高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法测定富硒大豆中硒代氨基酸的含量

卢 鑫,张 琳,王铁良,周晓华

(1. 济源职业技术学院 医学护理学院,济源 459000;2. 河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,郑州 450002)

1817年人们发现硒元素后,硒一直被作为一种有毒有害的元素进行研究,直到1957年SCHWARZK等研究发现硒具有营养作用,进而改变了人们对硒的认知。作为人体必须的微量元素之一,硒具有清除自由基、拮抗重金属、调控基因表达、防癌抗癌、增强人体免疫功能等作用[1-3]。研究证明不同形态的硒对人体毒性、生物效应及防癌作用不同,硒的化学形态决定硒的可利用价值[4-6]。与无机硒比,有机硒毒性小,生物利用度高[7-8]。农作物喷洒无机硒和土壤施无机硒肥是富硒农产品生产最常见的方式。大豆是硒富集的理想载体,富硒大豆可以通过转运蛋白或磷酸盐转运蛋白的转运作用将外源无机硒吸收,进一步在植物体内代谢合成硒代半胱氨酸(SeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)和甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)等有机硒[9-11]。

目前,富硒农产品中硒元素总量测定技术比较成熟[12-17],各种形态硒的检测技术还没有统一的国家标准。近年来随着仪器联用技术的快速发展,硒形态的分析方法研究比较活跃[18-27]。高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法(HPLC-HG-AFS)、毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱法(CE-ICP-MS)、高效液相色谱-电喷雾串联质谱法(HPLC-ESI-MS/MS)、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS)等成为了研究热点。其中,HPLC-HG-AFS具有分析成本低、仪器普及率高、灵敏度好等优点,尚未见应用在分析富硒大豆中有机硒形态的报道。因此,本工作提出了HPLC-HG-AFS测定富硒大豆中硒代氨基酸SeCys、SeMet和MeSeCys含量(以硒计,下同)的方法,该方法简单、准确,结果令人满意。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

SA-50型高效液相色谱-原子荧光光谱联用仪,配100 μL进样环的自动进样器;Milli-Q Syhthesis型超纯水系统;HH-4型精密恒温液浴槽;KQ-500E型超声仪;H-2050R型高速离心机。

单标准储备溶液:1 g·L-1,称取MeSeCys、SeMet、SeCys标准品各10 mg(精确到0.01 mg),分别加入0.5 mol·L-1盐酸溶液1 mL、适量水溶解,并用水定容至10 mL,摇匀,配制成1 g·L-1单标准储备溶液,保存在0～4 ℃的冰箱中,备用。使用时用水稀释至所需质量浓度。

混合标准储备溶液:1.00 mg·L-1,分别移取适量的MeSeCys、SeMet、SeCys单标准储备溶液,用水稀释并定容,配制成1.00 mg·L-1的混合标准储备溶液。

混合标准溶液系列:取适量的混合标准储备溶液,用水逐级稀释,配制成质量浓度为5,10,20,40,60,100 μg·L-1的混合标准溶液系列,现配现用。

链霉蛋白酶:S10014-250 mg,9036-06-0,BR(规格)7 000 U·mg-1;脂肪酶:S10036-25 g,9001-62-1,BR(规格)20 000 U·mg-1;MeSeCys、SeMet标准品的纯度均为98%;SeCys标准品的纯度为99%;柠檬酸、磷酸氢二铵、碘化钾、四丁基溴化铵均为优级纯;甲醇、乙腈均为色谱纯;硼氢化钾、盐酸、氢氧化钾、硝酸、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)均为分析纯;试验用水为超纯水。

大豆样品来自济源市农业科学院科技人员种植的富硒大豆、市售富硒/普通大豆。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Agela MP-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);进样量100 μL;流量1.0 mL·min-1;蠕动泵转速60 r·min-1;柱温25 ℃;流动相 含2%(体积分数,下同)甲醇和0.5 mmol·L-1四丁基溴化铵的40 mmol·L-1磷酸氢二铵溶液(pH 7.0),等度洗脱。

