54例复治利福平耐药结核病患者菌株遗传特征及耐多药基因分析

张洁，任怡宣，杨新宇，田丽丽，易俊莉，丁北川

北京市疾病预防控制中心，北京 100013

复治结核病患者较初治患者的病情更复杂、依从性更差、并发症更多，通常需要更长时间才能完成治疗方案，导致治疗成功率较低，进一步加剧了结核分枝杆菌（MTB）的传播。复治结核病是由两种不同的机制引起的，一是感染后经过较长时间潜伏再发病，是由相同的MTB引起的内源性复燃，二是由近期传播的不同MTB引起的外源性再感染［1］。耐药结核病是威胁结核病控制的又一个重要问题，尤其是利福平耐药结核病（RR-TB），而RR-TB常合并异烟肼耐药导致耐多药。2023年世界卫生组织估算，中国耐多药/利福平耐药结核病（MDR/RR-TB）患者数量达3万例，结核病新发病例和复治病例的利福平耐药率分别约为3%、20%［2］。但是，目前关于复治RR-TB患者的发病原因尚不清楚。本研究通过比较复治RR-TB患者分离MTB与其初治时分离MTB的基因型，从而判断其复治的发病原因，再分析复治RR-TB患者MTB的遗传特征和耐多药突变位点情况，为复治RR-TB患者的有效防治提供科学依据。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 在北京市疾病预防控制中心信息系统查询2017年1月—2019年12月北京市结核病防治机构及结核病定点医院收治的复治RRTB患者登记信息，疾控中心样本库中需同时留存有其初治及复治MTB，选择符合标准的复治RRTB患者54例，其中男45例、女9例，平均年龄46岁。本研究通过北京市疾病预防控制中心伦理委员会审核（JKS2020-02），患者或家属均签署知情同意书。

1.2 初治和复治分离的MTB基因型检测 共获得MTB 54对，初治和复治时分离的MTB各54株。①RD105基因缺失法：取PCR反应管，每管加入RD105 PCR MIX 19 μL，MTB DNA模板1 μL，混匀后进行PCR扩增。取PCR扩增产物5 μL，行2%琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker确定其分子相对量；若目的片段为786 bp，则该菌株为北京基因型。②15位点可变数目串联重复序列（MIRU-VNTR）基因分型实验：取PCR反应管15个，每个PCR管中分别加入15个基因位点（ETRA、ETRC、MIRU04、MIRU10、MIRU16、MIRU31、Mtub21、Mtub04、QUB11b、QUB26、QUB4156、MIRU26、MIRU40、Mtub30、Mtub39）的PCR MIX 19 μL，加入MTB DNA模板1 μL，混匀后进行扩增。取PCR扩增产物5 μL，行2%琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker确定其相对分子量，凝胶分析软件分析条带灰度值。根据各VNTR位点重复单元读数表和读数规则，计算各菌株在不同位点的重复数，将凝胶电泳结果转化成具体数字，数字相同则为相同基因型，数字不同则为不同基因型。相同基因型提示为内源性复燃，不同基因型提示为外源性再感染。

1.3 复治MTB的遗传特征分析 将“1.2”复治时分离的MTB MIRU-VNTR基因分型实验结果导入https：//miru-vntrplus.org网站，构建个体水平N-J树和UPGMA系统发育树，进行聚类分析，构建最小生成树（MST）。绘制病例之间的关联图，明确MTB在人群中的传播情况。感染有相同基因型即具有“成簇性”，提示患者可能是近期被同一传染源所感染。成簇率=（nc-n）/N × 100%，其中N是总的样本数、nc是成簇样本的数目、n是簇的数目；成簇率反映MTB在人群中的近期传播水平。

