同位素稀释-液相色谱-串联质谱法测定4类水产品中甲霜灵的残留量

张 俊,黄冬梅,黄宣运,史永富,王 媛,田良良

(1.上海海洋大学 食品学院,上海 201306;2.中国水产科学研究院东海水产研究所,农业农村部水产品质量安全控制重点实验室(上海),上海 200090)

甲霜灵常作为一种在农田中使用的杀菌剂,主要用于治疗黄瓜、番茄、马铃薯等作物的霜霉病、黑胚病以及晚疫病[1-2]等,已被使用40余年[3],甲霜灵的残留问题及其危害性也日益凸显。国外研究表明,甲霜灵对于暴露于其中的人淋巴细胞具有基因毒性[4]。因此,在国家标准GB 2763—2021[5]中规定了洋葱、花生仁、糙米和葡萄等农产品及其加工制品中甲霜灵的最大残留限量,为0.05～5.0 mg·kg-1。但是甲霜灵在水产上的相关研究不多,其在2017年才被批准为新型渔用药物,获得新兽药证书,在水产养殖中主要是作为孔雀石绿的替代药物,用于治疗养殖鱼类的水霉病,但未有相关水产品的残留限量规定。因此,亟需建立相应的甲霜灵检测方法对水产品的质量安全进行监测,同时为制定水产品中残留限量提供方法依据。

目前甲霜灵残留量的检测方法包括酶联免疫吸附法(ELISA)[6-7]、高效液相色谱法(HPLC)[8]、气相色谱法(GC)[9-10]和气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[11-13]等,但是这些方法的检测基质多为果蔬类等农产品,很少针对水产品。水产品具有高脂高蛋白的特点,与基质成分较为简单的果蔬类差别较大,二者检测方法之间不具有通用性。文献[14]开发了基于单克隆抗体的胶体金试纸条,用于测定水产品草鱼、凡纳滨对虾等中的甲霜灵含量,但方法的检出限较高,为2 mg·kg-1,无法满足高灵敏定量检测的要求。液相色谱-串联质谱法具有灵敏度高、检出限低等特点,作为阳性样品复检的指定检测方法之一,对于快速检测方法初筛结果不确定的样品可做到精准的定性定量检测。本工作提出了液相色谱-串联质谱法测定多种水产品中甲霜灵的残留量,针对水产品复杂基质,可兼顾净化效果的同时缩短前处理时间,实用性强。另外,采用甲霜灵-d6作为内标可提高结果准确度,该方法能够实现大批量水产品中甲霜灵残留的痕量检测。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

DIONEX UltiMate 3000 RS Pump-UHPLC Focused型超高效液相色谱仪;TSQ Quantum Access型三重四极杆串联质谱仪,配有电喷雾离子(ESI)源;Genius 3型旋涡混合器;16RⅫ型高速冷冻离心机;VisiprepTM DL固相萃取装置;N-EVAPTM 112型氮吹浓缩仪;Milli-Q型超纯水机;Agela Cleanert S C18固相萃取柱(6 mL,500 mg);0.22 μm针式水相尼龙滤膜。

单标准储备溶液:100 mg·L-1,分别准确称取甲霜灵、甲霜灵-d6标准品,用乙腈溶解并定容,配制成质量浓度为100 mg·L-1的单标准储备溶液,于-18 ℃冰箱冷冻避光保存。临用前分别用乙腈稀释,配制成质量浓度为1.0 mg·L-1的甲霜灵、甲霜灵-d6标准溶液,于4 ℃冰箱避光保存。

甲霜灵、甲霜灵-d6标准品的纯度不小于98%;乙腈、正己烷为色谱纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

SHISEIDO CAPCELL PAK C18色谱柱(100 mm×2.0 mm,3.0 μm);流动相A为0.1%(体积分数,下同)甲酸溶液,B为乙腈;流量 0.3 mL·min-1;进样量 10 μL;柱温 40 ℃。梯度洗脱程序:0～1.50 min时,B为10%;1.50 ～4.00 min时,B由10%升至90%,保持2.50 min;6.50～6.67 min时,B由90%跳转至100%,保持1.33 min;8.00～8.17 min时,B由100%跳转至10%,保持1.83 min。

