肝缺血再灌注对幼鼠血脑屏障通透性及脑组织细胞凋亡的影响

贾莉莉，喻文立，张涛，吕丹

1 天津市第一中心医院麻醉科，天津 300192；2 南开大学生命科学院；3 天津市第一中心医院疼痛科

肝缺血再灌注（HIR）是肝移植手术的重要病理生理过程，严重的缺血再灌注损伤可导致肝脏本身和远隔脏器受损。脑损伤是儿童肝移植术后常见并发症之一，其严重程度及继发病死率均高于成人肝移植，且合并术后神经系统并发症的患儿预后更差。本课题组前期观察了儿童肝移植围手术期的血清脑损伤标志物，结果显示儿童肝移植术中血清星形胶质源性蛋白（S100β）及神经特异性烯醇化酶（NSE）水平约为术前基线值的3倍；进一步通过贝利婴幼儿发展量表评估患儿术后2周的认知功能，结果显示其智力发展指数和运动发展指数较术前下降；这提示儿童肝移植术后存在脑损伤，并可能造成认知功能障碍。麻醉和手术可导致老年小鼠血脑屏障（BBB）通透性增加，可能与老年小鼠远期认知功能障碍有关［1］。研究显示，幼鼠HIR可导致远期空间记忆学习能力下降［2］，但其机制是否与BBB通透性有关尚未可知。2022年11月—12月，本研究观察了HIR对幼鼠BBB通透性及脑组织细胞凋亡的影响，为儿童肝移植术后脑损伤的预防提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：健康清洁级C57BL/6幼鼠24只，2周龄，性别不限，体质量6～8 g，购自解放军军事医学科学院实验动物中心，饲养于恒湿恒温、12 h/12 h昼夜交替的环境中，自由摄取食物和水。主要试剂：BBB紧密连接蛋白相关指标闭合蛋白（Claudin）、咬合蛋白（Occludin）、β-连环蛋白（β-Catenin）、紧密连接蛋白1（ZO-1）蛋白检测试剂盒均购自美国CST公司，山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 动物分组及HIR处理方法 选择24只健康清洁级C57BL/6幼鼠，术前适应性喂养3～5 d，采用随机数字表法分为假手术组、右旋糖苷组10和右旋糖苷40组，每组8只。右旋糖苷10组和右旋糖苷40组均建立HIR模型［3］：术前禁食6 h、自由饮水，采用1.5%～3%异氟烷吸入麻醉，沿腹白线开腹，采用自制拉钩暴露肝脏及肝门血管；血管夹夹闭肝脏左、中叶的肝蒂造成70%肝缺血，缺血肝叶由红色转变为暗红色表明建模成功；血流阻断成功后，湿纱布覆盖腹部切口，60 min后恢复血流，生理盐水冲洗腹腔，关腹。右旋糖苷10组、右旋糖苷40组于再灌注60 min后经下腔静脉注射相对分子量分别为10、40 kD的右旋糖苷。假手术组仅行开关腹、游离血管等操作。各组再灌注后6 h，1.5%～3%异氟烷吸入麻醉，4 ℃条件下将PBS缓冲液经心尖穿刺行血液灌流，断头获取脑组织，选择部分冰冻切片后迅速放入液氮，其余脑组织-80 ℃保存待检。

1.3 脑组织BBB通透性观察 采用免疫荧光染色。取各组-80 ℃保存的脑组织，OCT包埋剂包埋，12 μm厚度切片，-20 ℃冰箱保存。将冰冻切片在预冷的无水甲醇中固定10 min，10%山羊血清室温封闭1 h。加入一抗室温孵育2 h，37 ℃回温1 h，回收一抗，PBS洗涤5 min × 3次。加入二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗涤5 min × 3次。滴加DAPI工作液染核，室温反应10～20 min。使用荧光素钠和FITC标记的右旋糖苷为荧光示踪剂，共聚焦显微镜下观察并进行拍照，取5个高倍视野，计算右旋糖苷通过率。

1.4 脑组织Claudin、Occludin、β-Catenin、ZO-1蛋白检测 采用Western blotting法。取各组-80 ℃保存的脑组织，RIPA裂解液进行蛋白裂解，BCA试剂盒进行蛋白定量。取定量好的蛋白，10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，随后转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h。加入Claudin、Occludin、β-Catenin、ZO-1及内参GAPDH一抗（稀释比例均为1∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；第二天恢复至室温30 min，TBST洗涤10 min × 3次，记入山羊抗兔IgG二抗（稀释比例均为1∶ 5 000），室温孵育1 h，TBST洗涤10 min × 3次，加入ECL显色液曝光。采用Image J软件检测各蛋白条带灰度值，计算Claudin、Occludin、β-Catenin、ZO-1蛋白相对表达量。

1.5 脑组织细胞凋亡率检测 采用TUNEL法。取各组完整脑组织，常规脱水、石蜡包埋，制备组织切片。二甲苯及梯度浓度乙醇脱蜡，蒸馏水和PBS缓冲液各洗涤5 min × 3次。0.1% Triton X-100室温孵育8 min，通透组织，PBS洗涤5 min × 3次。滴加TUNEL染色液，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤5 min × 3次。滴加DAPI染液，细胞核着蓝色，凋亡细胞着红色，荧光显微镜下观察计数凋亡细胞，计算细胞凋亡率。

