反相液相色谱-二极管阵列法测定消毒产品中苯扎氯铵3种同系物的含量

陈松辉,钱 辉,李兴根,汶海花,朱 磊,王爱霞

(泰州市产品质量监督检验院,国家精细化学品质量检验检测中心,泰州 225300)

苯扎氯铵(BAC)是一种由脂肪烷基取代的二甲基苄基氯化铵混合物,主要有3种氯化铵同系物,分别为十二烷基二甲基苄基氯化铵(DDBAC)、十四烷基二甲基苄基氯化铵(TDBAC)、十六烷基二甲基苄基氯化铵(HDBAC)[1]。BAC属阳离子表面活性剂,为非氧化性杀菌剂,具有广谱、高效的杀菌灭藻能力,同时还具有一定的分散、渗透作用,被广泛应用于消毒、医药、防腐、防虫、纺织印染、工业水处理等领域。目前市售的复合季铵盐类消毒产品,多采用BAC作为有效成分,但是有些产品中还会添加其他类型的复合成分。

2019年新冠病毒疫情爆发以来,BAC等消毒产品的需求不断攀升。检测发现许多消毒产品中BAC质量分数在0.1%左右或以下,按照《消毒技术规范(2002年版)》[2]等检测时,需要取样500 mL左右(相当于BAC 0.5 g),平行测定则至少需要1 000 mL的样品,取样量巨大。其次,《消毒技术规范(2002年版)》中没有明确BAC的具体组成和比例,只是用了一个平均相对分子质量BAC(洁尔灭,C22H40ClN)来表示两种或几种混合物,同时滴定法也无法区别这几种同系物。通过检测发现,在不同厂家的产品中,BAC的几种同系物比例是有差别的,都统一用平均相对分子质量表示有时会产生比较大的误差,而液相色谱法可以分别定性定量同系物,并且取样量少,适合实验室修正滴定分析产生的误差。此外,液相色谱仪也比GB/T 26369-2020《季铵盐类消毒剂卫生要求》[3]中的毛细管电泳仪的应用更普遍。

目前,测定BAC的方法有滴定法[2,4]、紫外分光光度法[5]、离子色谱法[6]、毛细管电泳法[3,7]、气相色谱-质谱法[8]、液相色谱法[9-16]、液相色谱-质谱法[17]、纳升电喷雾-质谱法[18]等。我国已有极性色谱柱-液相色谱法检测化妆品(GB/T 30931-2014)[12]、正向色谱柱-液相色谱法检测化妆品(《化妆品安全技术规范(2015年版)》)[11]和牙膏产品(QB/T 5452-2019)[13]、毛细管电泳法测定消毒产品(GB/T 26369-2020)[3]中BAC的标准方法,但是针对BAC作为有效成分的消毒产品的检测的反相液相色谱标准化方法尚未发现。消毒产品中BAC含量范围较宽(质量分数从100%到0.1%,甚至0.1%以下的都有),且存在其他阳离子表面活性剂的干扰。目前,反相液相色谱法测定BAC的报道[9-10]已有不少。但是方法中绝大部分都是直接使用了1%(体积分数)三乙胺溶液作为扫尾剂,浓度水平相对较大,会在色谱柱中残留,检测过BAC的色谱柱一般不宜再检测其他样品,同时也会在样品检测过程中发现鬼峰。

本工作在上述文献报道基础上,通过方法优化,采用反相液相色谱-二极管阵列法测定消毒产品中BAC 3种同系物的含量,解决了扫尾剂三乙胺对色谱柱的可能损害、标准品与样品中出现鬼峰的问题。方法前处理简便快捷,准确度高,线性范围宽,精密度、稳定性好,适用于测定消毒产品中BAC同系物的含量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200型液相色谱仪,配二极管阵列检测器(DAD);S120H型超声波提取仪;CP225D型电子天平;0.45 μm聚砜醚水相滤膜和0.45 μm聚丙烯有机滤膜。

单标准储备溶液:2 g·L-1,准确称取DDBAC、TDBAC、HDBAC对照品各0.02 g(精确至0.000 1 g),用水溶解并转移至不同的10 mL容量瓶中,用水定容,摇匀,配制成质量浓度为2 g·L-1的单标准储备溶液,于4 ℃密封避光保存。