1.2.2 质谱条件

ESI源,正离子(ESI+)扫描方式;选择反应监测(SRM)扫描模式;离子喷射电压 4 500 V;扫描时间 50 ms;离子传输管温度 320 ℃;鞘气流量 6.7 L·min-1,辅助气流量 3.3 L·min-1。其他质谱参数见表1。其中,“*”代表定量离子。

表1 质谱参数

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

试验所用鲫鱼、罗氏沼虾、中华绒螯蟹、河蚌采自上海,均参照GB/T 30891—2014[15]制备样品,于-20 ℃冷冻保存。

1.3.2 样品提取

准确称取(5±0.05)g样品,加入10 ng的内标甲霜灵-d6,静置10 min,加入10 mL含1%(体积分数,下同)乙酸的乙腈溶液,以转速2 500 r·min-1涡旋混合5 min,于4 ℃以10 000 r·min-1高速离心10 min,取上清液于20 mL刻度玻璃管中,于45 ℃氮吹浓缩至0.5 mL以下。向玻璃管中加入7.5 mL 20%(体积分数,下同)乙腈溶液,混匀。以转速2 500 r·min-1涡旋1 min,转移至50 mL塑料离心管中,待净化。

1.3.3 样品净化与浓缩

加入7.5 mL正己烷,以转速2 500 r·min-1涡旋混合1 min,于4 ℃以10 000 r·min-1高速离心10 min后用胶头滴管吸去上层正己烷,下层液体过Agela Cleanert S C18固相萃取柱(预先依次用3 mL乙腈活化,3 mL水淋洗)进一步净化。用5 mL的水淋洗并抽干,用4 mL乙腈以1滴·s-1的流量洗脱。洗脱液于45 ℃氮吹至干,用1 mL 20%乙腈溶液复溶,混匀后过0.22 μm针式水相尼龙滤膜,滤液收集至进样小瓶中,按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

5 μg·L-1甲霜灵标准溶液及其10.0 μg·L-1内标溶液的选择离子色谱图见图1。

图1 选择离子色谱图

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱

甲霜灵具有一个芳香环的稳定结构,表现出一定的非极性特征。试验选择了一款针对芳香型化合物的Kinetex F5色谱柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm),以及一款通用型SHISEIDO CAPCELL PAK C18色谱柱(100 mm×2.0 mm,3.0 μm)进行比较。结果发现甲霜灵在两款色谱柱中均能够出峰,峰形良好且半峰宽均在0.25 min左右。为统一比较,后续优化试验均使用SHISEIDO CAPCELL PAK C18色谱柱进行色谱分离。

2.2.2 流动相

乙腈和甲醇是比较常见的流动相,因此试验将其作为流动相有机相。为了提高化合物离子化效率、改善峰形,通常在流动相水相中添加少量的挥发性酸,因此选择水以及0.1%甲酸溶液分别作为流动相水相。试验分别比较了水-甲醇、0.1%甲酸溶液-甲醇、0.1%甲酸溶液-乙腈作为流动相体系时对甲霜灵的分离效果,根据不同流动相条件下甲霜灵的响应值来确定最佳流动相。

结果表明,甲霜灵在3种不同流动相中均能够被洗脱且分离良好、峰形尖锐,但其在各流动相中的响应值不尽相同。如图2所示:当使用0.1%甲酸溶液作为水相时,其提供的氢离子使0.1%甲酸溶液-甲醇体系和0.1%甲酸溶液-乙腈体系中的甲霜灵离子化效率提高;当使用乙腈作为有机相时,0.1%甲酸溶液-乙腈体系的色谱峰峰形较好且响应值较高。因此,试验选择0.1%甲酸溶液-乙腈体系作为甲霜灵的流动相。

图2 不同流动相的分离效果

2.3 质谱条件的优化

将质量浓度为500 μg·L-1的甲霜灵和甲霜灵-d6的标准溶液通过蠕动泵分别注入质谱仪,确定母离子为m/z280.0和286.1,再通过二级质谱扫描,选择稳定且丰度高的碎片离子作为定量离子,离子丰度次之者作为定性离子,对确定的母离子、子离子进行碰撞能量等参数的优化,具体质谱参数见表1。

