敌草快诱导的氧化应激对肉鸡生产性能、肝脏功能、免疫功能和抗氧化性能的影响

白冬红,陈甜甜,孙尹双,张甜甜,盛永杰,郝木强

(山东宝来利来生物工程股份有限公司 山东省动物微生态制剂重点实验室,山东 泰安 271000)

现代动物养殖过程中常见的应激主要包括营养应激、环境应激、氧化应激和免疫应激等,其中,氧化应激和免疫应激是目前研究的焦点[1]。氧化应激是由于过氧化物在动物体内过度积累,超过机体抗氧化防御能力,打破了氧化-抗氧化平衡,进而导致的动物某些组织器官或生理功能受到危害,生产性能降低的一种不良反应[2]。氧化应激被认为是活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生与通过抗氧化机制消除ROS之间的不平衡导致的[3]。当外来因素或动物机体内部异常引起机体产生的ROS自由基过多,导致其无法被机体产生的抗氧化物质及时清除,动态平衡遭到破坏时,就会对机体造成影响,产生氧化应激,过多的氧自由基会结合并破坏生物大分子,造成大分子物质功能紊乱,进而引起细胞结构和生物功能异常[4-5],从而出现采食量下降、饲料转化率降低、分解代谢增强和免疫功能下降等,应激可对动物健康状况和生产性能造成严重危害,已经成为牵制大规模集约化养殖发展的主要因素[6]。

敌草快(Diquat,DQ)是一种非选择性脱叶干燥除草剂。敌草快因使用剂量少、容易控制和使用方便等特点,广泛应用于动物氧化应激模型的建立。敌草快是一种双吡啶非选择接触除草剂,在还原型辅酶Ⅱ(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrogen,NADPH)和细胞色素酶 P450参与下形成很强的氧化还原循环,生成大量的 ROS 和过氧化氢。正常情况下,过氧化氢被过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶分解,失去氧化活性。但当这种保护机制被过度破坏时,超氧阴离子自由基无法及时得到清除,与过氧化氢发生反应,产生更强的羟自由基,羟自由基能攻击生物膜的脂质链,引起脂质过氧化,导致生物膜老化,最终导致细胞死亡[7],这是敌草快造成动物氧化应激的作用机制。敌草快造成的氧化应激损伤包括肠黏膜在内的细胞损伤,导致消化道发生病变,影响动物采食、消化和吸收,造成动物生长性能降低[8]。而敌草快构建的氧化应激模型大多用于仔猪上,对于肉鸡的研究较少,因此本试验旨在探究一次性腹腔注射敌草快诱导的肉鸡慢性氧化应激模型的最佳剂量与作用时间,并分析敌草快对肉鸡生产性能、肝脏功能、免疫功能和抗氧化性能的影响,为生产实践提供理论支持,为功能研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物来源 AA白羽肉鸡,16日龄,购自济宁康易羽农牧科技有限公司。

1.2 主要试剂 总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)测定试剂盒、还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)测定试剂盒和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)测定试剂盒,均购自南京建成生物工程研究所;分泌型免疫球蛋白A(Secretory immunoglobulin A,sIgA)ELISA试剂盒和免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)ELISA试剂盒,均购自北京雅安达生物技术有限公司。

1.3 主要仪器 生化分析仪,上海科华生物工程股份有限公司产品。

1.4 试验方法

1.4.1 试验设计 将64只健康AA肉鸡随机分为4个组：对照组,腹腔注射生理盐水;试验Ⅰ组,腹腔注射10 mg/(kg·bw)敌草快;试验Ⅱ组,腹腔注射15 mg/(kg·bw)敌草快;试验Ⅲ组,腹腔注射20 mg/(kg·bw)敌草快(表1)。每组2个重复,每个重复8只肉鸡。试验期为21 d。试验在山东宝来利来生物工程股份有限公司标准化鸡舍进行,笼上平养,自由采食和饮水,控制鸡舍温度,保持卫生,定期消毒,光照每天24 h。

表1 试验设计和分组

1.4.2 测定指标

1.4.2.1 肉鸡精神状态和生产性能测定 观察试验期间对照组和各试验组肉鸡的精神状态,粪便是否存在异常。在试验第1和21天,以重复为单位称量肉鸡的空腹体质量,记录饲料消耗量,按照公式(1)～(3)计算平均日增量(Average daily gain,ADG)、平均日采食量(Average daily feed intake,ADFI)和料肉比(Feed/Gain,F/G)。

平均日增量(ADG)=(终末体质量-初始体质量)÷试验时间

(1)

平均日采食量(ADFI)=总采食量÷试验时间

(2)

料肉比(F/G)=平均日采食量÷平均日增量

(3)

1.4.2.2 脏器指数测定 试验第7和21天每组取8只肉鸡,解剖,取肝脏、脾脏和法氏囊,按照公式(4)计算脏器指数。

脏器指数=脏器重量÷鸡只重量

(4)

1.4.2.3 肝脏组织形态观察和抗氧化指标测定 试验第7天每组取8只肉鸡,解剖,肉眼观察肝脏组织病变和出血情况;准确称取组织重量,按重量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例,加入匀浆介质,冰水浴条件下机械匀浆,2 500 r/min离心10 min,取上清液测定肝脏组织的T-AOC含量、SOD活性、GSH-Px活性和GSH含量。