1.4 复治MTB的耐多药基因突变观察 采用分子线性探针药敏试验。按照试剂盒说明书，将提取的复治MTB DNA用生物素标记，作为引物进行多重PCR扩增和反向杂交。杂交反应结束后，根据显色结果进行判读，每个探针试纸条上共有27个反应条带。判读标准：当一个基因的所有野生型探针（WT探针）都能被检测到，并且在被检测区域没有检测到突变时，WT探针条带均显色且突变条带无显色，该样本被认为对相应的抗生素敏感；如果发生突变，各自的扩增产物不能结合到相应的WT探针，那么至少有1个WT探针条带缺失，或者突变型探针（MUT探针）条带显色，则该样本被认为是耐药的。每个与野生型模式不同的带型表示试验菌株耐药，用rpoB探针获得的带型可认为试验菌株对利福平耐药，用katG探针获得的带型可认为试验菌株对高水平异烟肼耐药，用inhA探针获得的带型可认为试验菌株对低水平异烟肼耐药。

2 结果

2.1 初治和复治分离的MTB基因型比较 RD105基因缺失法检测结果显示，108株MTB均为北京基因型；其中2株复治MTB扩增电泳后存在双位点现象，重复两次PCR后结果一致，提示为混合感染菌株，且均为北京基因型的相互混合，其初治分离MTB均为单一菌株。MIRU-VNTR基因分型实验结果显示，54对初治和复治分离的MTB中具有相同基因型42对，即复治RR-TB患者内源性复燃占比77.8%（42/54）；不同基因型12对（22.2%），即复治RR-TB患者外源性再感染占比22.2%（12/54）。

2.2 复治MTB的遗传特征分析结果 个体水平N-J树显示，54株北京基因型菌株呈“放射状”分布，提示这些菌株可能是由同一菌株进化而来，见OSID码图1。UPGMA系统发育树见OSID码图2。MST显示，所有菌株分为3个克隆复合群（CC1、CC2、CC3）和13个独特基因型；其中CC1包括37株（68.5%）菌株，共32个基因型；CC2、CC3各包含2株菌株，均为不同的基因型，共4个基因型；13株独特基因型菌株中，2株菌株成1个簇，共12个基因型；54株复治MTB共48种基因型，成簇率为11.1%；见OSID码图3。

2.3 复治MTB耐多药基因突变情况 54株复治MTB中，34株rpoB基因S531L位点发生突变，表现为野生条带WT8缺失、突变条带MUT3出现；1株rpoB基因D516V位点发生突变；7株rpoB基因H526D位点发生突变；11株rpoB基因有野生条带缺失，但没有出现突变条带，提示发生了不确定或未知的突变；1株rpoB基因在未缺失所有野生条带的基础上出现了1个突变条带MUT1，提示异质性耐药突变模式；见表1。54株复治MTB中，异烟肼耐药katG、inhA基因突变40株，表示同时对异烟肼耐药，即耐多药率为74.1%（40/54）。40株耐多药菌株中，katG基因S315T1位点发生突变30株（75%），提示异烟肼高水平耐药；inhA基因C15T位点发生突变8株（20%），提示异烟肼低水平耐药。2株katG基因突变菌株显示野生条带缺失但没有突变条带出现，提示有未知突变未被检测到。

表1 复治MTB rpoB基因突变情况

3 讨论

MTB耐药主要是由基因靶点或其启动子的特异耐药决定区域或抗结核化疗药物的激活酶由于核苷酸取代、插入或删除而引起的突变造成的［3］。利福平是一种关键的抗结核药物，对MTB具有快速杀菌作用，被纳入结核病的短期治疗方案，可用于初治及复治结核病患者的治疗。研究显示，95%以上利福平耐药是由rpoB基因突变引起的，常见于rpoB基因81 bp核心区域（RRDR），常见突变是密码子531、526和516处氨基酸的改变［4］。泰国一项研究显示其利福平耐药菌株rpoB基因突变位点主要是Leu533Arg和Leu538Arg，而Val550Leu和Ser509Arg是中国研究发现的两个新的利福平耐药菌株rpoB基因突变位点，这提示MTB rpoB基因的单核苷酸具有多样性［5-6］。本研究结果显示，利福平耐药菌株rpoB基因以S531L位点突变为主，与之前的相关研究结果一致［7］。当MTB对利福平产生耐药性时，大多数患者也会发生异烟肼耐药。研究显示，利福平耐药的结核病患者中有77.7%同时对异烟肼耐药［8］。本研究结果显示，复治RR-TB患者的耐多药率为74.1%，与上述研究结果基本一致。

