共刺激信号与心血管疾病的研究进展

都昌乐 王瑜 梅仁彪 （安徽理工大学医学院基础医学系，淮南 232001）

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）在全球发病率和病死率百余年都居高不下，是世界重要的公共卫生问题。CVD包括原发性高血压（essential hypertension，EH）、动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）、免疫性心肌炎（autoimmune myocarditis，AM）和心肌梗死（myocardial infarction，MI）等疾病。研究表明 T细胞的免疫失调会造成脂质颗粒和炎症细胞因子在血管内沉积，使血管结构异常并引起血管重塑，这是CVD发病的潜在病因［1］。共刺激信号作为T细胞活化的第二信号，在T细胞抗原受体（T cell receptor，TCR）与抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）经主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）-抗原肽相互作用提供抗原刺激后，通过 APC表面共刺激配体与T细胞表面同源受体结合参与T细胞激活并决定T细胞后面的免疫反应，若无共刺激信号T细胞会进入无能状态甚至发生凋亡［2］。共刺激信号按照功能特性可分为正、负性信号，介导正性信号的共刺激分子主要有CD28、ICOS、CD27、OX40等，介导负性信号的主要有CTLA-4、PD-1、TIM-3等。正性信号促进T细胞活化，而负性信号向激活的T细胞提供抑制信号，因此了解共刺激信号在CVD的作用或许能为治疗该疾病带来希望。

1 正性共刺激信号

1.1 CD28介导的共刺激信号 CD28为Ⅰ型跨膜糖蛋白，其胞质尾区拥有两个基序：YMNM和PYAP。CD28与其配体CD80/CD86结合后与TCR形成微簇并磷酸化基序中的酪氨酸残基，近端YMNM基序与磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）的调节亚基p85相结合启动蛋白激酶B（protein kinase B，AKT），AKT一方面激活下游靶点核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）促进T细胞活化；另一方面促使哺乳动物雷帕霉素靶点（mammalian target of rapamycin，mTOR）上调葡萄糖转运蛋白表达，增强T细胞摄取葡萄糖从而加速T细胞代谢。远端基序PYAP与淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（lymphocyte cell-specific protein-tyrosine kinase，LCK）和生长因子受体结合蛋白2（growth factor receptor bound protein 2，Grb2）结合增强T细胞核因子（nuclear factor of activated T-cells，NFAT）核易位并诱导IL-2的产生促进T细胞增殖［3-4］。最新研究表明位于CD28跨膜结构域的YxxxxT基序可在T细胞表面稳定CD28二聚体的表达，从而协助TCR信号促进CD28与配体的结合，因此CD28中3个不同的基序共同参与了共刺激信号的诱导［5］。

1.2 可诱导共刺激分子（inducible costimulator，ICOS）介导的共刺激信号 ICOS的胞质尾区同样也包含3个不同的基序，而YMFM基序的研究较为广泛。该基序在ICOS与配体ICOSL结合后，招募PI3K中调节亚基p85与T细胞表面受体酪氨酸结合使酪氨酸磷酸化，促使PI3K将催化亚基p110募集到细胞质膜并激活，随后二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol diphosphate，PIP2）被激活后的亚基p110磷酸化生成三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol trisphosphate，PIP3），PIP3可激活AKT磷酸化FOXO转录因子（可抑制生长因子生成，促进凋亡分子表达）并将其输出至细胞核外通过结合14-3-3蛋白降解失活，最终促进Tfh细胞分化和IL-2、IL-17A释放［6-7］。

1.3 CD27介导的共刺激信号 CD27为糖基化的跨膜蛋白，其天然配体为CD70。当树突状细胞（dedritic cell，DC）收到来自CD40和病原体受体的信号后会上调CD70的表达，此时CD27与配体CD70结合并招募肿瘤坏死因子受体相关因子（TNF receptor-associated factor，TRAF），TRAF能通过NF-κB途径激活CD8+T细胞，同时上调抗凋亡因子（如BCL-1和BCL-XL）和细胞因子受体（IL-21Rα和IL-ZRβ）表达，提高CD8+T细胞对细胞因子的敏感性［8］。另外该信号还能促进c-Jun N端激酶的激活（JNK），增强转录因子T-bet表达并刺激CD4+T细胞分化为能产生IFN-γ的Th1细胞，增强免疫效应［9］。

