消皮素B在人主动脉夹层组织中的表达变化及对主动脉平滑肌细胞焦亡、炎症反应的影响

沈小艳，谢孝平，李博文，王志维

武汉大学人民医院心血管外科，武汉 430060

主动脉夹层是一种十分危急的主动脉疾病，在未得到及时治疗的情况下病死率极高。目前，主动脉夹层的治疗方法主要是开放手术和介入治疗，但由于手术难度大、治疗时机晚、病损区域常累及内脏动脉，手术成功率和术后存活率均较低［1］。因此，深入研究主动脉夹层发生的病理生理机制，寻找相关治疗靶点对于改善患者预后具有重要意义。细胞焦亡是新发现的一种细胞程序性死亡方式，消皮素（GSDM）蛋白家族成员可以通过介导细胞焦亡、释放炎症因子、调节炎症反应等机制，参与多种炎症疾病的发生发展［2-3］。消皮素B（GSDMB）是GSDM蛋白家族成员之一，在细胞焦亡和炎症反应中同样发挥重要作用。研究表明，GSDMB蛋白与半胱氨酸蛋白酶4（Caspase-4）结合可增强Caspase-4的活性，促进消皮素D（GSDMD）裂解为N-消皮素D（N-GSDMD），而GSDMD和N-GSDMD相关信号通路可直接参与细胞焦亡的调控，在非典型细胞焦亡过程中发挥关键作用［4］。目前，关于GSDMB在主动脉夹层组织中的表达变化，以及GSDMB沉默或过表达对人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）焦亡和炎症反应的影响鲜见报道，为此我们于2023年5月—11月进行了如下研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入标准：①经主动脉计算机断层扫描血管造影（CTA）检查提示急性斯坦福A型主动脉夹层；②拟行升主动脉置换术。排除合并遗传性胸主动脉疾病者，如马凡综合征、洛伊—迪茨综合征及先天性结缔组织发育不全综合征等。选择2017年1月—2020年12月武汉大学人民医院收治并符合上述标准的主动脉夹层患者8例，男6例、女2例，年龄（55.2 ± 6.5）岁，术中收集其主动脉夹层组织8例份。选择捐献心脏的脑死亡患者8例，主动脉CTA检查提示主动脉无病变，男6例、女2例，年龄（51.6 ± 5.8）岁，收集其主动脉组织8例份作为正常对照组织。主动脉夹层患者与捐献者性别构成比、年龄均具有可比性（P均＞0.05）。本研究已经通过武汉大学人民医院人类研究伦理委员会批准（WDRY2020-K230），患者及捐献者家属均签署知情同意书。

1.2 实验材料 细胞：HASMCs购自武汉普诺赛生命科技有限公司。主要试剂：DMEM高糖培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司，LipofectamineTM3000试剂购自美国Thermo Fisher公司，细胞焦亡相关指标（GSDMB、Caspase-4、GSDMD、N-GSDMD）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）和内参GAPDH一抗购自武汉三鹰生物技术有限公司，炎症因子白细胞介素18（IL-18）、白细胞介素1β（IL-1β）ELISA试剂盒均购自泉州乐达启博生物科技有限公司，实时荧光定量PCR试剂盒购自武汉塞维尔生物有限公司；NC-siRNA和GSDMB-siRNA均由上海生工有限公司合成，空白载体质粒和GSDMB过表达质粒均购自武汉淼灵生物有限公司。

1.3 主动脉夹层组织与正常对照组织GSDMB蛋白检测 采用Western blotting法。取主动脉夹层组织和正常对照组织，使用组织匀浆机在低温条件下进行研磨，在4 ℃条件下高速离心，分离出蛋白质上清液。将提取的蛋白与上样缓冲液按照1∶ 4的比例混合，100 ℃加热10 min使蛋白变性。将蛋白样本加载到聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上，依次进行电泳浓缩和分离，将蛋白从凝胶转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。加入5%脱脂牛奶封闭2 h，加入GSDMB及内参GAPDH一抗孵育过夜，加入使用HRP标记的二抗，孵育1 h。加入ECL化学发光剂进行显影，Image J软件分析条带灰度值，计算GSDMB蛋白相对表达量。