混合标准溶液系列:移取上述单标准储备溶液适量,混匀,用水逐级稀释,配制成质量浓度为5,10,20,100,500 mg·L-1的混合标准溶液系列,现用现配。

含0.1%(体积分数,下同)三乙胺的0.5 g·L-1乙酸铵缓冲溶液(pH 5.0):称取0.5 g乙酸铵,溶解于200 mL水中,加入1 mL三乙胺,转移至1 000 mL容量瓶中,定容,用冰乙酸调节酸度为pH 5.0,过0.45 μm聚砜醚水相滤膜。

DDBAC、TDBAC、HDBAC对照品的纯度均不小于98%;乙腈为色谱纯;三乙胺、冰乙酸、乙酸铵均为分析纯;试验用水为超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm)。

1.2 仪器工作条件

Agilent XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温 40 ℃;流动相为体积比70…30的乙腈-含0.1%三乙胺的0.5 g·L-1乙酸铵缓冲溶液(pH 5.0),流量 1.0 mL·min-1,等度洗脱;DAD检测波长 262 nm;进样量 20 μL。

1.3 试验方法

准确称取消毒产品1 g(精确至0.000 1 g),用水稀释,并定容至10 mL容量瓶中,摇匀,超声提取5 min后,静置,过0.45 μm聚砜醚水相滤膜后,按照仪器工作条件进行测定。由于消毒产品中BAC的含量范围较宽,从常量到微量均涉及,本方法取样量按照微量进行操作,常量的可以减小取样量,也可以进行稀释处理后上机测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

在优化的仪器工作条件下,混合标准溶液的色谱图见图1。

2.2 提取条件的选择

由于BAC属于阳离子表面活性剂,易溶于水,选用水、70%(体积分数)乙腈溶液、乙腈、甲醇作为提取剂,结果发现,上述溶剂的提取效果都较好,几乎没有影响。对于液体消毒产品直接用水作为提取剂即可,也可超声5 min;对于固体或者膏状物,一般超声提取5 min即可,再延长时间,提取效果变化不大。因此,试验选择以水为提取剂,超声提取5 min。

2.3 色谱柱和检测波长的选择

试验比较了Waters BEH C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Agilent XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)和普通国产江苏绿盟科学仪器有限公司C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)的分离效果。结果发现,上述色谱柱分离效果都比较理想,证明此方法可以适合不同的C18反相色谱柱,具有普遍适用性。试验采用Agilent XDB-C18色谱柱进行后续分析。

BAC的3种同系物在波长210,262 nm处有较大紫外吸收,如图2所示。以210 nm为检测波长,可降低检出限,但许多化合物在210 nm都有紫外吸收,会增加底物干扰的不确定性。而消毒产品中BAC的质量浓度都大于10 mg·L-1,因此针对BAC的消毒产品而言,不需要更低的检出限,以262 nm为检测波长就能够完全满足检测需求,且可以避免许多底物的干扰。

图2 BAC的DAD光谱图

2.4 流动相的选择

2.4.1 扫尾剂三乙胺的体积分数

由于BAC的组成、结构与C18色谱柱填料相似,因此需要在流动相中添加扫尾剂,否则BAC几乎不出峰。在0.5 g·L-1乙酸铵溶液中加入不同量的三乙胺,并用冰乙酸调节酸度为pH 5.0。使得三乙胺的体积分数分别为0.05%,0.08%,0.1%,0.2%,0.5%,1%,以乙腈与上述溶液的体积比为70:30的混合液作为流动相,考察了扫尾剂三乙胺的体积分数对色谱分离的影响,部分典型色谱图见图3。

图3 三乙胺体积分数对色谱分离的影响

结果表明:随着三乙胺体积分数的增大,BAC的3种同系物的半峰宽都减小;当三乙胺的体积分数为0.1%时,3种同系物的半峰宽达到平衡;继续增大三乙胺的体积分数,对3种同系物半峰宽的影响不大,且会有三乙胺残留在色谱柱中,导致出现鬼峰和色谱柱性能下降。因此,试验选择扫尾剂三乙胺的体积分数为0.1%,检测完毕后,常规冲洗即可复原,减少了色谱柱的损耗,降低了检测成本。