1.4 OX40介导的共刺激信号 肿瘤坏死因子受体OX40具有4个富含半胱氨酸的结构域，与其天然配体OX40L结合会形成三聚体复合物，而位于OX40胞质尾区的基序QEE招募TARF2、3、5并与NF-κB α亚基和NF-κB诱导激酶相互作用，通过调控NF-κB途径增强抗凋亡因子的表达。另外OX40信号可通过PI3K磷酸化AKT增加生存素和极光激酶B（Aurora-B）表达，这两种蛋白质可促进细胞周期蛋白依赖性激酶活性，使细胞周期G1期到S期顺利进行，维持T细胞的有丝分裂［10］。

1.5 其他正性共刺激信号 4-1BB分子能与配体结合后形成复合物并聚集于T细胞的胞质尾区，招募TRAF相关因子激活NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等多种远端信号分子，调节细胞周期蛋白和细胞周期性蛋白激酶促进细胞周期循环［11］；死亡受体3（death receptor 3，DR3）在与配体结合后其内部的死亡结构域构象会发生改变，从六螺旋束结构变为松散折叠的开放结构［12］。从而更好地与TNFR死亡结构域（TNFR-associated death domain，TRADD）的N末端相互结合，募集TRAF2-受体相互作用蛋白（receptor-interacting protein，RIP）复合物并激活MARK和NF-κB信号通路促进T细胞的增殖活化［13］。

2 负性共刺激信号

2.1 细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）介导的共刺激信号 CTLA-4具有高度内吞性，主要以二聚体的形式存在于细胞内囊泡中，因此在CD28与配体CD80/86结合后，囊泡内的CTLA-4会以胞外分泌的方式向TCR结合位点定向移动，而位于其胞质域内YVKM基序会和网格蛋白相关的衔接蛋白复合物AP-2中的m2亚基相结合将CTLA-4保留在细胞表面。同时初始化T细胞分泌溶酶体使CTLA-4表达上调并与配体CD80/86结合，而胞质尾区的YVKM基序便与含有SH2结构域的酪氨酸磷酸酶2（SH2 domain-containing tyrosine phosphatase 2，SHP2）和丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）相互作用使TCR-CD3ζ复合物去磷酸化，减弱TCR信号传递［14］。CTLA-4信号还可中断T细胞中70 KDaζ链相关蛋白（70 kD zeta-chain associated protein，ZAP-70）的形成，使细胞内钙释放机制受到影响抑制细胞周期的进展和相关因子的产生［15］。

2.2 PD-1介导的共刺激信号 程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）胞质尾区的N端与C端氨基酸残基有两个磷酸化位点，分别是免疫受体酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosinebased inhibition motif，ITIM）和免疫受体酪氨酸开关基序（immunoreceptors tyrosine-based switch motif，ITSM），而PD-1的抑制功能主要依赖于ITSM［16］。PD-1信号激活后会磷酸化T细胞内酪氨酸并将SHP2募集到其C末端的ITSM中，结合SHP2的ITSM基序去磷酸化CD3ζ和ZAP-70并使其失活，导致PI3K-AKT信号传导受到抑制，TCR相关的下游信号如RAS-MEK-细胞外信号调节酶途径也因此减弱，从而下调抗凋亡因子BCL-XL的表达促进T淋巴细胞的凋亡［17］。同时PD-1增强碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白（basic leucine zipper transcription factor ATF-like，BATF）表达，BATF能与Jun蛋白结合形成BATF/Jun异二聚体，抑制转录因子信号，负性调控AP-1介导的免疫反应，抑制T细胞功能［18］。

2.3 T细胞免疫球蛋白3（T cell immunoglobulin-3，TIM3）介导的共刺激信号 TIM3的胞外域由膜远端N末端免疫球蛋白结构域组成，但TIM-3的胞质尾区没有ITIM和ITSM基序。因此在与对应配体结合后，TIM-3的两个酪氨酸残基Y256和Y263会被磷酸化致使转录因子Bat3从TIM3胞质尾区释放并与含有SH2结构域的Src激酶（如Fyn蛋白）结合并募集到TIM3上，Fyn蛋白能够激活鞘糖脂微结构域相关磷酸化蛋白（phosphoprotein associated with glycosphingolipid microdomains，PAG）的关键激酶，抑制LCK活性使TCR信号受阻［19］。

