白细胞介素-12促进氧化应激参与干燥综合征肝脏病变

查洁 江婷婷 郭俊巧 肖帧 姚根宏 （.南京鼓楼医院风湿免疫科，南京 20008；2 安庆医药高等专科学校基础医学院，安庆 26052；.南京中医药大学中西医结合鼓楼临床医学院，南京 20008；.南京大学金陵学院化学与生命科学学院，南京 20089）

原发性干燥综合征（primary Sjögren's syndrome，pSS）是一种慢性自身免疫性疾病，以唾液腺和泪腺功能障碍和破坏为特征，还可累及其他重要器官，如肝脏、肾脏和肺等，出现复杂的临床表现［1-2］。肝脏是pSS常见的非外分泌腺作用靶点，患者可表现为乏力、黄疸、恶心、纳差、呕吐、皮肤瘙痒、肝区不适、腹胀和肝功能异常等症状［3］。不同患者肝损伤程度不一，有些症状轻微受重视程度不足而延误治疗，有些则较为严重甚至危及生命［4］。因此，pSS肝脏损伤不容忽视，明确pSS肝损伤发病机制、早期诊断、及时治疗对于改善pSS预后有重要意义。但是，目前对pSS患者肝脏受累的发病机制尚不清楚。

研究表明白细胞介素等细胞因子在pSS发病中发挥重要作用。白细胞介素-12（IL-12）主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生，在T细胞介导的炎症反应中起着关键作用［5］。IL-12通过引起淋巴亚群的紊乱、多种细胞因子表达失衡，与多数自身免疫病的发生密切相关，在一些常见自身免疫性疾病的发生中发挥重要致炎作用，如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、克罗恩病、pSS等［6-7］。既往研究表明，外源性注射重组小鼠IL-12加重小鼠pSS症状，注射抗IL-12抗体可以减轻小鼠pSS症状［8-9］。但是，IL-12是否参与pSS的肝脏病变及其机制尚不清楚。有大量研究发现，氧化应激发生在多种自身免疫性疾病中，比如类风湿关节炎、系统性硬化症、pSS等，伴随着活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，促进了病情进展［10-11］。pSS患者唾液腺、泪腺功能损伤的原因，均可能涉及氧化应激，而IL-12具有调节氧化应激的功能。因此，本研究旨在明确IL-12是否通过促进氧化应激参与pSS肝脏病变的发生，从而探讨pSS肝损害的发生机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雌性C57BL/6小鼠、雌性NOD小鼠购自南京大学模式动物研究所。IL-12KO NOD小鼠为南京大学模式动物研究所繁配。所有小鼠均饲养在南京医科大学鼓楼临床医学院动物中心SPF级环境中。实验于南京医科大学鼓楼临床医学院进行。本实验获得南京医科大学鼓楼临床医学院动物保护伦理委员会的批准(实验伦理号:20191021)。

1.1.2 试剂及材料 小鼠肝癌细胞系Hepa1-6及DMEM培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）；Mouse IL-12 ELISA试剂盒（杭州联科生物有限公司）；Recombinant Murine IL-12p70（美国Peprotech公司）；Cell Counting Kit-8（广州赛库生物）；JAK2 和TYK2抑制剂（MCE公司）；过氧化氢酶（CAT）、还原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠唾液流率检测 小鼠麻醉后，腹腔注射100 μl毛果芸香碱（0.1 mg/kg体质量），收集小鼠分泌15 min的唾液，计算唾液流率。

1.2.2 小鼠颌下腺和肝脏病理 取小鼠颌下腺及肝脏组织，4%多聚甲醛固定，进行脱水、石蜡包埋和切片，再经过脱蜡、复水、苏木精染色和伊红染色、脱水、封片，显微镜下观察并拍照。

1.2.3 小鼠肝功能检测 分离小鼠血清，按GOT、GPT检测试剂盒说明书进行。具体步骤如下：加入基质液、待测样本，37 ℃反应30 min后，加入2-4二硝基苯肼，37 ℃反应20 min后，加入终止液。酶标仪读取各样本510 nm处的吸光度值，并通过标准曲线计算各样本数值。