1.4 GSDMB基因沉默对HASMCs焦亡和炎症反应的影响观察

1.4.1 细胞培养、分组及转染 将HASMCs置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中，使用含有10%胎牛血清、1%双抗的高糖DMEM培养基进行培养。待HASMCs处于对数生长期时，分为NC-siRNA组、脂多糖（LPS）组、GSDMB-siRNA组、GSDMB-siRNA+LPS组。LPS组和GSDMB-siRNA+LPS组加入1 μg/mL LPS作用24 h，NC-siRNA组、GSDMB-siRNA组、GSDMB-siRNA+LPS组分别使用LipofectamineTM3000试剂转染NC-siRNA、GSDMB-siRNA、NC-siRNA，转染48 h后收集细胞进行后续实验。

1.4.2 细胞GSDMB、Caspase-4、GSDMD、N-GSDMD、MMP-9、MMP-2蛋白检测 采用Western blotting法。收集处理后的各组细胞，加入RIPA缓冲液裂解10 min，使用BCA试剂盒测定总蛋白浓度，加入上样缓冲液混合并高温变性。以GAPDH为内参，参照“1.3”检测并计算目的蛋白相对表达量。

1.4.3 细胞焦亡情况观察 采用流式细胞术。收集处理后的各组细胞，预冷的PBS洗涤后离心，加入Binding Buffer 100 μL 进行重悬。加入PI 5 μL，室温避光孵育20 min。加入PBS 400 μL混匀，上流式细胞仪检测细胞焦亡率。

1.4.4 细胞上清液IL-18、IL-1β检测 采用ELISA法。收集处理后的各组细胞上清，1 000 r/min离心20 min。在预先包被IL-18和IL-1β捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，温浴60 min并彻底洗涤。底物TMB温浴15 min显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下最终变为黄色。使用酶标仪检测450 nm波长下的光密度（OD）值，计算IL-18、IL-1β水平。

1.5 GSDMB基因过表达对HASMCs焦亡和炎症反应的影响观察

1.5.1 细胞培养、分组及转染 将HASMCs置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中，使用含有10%胎牛血清、1%双抗的高糖DMEM培养基进行培养。待HASMCs处于对数生长期时，分为空载质粒组、LPS作用组、GSDMB过表达组、GSDMB过表达+LPS组。LPS作用组和GSDMB过表达+LPS组加入1 μg/mL LPS作用24 h，空载质粒组、GSDMB过表达组、GSDMB过表达+LPS组分别使用LipofectamineTM3000转染试剂转染空载质粒、GSDMB过表达质粒、GSDMB过表达质粒，转染48 h后收集细胞进行后续实验。

1.5.2 细胞GSDMB、Caspase-4、GSDMD、N-GSDMD、MMP-9、MMP-2蛋白检测 参照“1.4.2”采用Western blotting法检测各目的蛋白相对表达量。

1.5.3 细胞焦亡检测 参照“1.4.3”采用流式细胞术检测细胞焦亡率。

1.5.4 细胞上清液IL-18、IL-1β检测 参照“1.4.4”采用ELISA法检测细胞上清液IL-18、IL-1β水平。

1.6 统计学方法 采用Graphpad9.0统计软件。计量资料采用S-W法检验正态性，呈正态分布以±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 主动脉夹层组织与正常对照组织GSDMB蛋白表达比较 主动脉夹层组织与正常对照组织GSDMB蛋白相对表达量分别为0.88 ± 0.16、0.62 ± 0.15，二者比较P＜0.05。

2.2 NC-siRNA组、LPS组、GSDMB-siRNA组和GSDMB-siRNA+LPS组焦亡相关指标比较 见表1。

表1 NC-siRNA组、LPS组、GSDMB-siRNA组和GSDMB-siRNA+LPS组焦亡相关指标比较（± s）

表1 NC-siRNA组、LPS组、GSDMB-siRNA组和GSDMB-siRNA+LPS组焦亡相关指标比较（± s）

注：与NC-siRNA组比较，*P＜0.05；与LPS组比较，#P＜0.05；与GSDMB-siRNA组比较，△P＜0.05。

组别NC-siRNA组LPS组GSDMB-siRNA组GSDMB-siRNA+LPS组细胞焦亡率（%）11.17 ± 1.35 63.07 ± 4.27*11.73 ± 1.73#41.27 ± 2.22*#△GSDMB 0.73 ± 0.12 1.17 ± 0.10*0.34 ± 0.05*#0.78 ± 0.10#△Caspase-4 0.59 ± 0.03 1.06 ± 0.06*0.68 ± 0.15#0.88 ± 0.03*#△GSDMD 0.59 ± 0.03 1.06 ± 0.08*0.67 ± 0.14#0.90 ± 0.02*#△N-GSDMD 0.69 ± 0.17 1.14 ± 0.14*0.75 ± 0.19#0.85 ± 0.08*#