2.4 B和T淋巴细胞衰减因子（B and T lymphocyte attenuator，BTLA）介导的共刺激信号 BTLA的胞质尾区拥有Grb2识别基序YDND、ITIM和ITSM 3个保守基序，其中ITIM基序在BTLA结合配体后能够激活酪氨酸磷酸酶SHP1和SHP2，使酪氨酸脱磷酸化从而抑制PI3K信号途径，阻碍T细胞活化；另外BTLA被激活后还能募集蛋白酪氨酸激酶Sky使其磷酸化从而弱化B细胞接头蛋白表达，减弱BCR信号强度抑制B细胞增殖和细胞因子的释放［20］。近期研究发现YDND基序可通过结合Grb2蛋白与PI3K亚基p85相互作用来增强PI3K信号，促进T细胞存活，这说明BTLA可能具有双向信号调节作用［21］。

2.5 其他负性共刺激信号 淋巴细胞激活基因3（lymphocyte activation gene-3，Lag-3）胞质尾区的KIEELE基序能抑制TCR诱导的钙通量，使T细胞功能受损，但目前并未发现与该基序结合的相关蛋白，故其下游信号通路尚不清楚［22］。T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域（T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT）介导的负性信号主要抑制NK细胞功能，TIGIT中ITT样基序与Grb2蛋白结合募集SHP1，抑制PI3K和MAPK信号通路。另外ITT样基序还能进一步与β抑制蛋白2结合诱导SHP-1破坏TRAF6自然泛素化与NF-κB活化，使NK细胞无法发挥免疫效应［23］。见图1。

图1 主要正负性共刺激信号传导机制图Fig.1 Mechanism of main positive and negative co-stimulation signal transduction

3 正负性共刺激信号与心血管疾病

3.1 正负性共刺激信号与EH EH是一种多因素疾病，虽然发病机制复杂，但免疫细胞介导的先天免疫和适应性免疫在EH的发展中起到关键作用，共刺激信号能通过调节T细胞功能参与EH的病理过程。TORAL等［24］通过将原发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）的粪便微生物群移植到维斯塔尔大鼠（Wistar-Kyoto，WKY）中发现，CD28信号受阻会抑制WKY大鼠体内T细胞表面激活物整合素α4（integrin alpha 4，ITGA4）和趋化因子受体CCR9的mRNA转录水平，导致T细胞无法活化。同时该大鼠主动脉瓣的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶活性也会减弱，血管内皮舒张功能改善缓解EH症状。钱小宝等［25］也发现在SHR大鼠的肾脏损伤机制中ICOS信号表达与炎症因子IL-17A、TGF-β分泌呈正相关，这说明ICOS信号可能通过介导Th17细胞在EH中发挥重要作用。CD27信号能促进效应记忆性T细胞在野生型高血压小鼠肾脏周围浸润并释放IFN-γ使近端小管上皮细胞产生血管紧张素原，增加肾小管对钠的重吸收［26］。同时该信号还刺激血管产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），引起血管功能障碍使血压升高。

相反，负性共刺激信号可遏制EH症状的继续发展。PD-1负性信号能够增强Treg细胞稳定性并促进Treg细胞分化，研究发现高血压患者体内的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞逐渐下降，而PD-1信号可以增强Foxp3 mRNA的表达并促进Treg细胞分泌抗炎因子IL-10，改善动脉舒张功能、减少局部炎症并抑制NADPH氧化酶活性从而降低血压［27-28］。此外在王亿平等［29］研究中也发现参地颗粒可增强肾炎大鼠体内CTLA-4信号，抑制炎症因子对肾脏的进一步损害，从而防止高血压的发生。另外在最近一项关于森林浴的健康报告中，冬季森林浴可通过提高TIM-3信号表达来调节免疫平衡机制，从而缓解因针对冬季常见病原体的免疫防御而做出的适应性应答，使血压降低［30］。