1.2.4 ELISA测定血清和肝脏中IL-12水平 采用ELISA法检测小鼠血清和肝脏组织中IL-12水平。检测方法严格按IL-12试剂盒说明书操作。

1.2.5 小鼠肝癌细胞培养和处理 小鼠肝癌细胞（Hepa1-6细胞）采用含有1 mmol/L丙酮酸钠、10%FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基在37 ℃5%CO2饱和湿度下培养，待细胞生长至90%左右，采用0.25%胰酶-EDTA消化细胞，接种至24孔板，并加入不同浓度重组小鼠IL-12（终浓度为0、2.5、5、10、20、40 ng/ml）和JAK2、TYK2抑制剂。24 h后留取培养上清，待测各种氧化应激指标。

1.2.6 CCK-8检测细胞增殖 将Hepa1-6细胞按照100 μl/孔接种至96孔培养板，分别加入不同浓度（0、2.5、5、10、20、40 ng/ml）的重组小鼠IL-12，培养24 h后，每孔加入10 μl CCK-8试剂，将培养板继续置于培养箱中孵育4 h，用酶标仪在450 nm处测定吸光度。

1.2.7 血清、肝脏匀浆和培养上清中氧化应激指标检测 检测小鼠血清、肝脏组织匀浆和细胞培养上清中SOD、CAT、GSH、GSH-PX和MDA 5项氧化应激指标，具体检测方法按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 8对实验数据进行分析并作图，多组数据间比较进行单因素方差分析，两组间进行t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠IL-12、颌下腺和肝脏病变情况比较 小鼠血清和肝脏匀浆中IL-12检测结果显示，与B6小鼠相比，同周龄pSS小鼠（NOD小鼠）血清和肝脏匀浆中IL-12水平明显升高［B6vsNOD，血清（29.93±1.81） pg/mlvs（77.31±11.19） pg/ml；肝脏匀浆（181.2±12.67） pg/mlvs（256.90±36.53） pg/ml］，差异有统计学意义（P＜0.05，图1A、B）。比较小鼠的唾液流率、GPT和GOT，结果发现，与B6组小鼠相比，NOD小鼠唾液流率明显下降；IL-12基因敲除NOD（IL-12KO NOD）小鼠唾液流率较野生型NOD小鼠唾液流率明显增加（图1C）。与B6和IL-12KO NOD小鼠相比，NOD小鼠的GPT明显增加（图1D）。NOD小鼠的GOT明显高于B6小鼠（P＜0.05），较IL-12KO NOD小鼠也有增加的趋势（图1E）。颌下腺和肝脏病理结果显示，B6小鼠颌下腺和肝脏中无淋巴细胞浸润，NOD小鼠的颌下腺和肝脏中可见明显的淋巴细胞浸润，而IL-12KO NOD小鼠的颌下腺和肝脏中浸润的淋巴细胞很少（图1F、G）。

图1 各组小鼠IL-12、肝功能、颌下腺及肝脏病变情况比较Fig.1 Comparison of IL-12， liver function， submandibular glands and liver lesions in mice of each group

2.2 各组小鼠血清中氧化应激指标比较 小鼠血清中氧化应激指标检测结果显示，与B6小鼠相比，NOD小鼠CAT、GSH-PX、SOD活力明显降低［CAT（65.19±19.37） U/mlvs（7.99±3.89） U/ml；GSH-PX（283.60±5.42） U/mlvs（215.50±22.42） U/ml；SOD （25.71±1.76） U/mlvs（20.89±0.78） U/ml，P＜0.05］，见图2；IL-12KO NOD小鼠血清GSH-PX较野生型NOD小鼠明显增多（图2A），IL-12KO NOD小鼠血清CAT和SOD较野生型NOD小鼠有增加的趋势（图2B、C），但差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 各组小鼠血清中氧化应激指标比较Fig.2 Comparison of oxidative stress indexes in serum of mice of each group

2.3 IL-12对小鼠肝细胞增殖及氧化应激的影响应用不同浓度的重组小鼠IL-12处理小鼠肝癌细胞系，结果表明2.5、5和10 ng/ml IL-12明显促进Hepa1-6细胞增殖，20 ng/ml和40 ng/ml IL-12组的促增殖效应较10 ng/ml IL-12组下降（图3A）。因此，选择2.5、5和10 ng/ml IL-12处理Hepa1-6细胞，检测培养上清中氧化应激指标。研究结果显示，不同浓度IL-12处理后，CAT、GSH、GSH-PX和SOD有下降趋势。与对照组相比，10 ng/ml IL-12处理组培养上清中CAT、GSH、GSH-PX和SOD下降，差异均有统计学意义（P＜0.05，图3B～E）。而5 ng/ml和10 ng/ml IL-12处理组MDA显著高于对照组（图3F）。