1.2.2 光谱条件

负高压290 V;原子化器高度9 mm;灯电流90 mA;载气、屏蔽气为氩气,流量分别为300,500 mL·min-1。

1.3 试验方法

将富硒大豆样品粉碎,过60目(孔径0.25 mm)筛,作为待测样品。按照NY/T 1285—2007《油料种籽含油量的测定 残余法》对适量样品进行脱脂处理;总硒测定依据GB 5009.93—2017《食品安全国家标准 食品中硒的测定》进行。

称取0.1 g脱脂样品于离心管中,加入5 mL pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液,超声振荡30 min,加入链霉蛋白酶15 mg,在37 ℃恒温条件下振荡酶解5 h,以转速15 000 r·min-1离心8 min,取上清液过0.22 μm尼龙有机滤膜,滤液按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

常用的色谱柱DionexAS19无法分离SeMet和MeSeCys,对SeCys的响应值太弱;Hamilton PRP-X100阴离子色谱柱无论等度洗脱还是梯度洗脱需要时间均较长,分离SeMet重复性差、灵敏度低;而Agela MP-C18色谱柱对有机硒有较好的分离效果[16,24]。因此,选用Agela MP-C18色谱柱用于3种硒代氨基酸的同时分离检测。

试验选取柠檬酸和磷酸氢二铵溶液作为流动相,考察了其对3种硒代氨基酸的分离效果。结果表明:以柠檬酸溶液为流动相时,无论等度洗脱还是梯度洗脱,SeCys和MeSeCys均未完全实现基线分离,分离色谱图如图1(a)所示。以40 mmol·L-1磷酸氢二铵溶液为流动相时,可以实现3种硒代氨基酸的分离,但峰形不太理想。流动相中加入0.5 mmol·L-1四丁基溴化铵、2%甲醇,不仅可以改变硒代氨基酸的峰形,还可以增强检测的信号。试验还进一步优化了流动相的酸度。当流动相pH为7.0时,3种硒代氨基酸峰形明显改善,峰形更尖、峰宽更窄,对称性良好,在7 min内可以完全分离,如图1(b)所示。因此,试验选择含2%甲醇和0.5 mmol·L-1四丁基溴化铵的40 mmol·L-1磷酸氢二铵溶液(pH 7.0)为流动相。

图1 3种硒代氨基酸在不同流动相洗脱下的色谱图

2.2 前处理条件的选择

2.2.1 酶种类

试验选取总硒含量较高的富硒大豆样品(总硒量1.29 mg·kg-1)进行前处理优化,比较了链霉蛋白酶和脂肪酶对富硒大豆硒形态提取的影响。分别称取6份0.1 g脱脂样品和富硒大豆鲜样,双平行,加入水5 mL以及pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液5 mL,超声30 min后,再分别加入脂肪酶15 mg+链霉蛋白酶15 mg、链霉蛋白酶15 mg、脂肪酶15 mg,于37 ℃酶解,然后用高速离心机离心处理,脱脂样品直接过0.22 μm有机滤膜,鲜样过C18小柱后过0.22 μm有机滤膜,按照仪器工作条件进行测定。结果表明,只加脂肪酶的富硒大豆鲜样和脱脂样品都没有出现目标峰,其余组别均为SeMet的色谱峰;两种酶组合使用时,无论是富硒大豆鲜样还是脱脂样品,目标峰面积较链霉蛋白酶的几乎没有改变。因此,试验选用链霉蛋白酶酶解,使用脱脂样品进行试验,不需过C18小柱,方便简单,节省时间,降低成本。

2.2.2 酶用量

称取0.1 g脱脂后的富硒大豆样品5份,加入水5 mL以及pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液5 mL,超声振荡30 min后,分别加入链酶蛋白酶5,10,15,20,25 mg,于37 ℃酶解,然后用高速离心机离心后过0.22 μm有机滤膜,按照仪器工作条件进行测定,以SeMet的质量分数为检测指标,结果如图2所示。结果表明,加入15 mg链霉蛋白酶时提取率已经很高,再增加链霉蛋白酶量,提取到的SeMet量变化很小。考虑检测成本因素,试验选择链霉蛋白酶的用量为15 mg。