2.3 NC-siRNA组、LPS组、GSDMB-siRNA组和GSDMB-siRNA+LPS组炎症反应相关指标比较见表2。

表2 NC-siRNA组、LPS组、GSDMB-siRNA组和GSDMB-siRNA+LPS组炎症反应相关指标比较（± s）

表2 NC-siRNA组、LPS组、GSDMB-siRNA组和GSDMB-siRNA+LPS组炎症反应相关指标比较（± s）

注：与NC-siRNA组比较，*P＜0.05；与LPS组比较，#P＜0.05；与GSDMB-siRNA组比较，△P＜0.05。

组别NC-siRNA组LPS组GSDMB-siRNA组GSDMB-siRNA+LPS组IL-1β（pg/mL）105.30 ± 8.62 285.70 ± 7.02*110.30 ± 5.51#184.00 ± 9.00*#△MMP-9 0.62 ± 0.10 1.07 ± 0.16*0.61 ± 0.10#0.78 ± 0.02#MMP-2 0.60 ± 0.04 1.02 ± 0.04*0.52 ± 0.07#0.54 ± 0.05#IL-18（pg/mL）205.70 ± 16.04 411.00 ± 12.12*213.70 ± 14.29#290.30 ± 19.30*#△

2.4 空载质粒组、LPS作用组、GSDMB过表达组和GSDMB过表达+LPS组焦亡相关指标比较 见表3。

表3 空载质粒组、LPS作用组、GSDMB过表达组和GSDMB过表达+LPS组焦亡相关指标比较（± s）

表3 空载质粒组、LPS作用组、GSDMB过表达组和GSDMB过表达+LPS组焦亡相关指标比较（± s）

注：与空载质粒组比较，*P＜0.05；与LPS作用组比较，#P＜0.05；与GSDMB过表达组比较，△P＜0.05。

组别空载质粒组LPS作用组GSDMB过表达组GSDMB过表达+LPS组细胞焦亡率（%）11.09 ± 1.27 58.94 ± 3.98*11.73 ± 1.47#76.99 ± 5.28*#△GSDMB 0.57 ± 0.03 0.71 ± 0.05*0.77 ± 0.04*0.98 ± 0.04*#△Caspase-4 0.62 ± 0.02 0.73 ± 0.04*0.64 ± 0.07#0.89 ± 0.05*#△GSDMD 0.72 ± 0.03 0.83 ± 0.01*0.70 ± 0.02#1.08 ± 0.12*#△N-GSDMD 0.50 ± 0.02 0.73 ± 0.04*0.46 ± 0.05#0.99 ± 0.02*#△

2.5 空载质粒组、LPS作用组、GSDMB过表达组和GSDMB过表达+LPS组炎症相关指标比较 见表4。

表4 空载质粒组、LPS作用组、GSDMB过表达组和GSDMB过表达+LPS组炎症反应相关指标比较（± s）

表4 空载质粒组、LPS作用组、GSDMB过表达组和GSDMB过表达+LPS组炎症反应相关指标比较（± s）

注：与空载质粒组比较，*P＜0.05；与LPS作用组比较，#P＜0.05；与GSDMB过表达组比较，△P＜0.05。

组别空载质粒组LPS作用组GSDMB过表达组GSDMB过表达+LPS组IL-1β（pg/mL）114.00 ± 7.55 271.70 ± 15.53*117.00 ± 8.00#327.30 ± 19.60*#△MMP-9 0.32 ± 0.02 0.59 ± 0.03*0.40 ± 0.16#0.86 ± 0.08*#△MMP-2 0.47 ± 0.04 0.58 ± 0.04*0.46 ± 0.04#0.94 ± 0.14*#△IL-18（pg/mL）211.70 ± 12.86 364.00 ± 16.09*209.00 ± 19.08#410.30 ± 13.05*#△

