高效液相色谱法同时测定饲料中阿散酸、硝苯胂酸、洛克沙胂和卡巴胂的含量

李 倩,王向军,张 丹

(郑州海关技术中心,郑州 450003)

胂是砷化氢分子中的氢原子部分或全部被羟基取代而成的衍生物。有机胂类饲料添加剂可以刺激畜禽动物生长,改善畜禽肉质,且具有广谱的抗菌性[1-7]。有机胂类药物虽然比无机砷毒性小很多,但由于不合理的使用,在畜禽产品中的蓄积作用会间接对人类健康造成影响[8-12]。

随着分析技术的提高,发展了部分有机胂形态分析的方法[13-17],但在净化富集技术、灵敏度和分离度上仍有问题,国内外报道的文献中也鲜有饲料中多种有机胂形态的液相色谱检测方法。目前现有的标准中,国家标准GB/T 22146—2008《饲料中洛克沙胂的测定 高效液相色谱法》采用高效液相色谱法测定饲料中洛克沙胂,但该标准只能检测洛克沙胂;采用SN/T 2316—2019 《出口动物源食品中阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷残留量的检测方法》方法分析时易被无机砷干扰,且针对的是动物源食品基质。本工作采用高效液相色谱法同时测定饲料中阿散酸、硝苯胂酸、洛克沙胂、卡巴胂等4种有机胂的含量,适用性广,具有良好的稳定性。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200型高效液相色谱仪,配有四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器(DAD);XP 205型电子天平(精确度0.01 mg);PL-J60型超声波清洗器;Sigma 3-30KS型离心机;LabTech EV341型旋蒸仪;24孔固相萃取仪;Millipore Q型超纯水仪;混合型阴离子交换MAX柱(60 mg/3 mL)。

阿散酸标准溶液:100 mg·L-1。

硝苯胂酸标准溶液:100 mg·L-1。

洛克沙胂标准溶液:100 mg·L-1。

卡巴胂标准储备溶液:100 mg·L-1,称取10.0 mg卡巴胂标准品(纯度99.3%),用水溶解并定容至100 mL的容量瓶中,配制成质量浓度为100 mg·L-1的卡巴胂标准储备溶液。

混合标准溶液:10 mg·L-1,分别移取1 mL上述阿散酸、硝苯胂酸、洛克沙胂标准溶液和卡巴胂标准储备溶液于10 mL容量瓶中,用水定容,配制成质量浓度为10 mg·L-1的混合标准溶液。

混合标准溶液系列:移取适量的混合标准溶液,用水逐级稀释,配制成质量浓度为0.05,0.1,0.2,0.5,1 mg·L-1的混合标准溶液系列。

磷酸二氢钾、甲酸为优级纯;甲醇为色谱纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流量 1 mL·min-1;柱温 25 ℃;检测波长 260 nm;进样量 20 μL;流动相A为甲醇,B为含0.1%(体积分数,下同)甲酸的20 mmol·L-1磷酸二氢钾溶液,体积比为7…93,等度洗脱。

1.3 试验方法

称取1 g饲料于离心管中,加入10 mL 30%(体积分数,下同)甲醇溶液,振荡5 min,于40 ℃超声提取30 min,以转速6 000 r·min-1离心5 min,取上清液。重复提取一次,合并上清液,用旋转蒸发仪浓缩至3～4 mL,过混合型阴离子交换MAX柱,用5%(体积分数,下同)氨水溶液淋洗,3 mL含7%(体积分数,下同)甲酸的甲醇溶液洗脱,于40 ℃氮吹至干,用1 mL 30%甲醇溶液溶解,过0.45 μm滤膜,滤液按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

试验比较了Agilent Poroshell 120 EC-C18(250 mm×4.6 mm,4 μm)、Agilent Zorbax SB-Aq(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)3种色谱柱对4种有机胂的分离效果,结果见图1。

图1 色谱柱对4种有机胂分离的影响

结果表明:Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱在分离时,峰存在拖尾,且阿散酸、卡巴胂出现双峰甚至三峰现象;Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱能够较好分离阿散酸和卡巴胂,但洛克沙胂和硝苯胂酸分离度不够;而Agilent Zorbax SB-C18色谱柱能够完全分离4种有机胂。因此,试验选择Agilent Zorbax SB-C18色谱柱进行分离。

2.2 流动相体积比的选择

试验比较了流动相体系中甲醇与含0.1%甲酸的20 mmol·L-1磷酸二氢钾溶液的体积比分别为15…85,10…90,7…93时对4种有机胂的分离效果,结果见图2。

图2 流动相体积比对4种有机胂分离的影响

由图2可知:当甲醇与含0.1%甲酸的20 mmol·L-1磷酸二氢钾溶液的体积比为15…85时,阿散酸和卡巴胂的色谱峰不能完全分开;当甲醇与含0.1%甲酸的20 mmol·L-1磷酸二氢钾溶液的体积比为10…90时,在20 min内4种有机胂色谱峰能出完,且能完全分离,但存在一定的基质干扰;当甲醇与含0.1%甲酸的20 mmol·L-1磷酸二氢钾溶液的体积比为7…93时,4种有机胂色谱峰能完全分离且基质干扰较小。因此,试验以体积比为7…93的甲醇-含0.1%甲酸的20 mmol·L-1磷酸二氢钾溶液的混合液为流动相。

2.3 净化柱的选择

根据有机胂的性质,采用阴离子固相萃取柱作为净化柱。采用饲料空白提取液进行加标回收试验,对比强阴离子交换SAX柱(100 mg/3 mL)、弱阴离子交换PWAX柱(60 mg/3 mL)、混合型阴离子交换MAX柱(60 mg/3 mL)和混合型阴离子交换PXA柱(60 mg/3 mL)等4种阴离子柱的净化效果,4种有机胂的回收率结果见图3。

图3 阴离子固相萃取柱对4种有机胂回收率的影响

结果表明,混合型阴离子交换MAX柱对4种有机胂的回收效果最好。试验将样品溶液过MAX柱,用5%氨水溶液淋洗,3 mL含7%甲酸的甲醇溶液洗脱,4种有机胂均取得良好的回收率,净化效果好。

2.4 工作曲线和检出限

从0.05,0.1,0.2,0.5,1 mg·L-1的混合标准溶液系列中各取1.0 mL, 分别加至空白样品中, 经提取、浓缩后,残余物用1 mL 30%甲醇溶液溶解,过0.45 μm滤膜, 上机测定。 以目标物的质量浓度为横坐标,对应的色谱峰面积为纵坐标绘制工作曲线。4种有机胂工作曲线的线性范围为0.05～1 mg·L-1,线性回归方程和相关系数见表1。

表1 线性参数和检出限

在空白样品中分别添加0.01,0.02,0.03,0.04 mg·kg-1等4个浓度水平的4种有机胂,按照试验方法进行测定,计算信噪比(S/N)。以3倍信噪比确定检出限(3S/N),结果见表1。

2.5 精密度和回收试验

平行称取6份鸡饲料,向鸡饲料样品中加入0.1,0.2,0.5 mg·kg-1等3个浓度水平的4种有机胂进行加标回收试验,每个浓度水平做6次平行试验,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n=6)

本工作采用高效液相色谱法同时测定阿散酸、硝苯胂酸、洛克沙胂、卡巴胂等4种有机胂的含量。方法检测效率高,前处理简便,适用性高。