3.2 正负性共刺激信号与AS AS是一种血管壁慢性炎症疾病，主要特征是炎症反应和脂质代谢失衡［31］。研究表明OX40信号可在TRAF2的介导下激活NF-κB通路释放ROS，刺激淋巴细胞产生细胞周期蛋白A（cell growth and Cyclophilin A，CyPA）并使血管平滑肌细胞迁移引起血管重塑形成AS斑块；阻断OX40信号可抑制T细胞分泌IL-5，造成OXLDL特异性IgM抗体减少并诱导ldlr-/-小鼠AS退化［32］。4-1BB也可作用于T细胞并促使CD8+T细胞在AS早期血管内膜浸润并长期滞留血管中，其产生IFN-γ而引发慢性炎症［33］。CD27信号在AS中则起抑制作用，这主要因为CD27信号能提高巨噬细胞代谢功能，加强巨噬细胞摄取胆固醇的能力，此外CD27信号还能促进促炎症LY6Chi单核细胞凋亡来减轻AS症状［34］。对于ICOS信号，GOTSMAN等［35］发现在给ICOS缺陷型小鼠高胆固醇喂食数周后，该小鼠体内平滑肌蛋白和胶原蛋白沉积，CD4+T细胞增殖并分泌大量炎症因子引发炎症反应。ZHONG等［36］在体外实验也证实ICOS信号能减少人主动脉平滑肌细胞吞噬作用，具有抗AS效应。但CLEMENT等［37］发现CD8+Treg细胞可调控Tfh细胞释放炎症因子，而在载脂蛋白E缺乏（Apoe-/-）小鼠体内CD8+Treg功能受损会导致AS进一步恶化，阻断ICOS信号能恢复CD8+Treg细胞对Tfh-GC-B细胞轴的控制，使AS发展减缓。这表明ICOS信号在AS中或许具有双向调控功能。

负性信号在AS中同样发挥重要作用，研究表明在高胆固醇血症CTLA-4转基因小鼠体内CTLA-4信号能够降低T细胞增殖能力，抑制促炎因子释放，预防主动脉部粥样硬化；阻断CTLA4信号会使细胞间黏附因子1（cell adhesion factor-1，ICAM-1）过表达，使得免疫细胞向血管炎症部位募集加速AS斑块形成［38］。PD-1信号与TIM-3信号具有联动作用，QIU等［39］在AS患者血液中发现PD-1与TIM3能在CD8+T细胞共同表达，而呈现双阳性的CD8+T细胞能分泌更多的抗AS细胞因子如IL-10等，并且PD-1与TIM3信号受阻会进一步提升促炎症Th1细胞免疫反应在AS的主导地位。此外TIM3信号还能抑制NF-κB通路减少血小板衍生因子诱导的IL-6和TNF-α的释放［40］。BTLA负性信号也具有抗AS效应，DOUNA等［41］发现刺激ldlr-/-小鼠中BTLA信号能减缓AS早期的发展，这也许是BTLA信号加速了小鼠血液中滤泡B2细胞的凋亡，同时脾脏B细胞群体会富集大量抗AS的边缘区B细胞和调节性B细胞释放IL-10。综上所述，正负共刺激信号在AS中作用复杂，因此需要更多的研究来确定刺激或抑制共刺激信号在AS中的联合疗法。

3.3 正负性共刺激信号与AM AM是诱发心力衰竭的重要因素，该疾病的特征是炎症细胞浸润到心肌中致使心脏部分功能受损［42］。国外学者利用实验性自身免疫性心肌炎（experimental autoimmune myocarditis，EAM）模型研究人类免疫性心肌炎的过程中发现，与正常大鼠相比EAM大鼠脾脏与心脏中ICOS/ICOSL分子表达增强，阻断ICOS信号后一方面能遏制炎症细胞浸润心肌组织；另一方面还会抑制T细胞活化，其分泌的相关炎症因子IFN-γ、TNFα等也相应减少。而且在免疫应答阶段ICOS信号受阻可减缓EAM的发展，但在抗原引发阶段阻断ICOS信号不会产生此效果，说明ICOS信号可能会引起免疫失衡从而促进AM发展［43］。类似作用还包括4-1BB信号，该信号能够同时激活MAPK和 NFκB信号通路分别促进NF-κB和AP-1蛋白介导的转录，其转录的基因能促进Th1型细胞增殖分化及炎症的发生［44］。