2.4.2 离子对试剂乙酸铵的质量浓度

固定流动相其他条件不变,试验考察了在离子对试剂乙酸铵的质量浓度分别为0.1,0.3,0.5,0.8,1.5,5.0 g·L-1的流动相条件下色谱分离的效果,部分典型色谱图见图4。

图4 乙酸铵质量浓度对色谱分离的影响

结果表明:随着乙酸铵质量浓度的增大,BAC的3种同系物的半峰宽都减小;当乙酸铵的质量浓度为0.5 g·L-1时,3种同系物的半峰宽达到平衡;继续增大乙酸铵的质量浓度,对3种同系物的半峰宽的影响不大,同样乙酸铵还会残留在色谱柱中,导致出现鬼峰和检测完毕后色谱柱的冲洗时间的加长。因此,试验选择离子对试剂乙酸铵的质量浓度为0.5 g·L-1。

2.4.3 酸度

固定流动相其他条件不变,试验考察了含0.1%三乙胺的0.5 g·L-1乙酸铵缓冲溶液酸度(pH分别为7.0,6.0,5.0,4.5)对色谱分离的影响,部分典型色谱图见图5。

图5 酸度对色谱分离的影响

结果表明:当pH减小时,BAC的3种同系物的保留时间都缩短,半峰宽也都减小;当pH为7.0,6.0时,3种同系物半峰宽都较宽,且pH为7.0时,最后一种组分的保留时间大于30 min;当pH为5.0,4.5时,3种同系物都能明显分离,且在20 min内出峰,其半峰宽较小。考虑到pH减小后,会对色谱柱填料不利,试验最终选取含0.1%三乙胺的0.5 g·L-1乙酸铵缓冲溶液酸度为pH 5.0。

2.4.4 流动相体积比

试验考察了乙腈与含0.1%三乙胺的0.5 g·L-1乙酸铵缓冲溶液(pH 5.0)的体积比分别为50…50,60…40,65…35,70…30,80…20,90…10时对色谱分离的影响。结果表明:当乙腈的比例增大时,BAC的3种同系物的保留时间先缩短后延长,同样半峰宽也是先减小后增大;在体积比为70…30时,色谱分离效果最优。因此,试验选择乙腈与含0.1%三乙胺的0.5 g·L-1乙酸铵缓冲溶液(pH 5.0)的体积比为70…30。

2.5 柱温的选择

在上述选定的仪器工作条件下,试验考察了柱温(25,30,40 ℃)对色谱分离的影响。结果表明,随着柱温的升高,BAC的3种同系物的半峰宽、峰高都无明显变化,但是出峰时间稍微前移。因此,试验选择的柱温为40 ℃。

2.6 标准曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列,以BAC的3种同系物的质量浓度为横坐标,对应的色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明,BAC的3种同系物标准曲线的线性范围均为10～500 mg·L-1,线性回归方程和相关系数见表1。

表1 线性参数、检出限和测定下限

以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),以10倍信噪比计算测定下限(10S/N),结果见表1。

2.7 精密度和回收试验

在BAC消毒液、复方消毒剂和消毒膏中分别进行5,20,100 mg·kg-1等3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平测定8次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n=8)

由表2可知,BAC的3种同系物的回收率为98.8%～105%,测定值的RSD均小于2.0%。说明该方法对消毒产品中BAC的3种同系物均有较好的回收率及重复性,能满足实际样品的分析要求。

2.8 样品分析

按照试验方法对本单位日常委托的样品进行检测,发现BAC的含量从常量到微量都有涉及,结果见表3。

表3 样品分析结果

本工作提出了反相液相色谱-二极管阵列法测定消毒产品中BAC 3种同系物含量的方法。该方法取样量少,操作简便、快速,准确,稳定性好,通过方法优化,扫尾剂三乙胺的体积分数从1%降低到0.1%,大大缩短了分析后对色谱柱的冲洗时间,避免了扫尾剂三乙胺对色谱柱的可能损害,解决了标准品及样品中出现鬼峰的问题,减少了色谱柱的损耗,降低了检验室的成本,适用于检验检测机构针对消毒产品中BAC的大批量定性分析和定量检测,适宜标准化推广,建立相应的检测标准方法。