2.4 样品前处理方法的优化

2.4.1 提取剂

根据甲霜灵的化学性质,甲霜灵能溶于乙腈、水、甲醇等试剂,同时参考已有的文献[6,11]中方法,试验初步尝试以0.1%(体积分数,下同)磷酸溶液、20%乙腈溶液、乙腈、甲醇、含1%(体积分数,下同)氨水的乙腈溶液(记作1%氨化乙腈)、含1%乙酸的乙腈溶液作为提取剂。使用峰面积的相对响应比值来比较不同提取剂对甲霜灵的提取效果(以含1%乙酸的乙腈溶液作为提取剂时甲霜灵响应值为100%计,其他试剂提取时的响应值与其比较)。

由于过固相萃取柱需要水溶液上样,因此试验首先尝试使用水相占比较高的溶液作为提取剂。试验发现:当使用0.1%磷酸溶液提取时,鱼、虾、蟹3种基质中均有大量水溶性蛋白杂质被提取出来,易堵塞固相萃取柱,进而导致试验无法进行;使用20%乙腈溶液提取时,鱼基质提取液澄清,而虾、蟹类基质的提取液仍旧浑浊,难以过柱。因此考虑采用有机试剂(甲醇、乙腈、1%氨化乙腈和含1%乙酸的乙腈溶液)提取,以减少水溶性杂质的溶出。不同提取剂的提取效果见图3。

图3 不同提取剂的提取效果

结果表明:使用甲醇提取样品时,发现上机检测的色谱图存在杂峰干扰;使用乙腈和1%氨化乙腈提取时发现存在基质干扰,目标物色谱峰的响应值低;而以含1%乙酸的乙腈溶液作为提取剂时,由于酸的存在沉淀了其他提取剂未能沉淀的部分蛋白,降低了基质的干扰,且氮吹时间短、目标物色谱峰前后无明显杂峰、回收率高。综合考虑,试验选择含1%乙酸的乙腈溶液作为提取剂。

2.4.2 溶解试剂

试验采用含1%乙酸的乙腈溶液提取后,提取液中仍存在部分脂类、色素杂质以及少量蛋白。提取液浓缩后需要用合适的溶解试剂,在将目标物充分溶解出来的同时,尽量不溶解杂质,否则这些杂质的存在会使复溶后的溶液呈浑浊或黏稠状态。试验利用甲霜灵与杂质在溶液中溶解度不同的特性,比较了水和20%乙腈溶液作为溶解试剂时的效果差异。水对甲霜灵具有一定的溶解度,而脂类等杂质则基本不溶于水,可根据此特性复溶甲霜灵。但是结果发现,由于水无法将包裹在杂质中的少量甲霜灵溶解出来,回收率略低,比20%乙腈溶液的低25%左右,且回收率不稳定。而20%乙腈溶液保证了多数甲霜灵的溶解,降低了目标物的损失,且结果稳定。此外,该步骤还可将溶液状态由纯有机相改为了水相占比较多的状态,满足了其后过柱的需求。因此,试验选择20%乙腈溶液为溶解试剂。

2.4.3 正己烷体积

与植物源性基质不同,水产品基质样品含有丰富的蛋白和脂类物质,这是造成基质干扰的主要原因。提取剂在提取目标物的同时,必定有一部分脂类及蛋白质等其他物质被同时提取出来,导致样品测定时出现较多干扰,影响测定结果,因此须对样品提取液进行净化处理。正己烷是水产品药物残留检测中常用的除脂试剂。试验首先采用3 mL正己烷净化,过柱氮吹后,鱼和虾类样品的试管底部均无油脂残留。由于蟹(性腺和肝胰腺)和贝类(肝胰腺)的可食部位中油脂含量过高,经3 mL正己烷净化后仍有油脂残留。因此,试验将正己烷体积增大至7.5 mL,结果发现,使用7.5 mL正己烷时,蟹和贝类样品在氮吹后试管中油脂量相对较少。因此,试验选择正己烷体积为7.5 mL。