异烟肼耐药的机制比利福平更加复杂，katG基因突变会导致其编码的过氧化氢—过氧化物酶活性降低或丧失，从而阻止异烟肼转换成活性形式，导致药物失去作用，产生耐药。另一方面，inhA基因突变可以造成异烟肼与NADH的亲和力下降，而inhA启动子区域突变会上调inhA基因表达，使得inhA蛋白过度表达；两种突变导致MTB对异烟肼活性形式所需的浓度升高，最终因活性形式的异烟肼浓度不足而避免了对MTB的干扰，抑制了其抗菌效果［9］。检测编码过氧化氢酶的katG基因可以确定MTB对异烟肼的高水平耐药，而检测编码NADH烯酰酸性磷酸酶还原酶的inhA基因启动子区可以确定MTB对异烟肼的低水平耐药。本研究结果显示，导致复治RR-TB患者异烟肼耐药的最常见突变是katG中的S315T位点发生突变（75%），与复治RR-TB患者高水平耐药有关。了解katG和inhA基因突变的基本情况，可以指导临床大夫更加合理用药。对于仅发生inhA突变的患者来说，可以用高剂量异烟肼来进行治疗，而当仅存在katG突变时，乙硫酰胺可能是一种更合适的治疗方案［10］。

在很长一段时间内，临床认为结核病是由于感染单一MTB而发生的，该病复发是由于患者免疫低下或缺陷导致体内菌株再激活的结果。随着分子生物学技术的发展，基因分型方法在研究MTB的遗传特性方面发挥了巨大的作用。基因分型研究结果显示，不同来源MTB的外源性再感染也是结核病复发的原因，先前的感染不一定能能对之后的感染起保护作用［11］。因此，复治RR-TB可能是由于最近感染了新的菌株，也可能是由于体内菌株发展后再复燃引起的。研究复治RR-TB患者的发病原因，对于制定有效的防治措施具有重要的意义，如果是由内源性复燃引起的，那么应该重点对患者进行规范化治疗和管理；如果是由其他菌株传播导致的外源性再感染，那么及时发现传染源，切断传播途径是必要的防控手段［12］。本研究使用15 位点MIRU-VNTR基因分型实验对54对复治RR-TB配对菌株进行分析，结果显示77.8%的患者是由内源性复燃引起的，22.2%是因为传播导致的外源性再感染。考虑目前复治RR-TB患者治愈率低，非有效治疗的情况比较严重，因此提倡复治RR-TB患者住院隔离治疗，可有效管理患者并督导其规律服药，提高其治愈率的同时可以有效控制传染源。

MTB有很多不同的菌型，北京基因型是存在最广泛的。MTB RD105基因总长3 467 bp，包含Rv0072、Rv0073所有基因缺失及Rv0071、Rv0074部分基因缺失［13］。RD105基因缺失是北京基因型所特有的，在非北京基因型中并不常见。因此，RD105基因缺失可以作为鉴定北京基因型菌株的分子标志。本研究对复治RR-TB患者的临床分离株进行鉴定，所有菌株为北京基因型。北京基因型具有独特的特性，可以摆脱卡介苗疫苗的保护作用，从而进行有效传播，这是其分布广泛的重要原因［14-15］。研究认为，北京基因型菌株更容易发展成耐多药菌株［16］。但也有研究表明，北京基因型菌株并不比非北京基因型菌株更容易耐药，其与耐药的关联并不是因为突变增加或获得耐药的风险增加，而是由于耐药的北京基因型菌株的传播［17］。北京基因型菌株容易适应当地宿主，导致该基因型在不同地区的系统发育多样性。因此，北京基因型菌株与耐药的关联可能只是反映了当地结核病的流行，而不是北京基因型菌株的固有特性。本研究结果显示，北京地区复治RR-TB患者菌株成簇率为11.1%，低于全国5个地区的结核病平均近期传播水平［18］。

综上所述，北京地区复治RR-TB患者发病原因主要是内源性复燃，主要流行菌株为北京基因型，呈现出较高的遗传多样性，成簇率较低，MTB耐多药基因突变位点多为rpoB基因S531L及katG基因S315T1。分子诊断技术的发展为及早发现耐药结核病患者、发现传染源、明确传播关系奠定了基础，临床上应积极推广该技术的应用。