多药物、多成分、多通路、多靶基因协同发挥抗结直肠癌作用，提示中药复方在肿瘤防治方面有广阔的前景，但后期仍需开展多项实验加以验证，为丰富临床用药种类、防治结直肠癌提供新思路。