2.4.4 固相萃取柱

仅用正己烷净化,在上机后仍有明显的杂质干扰目标物检测,因此采用固相萃取法进一步净化除杂,对固相萃取柱的类型进行优化。通过在正己烷去脂后的空白基质液中加入标准溶液过已活化的固相萃取柱来考察效果,对比了不同固相萃取柱Oasis HLB、Oasis PRiME HLB、Anavo HLB-P以及Agela Cleanert S C18的净化效果以及对甲霜灵峰面积的影响,结果见表2。

表2 不同固相萃取柱的净化效果

Oasis PRiME HLB、Anavo HLB-P是一类新型的固相萃取柱,无需进行柱活化和柱平衡步骤,操作简便。但经二者净化后,上机检测时杂质峰较多且甲霜灵响应值低,分别为5.24×105和5.58×105,说明这两种固相萃取柱对样品组分有吸附作用,除杂能力较弱。Oasis HLB和Agela Cleanert S C18固相萃取柱使用前需要经过活化和平衡,二者净化原理类似且均采用水溶液上样,水淋洗,乙腈洗脱。上机检测结果显示:经Oasis HLB固相萃取柱净化后的甲霜灵响应值较低,且过柱时间也较长;而Agela Cleanert S C18固相萃取柱富集净化效果更好、速率较快、溶液澄清,甲霜灵色谱峰响应值高。因此,试验选择Agela Cleanert S C18固相萃取柱进行净化。

2.5 基质效应

在加入内标后,通过乙腈纯溶剂和基质溶液制作的标准曲线斜率之比,对化合物的基质效应状况进行评价。其计算公式[16]如下:基质效应=(1-空白基质标准曲线斜率/纯溶剂标准曲线斜率)×100%,一般基质效应在-15%～15%内说明基质效应不显著[17]。结果显示,鲫鱼、罗氏沼虾、中华绒螯蟹、河蚌等4种水产品基质效应分别为-1.55%,-5.18%,-7.15%,-10.24%,均在-15%～15%内,说明基质效应影响不显著,通过乙腈制作标准曲线即可。

2.6 标准曲线、检出限和测定下限

取适量的单标准溶液,用乙腈逐级稀释,配制成甲霜灵质量浓度为1.0,5.0,10.0,20.0,50.0,100.0 μg·L-1的标准溶液系列,内标甲霜灵-d6的质量浓度为10 μg·L-1。按照仪器工作条件测定,以甲霜灵的质量浓度为横坐标,甲霜灵与甲霜灵-d6的峰面积之比为纵坐标,绘制标准曲线。结果显示,甲霜灵标准曲线的线性范围为1.0～100.0 μg·L-1,线性回归方程为y=2.258×10-2x+1.352×10-2,相关系数为0.997 7。

空白样品经处理后,测试其信噪比(S/N),分别确定检出限和测定下限。以3倍信噪比得到目标物的检出限(3S/N),结果为0.5 μg·kg-1;以10倍信噪比得到目标物的测定下限(10S/N),结果为1 μg·kg-1。

2.7 精密度和回收试验

分别以鲫鱼、罗氏沼虾、中华绒螯蟹、河蚌空白样品5.0 g为研究对象,进行3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平做6个平行样,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表3。

表3 精密度和回收试验结果(n=6)

由表3可知,甲霜灵的回收率为93.8%～105%,RSD均小于13%,其回收率和精密度均可满足对水产品中甲霜灵的检测要求。

2.8 样品分析

按照试验方法对从本实验室常规检测留存的不同批次样品中随机抽取鲫鱼、罗氏沼虾、中华绒螯蟹、河蚌等24个样品及农贸市场购买的6个鲫鱼样品进行检测,均未检出目标物。

本工作通过对水产品中甲霜灵的样品前处理方法和仪器工作条件进行研究,优化了不同提取剂、净化方式、固相萃取条件以及色谱条件,提出了同位素稀释-液相色谱-串联质谱法测定多种水产品中甲霜灵残留量的方法。该方法操作简便、实用性强,可同时在鱼、虾、蟹、贝4类高脂肪、高蛋白的复杂基质中实现对甲霜灵残留的定量检测。同位素内标的加入也有效校正了前处理过程损失所带来的偏差,提高了方法的准确度及稳定性,可实现大批量样品的快速测定。