1.6 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计量资料采用S-W法检验正态性，呈正态分布以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用两独立样本t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组幼鼠脑组织右旋糖苷通过率比较 假手术组、右旋糖苷10组、右旋糖苷40组幼鼠脑组织右旋糖苷通过率分别为0% ± 3%、26% ± 5%、15% ±4%，组间两两比较P均＜0.05。

2.2 各组幼鼠脑组织Claudin、Occludin、β-Catenin、ZO-1蛋白相对表达量比较 与假手术组比较，右旋糖苷10组、右旋糖苷40组幼鼠脑组织Claudin、Occludin、β-Catenin、ZO-1蛋白相对表达量均降低（P均＜0.05），右旋糖苷10组、右旋糖苷40组上述指标比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 各组幼鼠脑组织Claudin、Occludin、β-Catenin、ZO-1蛋白相对表达量比较（± s）

表1 各组幼鼠脑组织Claudin、Occludin、β-Catenin、ZO-1蛋白相对表达量比较（± s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05。

组别假手术组右旋糖苷10组右旋糖苷40组ZO-1 0.98 ± 0.06 0.23 ± 0.03*0.24 ± 0.03*n8 8 8 Claudin 0.85 ± 0.07 0.41 ± 0.03*0.40 ± 0.03*Occludin 1.30 ± 0.11 0.50 ± 0.06*0.52 ± 0.06*β-Catenin 1.21 ± 0.12 0.64 ± 0.08*0.62 ± 0.09*

2.3 各组幼鼠脑组织细胞凋亡率比较 假手术组、右旋糖苷10组、右旋糖苷40组幼鼠脑组织细胞凋亡率分别为9% ± 4%、45% ± 5%、48% ± 5%，右旋糖苷10组、右旋糖苷40组幼鼠脑组织细胞凋亡率均高于假手术组（P均＜0.05），右旋糖苷10组、右旋糖苷40组幼鼠脑组织细胞凋亡率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

大脑的海马区主管学习和记忆，主要通过调节神经细胞兴奋性来编码并存储记忆。研究显示，神经细胞增殖和分化的“黄金时期”开始于妊娠末期6个月，并延续至出生后15岁左右；在此阶段，树突、轴突快速生长，突触大量形成，短期内形成复杂的神经网络，50%～70%的神经细胞参与了这一过程［4］。生长发育期的大脑极易受到外界不良刺激的影响，导致信息传导的神经环路出现障碍，最终造成远期认知功能损伤。肝移植患儿手术时间与神经系统生长发育期重叠，因此围手术期发生HIR、免疫抑制剂的应用等多种因素都能对发育期大脑造成不良影响，这可能是儿童肝移植术后脑损伤程度比成人更严重的根源［5-10］。

HIR是肝移植术中不可避免的病理生理过程，也是导致围手术期心、脑、肾等远隔脏器损伤的重要原因［11-12］。研究发现，麻醉和手术打击可以导致术后认知功能障碍的发生，其机制可能是BBB被破坏，导致有害物质进入脑组织，从而引起认知功能障碍［13-16］。本课题组前期研究发现，幼鼠HIR后出现了远期认知功能障碍，但是其机制尚不明了［2，16-17］。BBB是保持脑组织内环境动态平衡的重要结构，一旦被破坏，循环中产生的有害物质易穿透BBB，从而对中枢神经系统产生严重损伤。大多数的炎症因子和有害分子的分子量为10～40 kD，因此本研究选择观察小分子量（10 kD）和中分子量（40 kD）右旋糖苷穿过BBB情况，以此反映BBB破坏程度。本研究结果显示，幼鼠HIR后10、40 kD右旋糖苷均能透过BBB，说明幼鼠HIR后循环血中大多数的炎症分子和有害分子可以进入脑组织，进而导致脑损伤。

紧密连接蛋白是维持BBB完整性的重要因素，许多中枢神经系统BBB的破坏都与紧密连接蛋白表达改变有关。紧密连接蛋白由跨膜蛋白、胞质附着蛋白和细胞骨架蛋白共同组成，跨膜蛋白包括Occludin、Claudin和连接黏附分子（JAM）组成。其中，Claudin是内皮细胞紧密连接的主要蛋白，与BBB通透性的改变密切相关。本研究结果显示，与假手术组比较，右旋糖苷10组、右旋糖苷40组幼鼠脑组织Claudin、Occludin、β-Catenin、ZO-1蛋白相对表达量均降低，提示BBB遭到了破坏。为了观察BBB被破坏后脑组织是否受到了损伤，本研究检测了脑组织细胞凋亡率；结果显示，与假手术组比较，右旋糖苷10组、右旋糖苷40组幼鼠脑组织细胞凋亡率均升高，提示BBB的破坏参与了HIR后脑损伤的发生。

综上所述，HIR会导致幼鼠BBB通透性增加、脑组织细胞凋亡增多，可能与术后脑损伤的发生有关。本研究立足于临床儿童肝移植术中最重要的病理生理过程，探究影响术后认知功能障碍的原因。但由于幼鼠年龄和体质量的限制，不能完全模拟临床儿童肝移植的手术操作过程，这是本研究的主要不足之处。其次，本研究仅探索了HIR对幼鼠BBB通透性的影响，并未探索后续的具体机制，这也是未来研究的重点。