图2 酶用量对SeMet质量分数的影响

2.2.3 提取剂

称取0.1 g脱脂样品5份,分别加入水、10%(体积分数,下同)硝酸溶液、15%(体积分数,下同)盐酸溶液、pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液、20%(体积分数,下同)甲醇溶液5 mL,超声振荡30 min后,再分别加入15 mg链霉蛋白酶,于37 ℃酶解,用高速离心机离心后过0.22 μm有机滤膜,按照仪器工作条件测定。结果表明,10%硝酸溶液、15%盐酸溶液提取率较低,而20%甲醇溶液、水和pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液提取率较高,其中pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液提取率最高。这是因为硒代氨基酸以游离态和蛋白形态存在于农作物中,水可以将样品中游离硒代氨基酸提取出来,但不能提取蛋白形态的氨基酸。酸尽管可以打破蛋白中连接氨基酸间的肽键,释放氨基酸,但酸解过程需要控制条件,否则蛋白会被过度分解。Tris-HCl缓冲液可以先得到游离态和蛋白形态硒代氨基酸,然后在链霉蛋白酶作用下得到硒代氨基酸。因此,试验选用pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液作为提取剂。

2.2.4 提取条件

称取0.1 g脱脂样品,以硒代氨基酸总量为指标值,对提取剂浓度(A)、提取剂用量(B)、提取剂酸度(C)、提取时间(D)等4个因素按正交表L9(3)4进行试验,正交试验设计及结果见表1。

表1 正交试验设计及结果

结果表明:SeMet是富硒大豆中硒的主要赋存形态。由极差R可知,以3种硒代氨基酸总和为指标值,提取因素影响由大到小依次为C、A、B、D,A2B2C3D2为正交试验的最优组合。考虑提取时间过长会影响硒形态的稳定性和工作效率,试验选择提取时间为30 min。综合考虑,试验选择3种硒代氨基酸的提取条件是提取剂浓度为130 mmol·L-1,提取剂用量为5 mL,提取剂的pH为7.5,提取时间为30 min。

2.3 保留时间、标准曲线和检出限

按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列,以3种硒代氨基酸的质量浓度为横坐标,对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明:3种硒代氨基酸在5～100 μg·L-1内与其对应的峰面积呈线性关系,相关系数不小于0.999 5;3种硒代氨基酸的保留时间、线性回归方程和相关系数见表2。

表2 保留时间、线性参数和检出限

在空白样品中加入5 μg·L-1的混合标准溶液,采用逐级稀释法,以3倍基线噪声测定硒代氨基酸的检出限。当取样量为0.1 g,定容体积为5 mL时,检出限换算结果见表2。

2.4 精密度和回收试验

选取总硒含量较高的富硒大豆样品(总硒量1.29 mg·kg-1),脱脂后按照试验方法测定3种硒代氨基酸的本底值,并分别进行低、中、高3种浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定7次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表3。

表3 精密度和回收试验结果(n=7)

由表3可知,3种硒代氨基酸的回收率为85.5%～103%,测定值的RSD不大于3.0%,说明方法准确度和精密度均较高。

2.5 样品分析

在优化的仪器工作条件下,采用试验方法测定一些市售富硒大豆和普通大豆中硒代氨基酸的含量,结果见表4。

表4 样品分析结果

结果表明:富硒大豆中硒赋存形态为SeMet,含量(以硒计)占总硒量比率在85.5%～94.5%内。这与液相色谱-电感耦合等离子体质谱法[24]测定大豆中硒形态含量的结论一致。市售富硒大豆1的色谱图见图4。由保留时间可知富硒大豆中硒赋存形态为SeMet。

图4 市售富硒大豆1中SeMet的色谱图

本工作优化了大豆样品中硒代氨基酸的前处理条件,提出了HPLC-HG-AFS测定富硒大豆中不同形态硒代氨基酸含量的方法,结果表明富硒大豆中硒主要赋存形态为SeMet。该方法简单、准确,所用设备价格适中,便于推广,对发展富硒功能农业、监测食品安全、评估市售富硒大豆产品品质具有一定的现实意义。