图3 IL-12作用下小鼠肝细胞增殖及氧化应激情况Fig.3 Effects of IL-12 on proliferation and oxidative stress in hepatocytes of mice

2.4 IL-12通路抑制剂对IL-12处理肝细胞氧化应激的影响 在IL-12处理Hepa1-6细胞培养液中加入IL-12通路抑制剂（JAK2和TYK2特异性抑制剂），作用24 h后检测培养上清中氧化应激指标。结果发现，JAK2和TYK2抑制剂能部分逆转IL-12对Hepa1-6细胞CAT和GSH-PX的降低作用，但差异无统计学意义（图4A、B）。IL-12对Hepa1-6细胞SOD抑制效应能被JAK2抑制剂显著逆转（P＜0.05，图4C）。IL-12对Hepa1-6细胞GSH的抑制作用则只能被TYK2抑制剂逆转（P＜0.05，图4D）。与IL-12处理组相比，JAK2和TYK2抑制剂能显著降低培养上清中MDA水平（P＜0.05，图4E）。

图4 IL-12抑制剂对肝细胞氧化应激的影响Fig.4 Effects of IL-12 inhibitors on oxidative stress in hepatocytes

3 讨论

pSS是一种常见的结缔组织病，以外分泌腺被淋巴细胞浸润，导致口干和眼干为主要特征的慢性自身免疫病。pSS可累及多种内脏器官，比如肺和肝脏等。研究报道，约10%pSS患者在病程中出现肝功能异常［12-14］。pSS的肝脏病变机制不明确，有研究认为自身反应性免疫先引起肝脏细胞损伤，然后造成肌成纤维细胞扩增和肝星状细胞活化，并最终加速胶原和糖蛋白在肝脏沉积，形成肝纤维化。但是，pSS中引起肝脏细胞损伤的自身免疫因素尚不清楚。因此，本研究旨在探索引起pSS肝脏病变的具体分子和可能机制。

NOD小鼠是公认的研究pSS的小鼠模型，本结果显示NOD小鼠血清肝功能指标异常，这与JIANG等［15］的研究结果一致。另外，本课题组发现小鼠肝脏中有淋巴细胞浸润，说明肝脏细胞受到了炎症损伤。既往研究表明，致炎症细胞因子IL-12会加重NOD小鼠pSS症状［8］。但是，IL-12是否与pSS肝脏损伤相关尚不清楚。本研究检测了NOD小鼠血清和肝脏中IL-12水平，结果发现NOD小鼠中IL-12水平明显升高。进一步研究发现，与野生型NOD小鼠相比，IL-12基因敲除NOD小鼠的唾液流率明显增加，颌下腺中炎症细胞浸润数量和浸润面积也相应减少。以往的研究发现IL-12转基因小鼠唾液流率降低，唾液腺中淋巴细胞浸润灶的数量、大小均增加，抗SSB/La抗体滴度增加，提示IL-12促进了pSS病情的进展［16-18］。这与本研究结论一致。另外，本研究发现IL-12基因敲除NOD小鼠肝功能指标，GPT和GOT也较野生型NOD小鼠改善，肝脏中浸润的淋巴细胞也明显减少。以上结果提示IL-12可能加重NOD小鼠pSS及其肝脏病变。

研究发现多种自身免疫性疾病中存在氧化应激状态，在pSS中，血清或局部ROS和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）增加，抗氧化酶表达降低，唾液腺、颌下腺、泪腺的损伤均与氧化应激有关［19-21］。本研究结果也验证了以上研究结果，即pSS小鼠血清中GSH-PX、CAT和SOD降低。为了探索IL-12是否通过调节氧化应激参与pSS肝脏病变，课题组检测了IL-12基因敲除NOD小鼠血清中氧化应激指标，结果发现，与野生型NOD小鼠相比，GSHPX、CAT和SOD的水平有所增加。以上结果提示，IL-12可能通过调节氧化应激参与pSS。为了明确IL-12通过调节pSS肝脏病变的直接证据，本研究应用IL-12处理肝脏细胞，结果发现IL-12使肝脏细胞的CAT、GSH、GSH-PX和SOD下降，而使肝脏细胞中MDA增加，以上结果提示IL-12会促进氧化应激状态，从而参与pSS肝脏病变。

综上所述，IL-12可加重pSS及其肝脏病变，而氧化应激指标是IL-12发挥作用的分子。以上结论有望为临床pSS肝损伤患者的诊断提供新生物学标志物和治疗新策略。