负性信号能够阻滞AM病理过程中心肌细胞损伤。例如PD-1信号可防止心脏抗原反应性CD4+T细胞扩增造成的炎症，而纤维蛋白原样蛋白2（fibrinogen-like protein 2，Fgl-2）过表达会中断PD-1信号并在转录水平上影响Th17细胞分化促进IL-17的分泌，破坏Treg细胞免疫抑制功能导致心肌功能恶化［45］。最新研究也显示配体PD-L2缺乏会加速心肌肌球蛋白肽诱导的心肌炎症并促进CD4+T细胞增殖，这说明PD-1信号在限制心脏T细胞反应中起重要作用［46］。同样对Th17细胞产生抑制效应的还包括CTLA-4信号。采用抗CTLA-4抗体治疗野生型小鼠会诱发严重的AM，其心脏遭到大量CD3+T细胞浸润，而大部分细胞均呈IL-17阳性，用中和性抗IL-17抗体处理CD28-/-小鼠可显著减缓EAM发展，这表示CTLA-4信号可控制Th17细胞应答调节CD28-/-小鼠对EAM的敏感性［47］。正负性共刺激信号对免疫性心肌炎的调控可能通过Th细胞的应答机制而发挥作用。

3.4 正负性共刺激信号与MI及心脏重塑 冠状动脉闭塞是引起MI的主要因素，脂质动脉粥样硬化斑块破裂会形成血栓造成心肌区域缺血并导致心肌细胞坏死，随后引发炎症和心脏重塑机制［48］。共刺激信号通过与免疫细胞的相互作用在MI及心脏重塑中发挥不同的功能。KUBOTA等［49］将小鼠左冠状动脉永久结扎并将其CD28基因敲除发现与对照组小鼠相比，CD28-/-小鼠MI后心肌破裂概率增加，并且该小鼠左心室收缩功能降低，体内α-SMA阳性肌成纤维细胞减少，MMP-9和IL-1β的mRNA表达显著增加，说明CD28信号丢失后会导致心室重塑并造成心脏破裂。但最近研究显示用E18mAb阻断CD28信号会减少心脏梗死区单核细胞/巨噬细胞以及心肌中T细胞的浸润，并且增加精氨酸酶活性促进胶原合成加快心肌愈合［50］。因此关于CD28信号在MI中具体作用还需进一步实验证实。CD27信号在MI中起到抗炎作用，因为该信号受阻后不仅会诱导心肌细胞凋亡，还会募集中性粒细胞和巨噬细胞对心肌组织的浸润并抑制Treg功能，使炎症加剧［51］。另外阻断CD27信号会进一步抑制血管和细胞外基质的生成，导致MI病理过程加重并引发随后的心脏重塑。

PD-1信号、CTLA-4信号和Lag-3信号等负性信号均在MI中起到保护抑制作用。在一项关于高密度脂蛋白与心血管疾病相关的评估中指出，有高脂蛋白血症的患者其血浆Lag-3蛋白质表达水平低会增加MI的风险，可能是因为缺乏Lag-3信号会减少脂筏形成与磷酸信号传导导致炎症因子异常分泌，引起免疫失衡，这也是MI患者的特征之一［52］。GANG等［53］在研究急性MI患者的外周血时，发现患者血液中IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B等炎症因子异常增高，进一步研究推测CD4+T细胞分泌的IL-9下调了CTLA-4信号导致CD8+T细胞的细胞毒性增强从而加速MI进程。而在对MI患者进行冠状动脉再灌注治疗中发现PD-1信号在治疗前几小时内升高，之后急剧下降，CTLA-4则在整个过程维持低水平，qRT-PCR结果显示大面积梗死患者PD-1与CTLA-4的mRNA表达显著低于梗死面积小的患者［54］，由此推断这两个负性信号在MI患者梗死面积和免疫调节中具有潜在保护作用。

4 总结与展望

目前全球CVD患者的数量不断增加，但关于该疾病的疗法仍旧是世界难题。共刺激信号作为人体维持免疫稳态的重要调节机制，已经成为调节免疫系统产生促炎或抗炎的靶位。大量实验数据也表明共刺激分子可以作为生物标志物并在CVD的发病机制中发挥重要作用，阻断正性共刺激信号可能会缓解CVD的进展，相反刺激正性信号或抑制负性信号会引起免疫过激反应恶化CVD病理过程。因此研究新型正性共刺激信号阻滞剂可能是未来治疗CVD的新靶点。但正性信号的阻断也会引起人体免疫功能减弱容易遭受病菌感染，由此而引发的免疫相关的副作用也为这种免疫治疗带来巨大的挑战。所以还需持续关注共刺激分子家族的信号传导以及该信号如何介导特定的分子与细胞免疫成分来影响心血管相关疾病，为治疗此类疾病提供新的思路与依据。