3 讨论

主动脉夹层是一种致命性大血管疾病，其发病机制非常复杂，主动脉中层退行性变是其主要病理特征，表现为血管平滑肌细胞丢失，炎症细胞浸润和细胞外基质降解等［5］。当血管平滑肌细胞受到损伤、氧化应激及炎症因子等刺激时，会激活凋亡、坏死性凋亡和焦亡等多种相关信号通路。血管平滑肌细胞焦亡是主动脉夹层的重要发病机制之一，脂联素通过靶向上调miR-133a基因而抑制细胞焦亡和表型转换，从而减轻主动脉夹层形成，其机制与抑制细胞焦亡经典信号通路NLRP3/Caspase-1/GSDMD及炎症因子释放有关［6］。GSDMD通过激活血管平滑肌细胞内质网应激C/EBP同源蛋白（CHOP）信号通路，促进鸟氨酸脱羧酶 1 （ODC1）表达及提高腐胺水平，进一步加剧平滑肌细胞炎症反应［7］。但是，GSDM家族成员GSDMB与主动脉夹层及血管平滑肌细胞的关系鲜见报道。

GSDMB是一种GSDM蛋白，是细胞焦亡的关键效应分子之一，具有调节免疫应答和炎症反应等功能［8］。GSDMB的独特之处在于其可以被特定的病原体感染，或被细胞内的应激反应所激活。一旦被激活，GSDMB能促进细胞膜破裂，导致细胞内容物泄露，包括促炎症细胞因子。因此，GSDMB异常表达或活化可能导致过度炎症反应，进而加剧疾病的严重程度［9-10］。本研究结果显示，主动脉夹层组织GSDMB蛋白相对表达量高于正常对照组织；HASMCs经LPS作用后GSDMB、Caspase-4、GSDMD、N-GSDMD蛋白相对表达量及细胞焦亡率均升高，提示成功使用LPS构建HASMCs焦亡模型；该模型转染GSDMB-siRNA后上述指标降低，转染GSDMB过表达质粒后上述指标升高，提示敲低GSDMB表达可抑制LPS诱导的HASMCs焦亡，而过表达GSDMB会加重LPS诱导的HASMCs焦亡。

研究显示，GSDMB还可以通过激活Caspase-4，释放IL-18和IL-1β等炎症因子，从而加重炎症反应［11］。本研究结果显示，HASMCs经LPS作用后MMP-9、MMP-2蛋白相对表达量及细胞上清液IL-18、IL-1β水平均升高，提示LPS可刺激HASMCs分泌炎症因子；该模型转染GSDMB-siRNA后上述指标降低，转染GSDMB过表达质粒后上述指标升高，提示敲低GSDMB表达可抑制LPS诱导的HASMCs炎症因子释放，过表达GSDMB表达可促进LPS诱导的HASMCs炎症因子释放。研究发现，炎症因子IL-18、IL-1β均能促进MMP-9、MMP-2分泌，而MMP-9、MMP-2可通过降解细胞外基质，促进主动脉壁弹性纤维破裂，从而加速主动脉夹层的形成［12-13］。研究显示，A型主动脉夹层患者血清IL-1β水平升高，可通过促进MMP-9表达，增加主动脉夹层破裂的发生风险［14］。此外，IL-1β可通过促进胸主动脉夹层小鼠组织MMP-2和MMP-9表达，改变其主动脉壁功能，在胸主动脉夹层的形成中发挥关键作用［15］。因此，我们猜想GSDMB除了参与调控细胞焦亡以外，其释放的炎症因子可能进一步影响HASMCs分泌MMP-2和MMP-9。但是本研究中GSDMB-siRNA组仅GSDMB蛋白相对表达量低于NC-siRNA组，GSDMB过表达组仅GSDMB蛋白相对表达量高于空载质粒组，其他焦亡及炎症相关指标没有明显改变，提示GSDMB沉默或过表达并不会诱导正常HASMCs发生焦亡或炎症反应。这可能与在未受到LPS作用时GSDMB的N端结构域被C端结构域抑制，无法形成孔道有关［10］。

综上所述，人主动脉夹层组织GSDMB表达升高；GSDMB不会影响正常HASMCs的焦亡和炎症反应，但会通过Caspase-4介导的非经典途径正向调控LPS诱导的HASMCs细胞焦亡和炎症反应。因此，GSDMB是调控HASMCs焦亡和炎症反应非经典途径的关键分子，为主动脉夹层的治疗提供了新靶点。