1.4.2.4 血清生化指标测定 试验第7和21天每组取8只肉鸡,进行翅下静脉采血,于37 ℃水浴锅里倾斜放置30 min,4 000 r/min离心10 min,分离血清,利用生化分析仪测定谷丙转氨酶(Glutamic pyruvic transaminase,ALT)和谷草转氨酶(Glutamic oxaloacetic transaminase,AST)活性。

1.4.2.5 免疫指标测定 肠黏膜sIgA含量测定：试验第7和21天每组取8只鸡,解剖,收集肉鸡空肠内容物,空肠内容物与生理盐水按1∶2稀释,混匀,4 000 r/min离心10 min,取上清液,ELISA 法测定空肠内容物中sIgA含量。IgG含量测定：试验第7 和21天,每组取8只肉鸡,操作同1.4.2.4,ELISA法测定血清中IgG含量。

1.4.2.6 血清抗氧化指标测定 试验第1、7、14和21天每组取8只肉鸡,操作同1.4.2.4,测定T-AOC含量、SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量。

1.5 数据统计 试验数据采用 SPSS 22.0 软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA),差异显著时采用 Duncan 法进行多重比较。设P<0.05 为显著性水平,结果采用“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 不同剂量的敌草快对肉鸡精神状态和生产性能的影响 试验前各组肉鸡精神状态良好,食欲和饮欲正常。试验期间,与对照组相比,各试验组肉鸡表现精神较沉郁,缩头,羽毛蓬乱,食欲和饮欲下降,蹲伏笼内,尤以试验Ⅲ组最为明显;各组肉鸡粪便均无明显异常。试验Ⅲ组在试验第3天每个重复各死亡1只肉鸡,说明注射剂量过大。

肉鸡生产性能如表2所示,与对照组相比,各试验组的ADG和ADFI均降低,21 d内3个试验组的ADG分别降低12.84%、8.75%和12.13%,ADFI分别降低17.64%、18.42%和14.90%,但差异均不显著(P>0.05),说明敌草快可导致肉鸡体重和食欲下降。

表2 各组肉鸡生产性能

2.2 不同剂量的敌草快对肉鸡脏器指数的影响 试验第7和21天的脏器指数如表3所示,试验第7天,与对照组相比,3个试验组的肝脏指数均显著升高(P<0.05);试验第21天,与对照组相比,试验Ⅱ组的肝脏指数显著升高(P<0.05),试验Ⅰ组和试验Ⅲ组的肝脏指数也高于对照组,但无显著差异性(P>0.05);试验第7和21天,3个试验组的脾脏指数和法氏囊指数与对照组相比,均无显著差异性(P>0.05)。结果表明,敌草快能够导致肝脏肿大,引发肝脏病变,其中以注射15 mg/(kg·bw)敌草快最为显著,并且其能够使肝脏病变维持21 d,但肿大情况会有所减轻。

2.3 不同剂量的敌草快对肉鸡肝脏功能的影响

2.3.1 肝脏组织形态变化 试验第7天,解剖观察发现,对照组肉鸡肝脏无肉眼可见病变;3个试验组肉鸡肝脏肿大,部分试验肉鸡肝脏萎缩,质地脆硬,表面分布多量出血点,以试验Ⅱ组肝脏病变最为严重(表4)。

表4 各组肉鸡肝脏病变观察

2.3.2 肝脏组织的抗氧化功能 试验第7天各组肉鸡肝脏组织的抗氧化结果如表5所示,与对照组相比,3个试验组的SOD活性均显著降低(P<0.05);试验Ⅰ组的GSH-Px活性显著降低(P<0.05),而试验Ⅱ组和试验Ⅲ组的GSH-Px活性有所降低,但无显著差异性(P>0.05)。结果表明,10和15 mg/(kg·bw)敌草快均可导致肉鸡肝脏氧化损伤。

表5 各组肉鸡肝脏抗氧化指标

2.4 不同剂量的敌草快对肉鸡血清生化指标的影响 试验第7和21天的血清生化指标测定结果 如表6所示,试验第7天,与对照组相比,试验Ⅱ组ALT活性显著升高(P<0.05),AST活性有所升高,但无显著差异性(P>0.05);试验第21天,与对照组相比,3个试验组的ALT活性均有所升高,但无显著差异性(P>0.05)。结果表明,试验7天时肝损伤最为严重,且15 mg/(kg·bw)敌草快在一定程度上对肝脏功能造成了损伤。

表6 各组肉鸡血清生化指标

2.5 不同剂量的敌草快对肉鸡免疫性能的影响 试验第7和21天的免疫指标测定结果如表7所示,试验第7天,与对照组相比,3个试验组的肠黏膜sIgA含量和血清IgG含量均降低,且试验Ⅱ组的sIgA含量显著降低(P<0.05),试验Ⅱ组和试验Ⅲ组的血清 IgG含量显著降低(P<0.05);试验第21天,3个试验组的sIgA含量和IgG含量均低于对照组,但无显著差异性(P>0.05)。结果表明,腹腔注射敌草快可降低肉鸡的免疫力,且以15 mg/(kg·bw)剂量最为明显。

表7 各组肉鸡免疫指标

2.6 不同剂量的敌草快对肉鸡血清抗氧化指标的影响 各组肉鸡血清抗氧化指标如表8所示,试验第1天,与对照组相比,试验Ⅰ组各指标均无显著差异性(P>0.05);试验Ⅱ组和试验Ⅲ组血清T-AOC含量均显著降低(P<0.05),SOD活性均显著降低(P<0.05),MDA含量显著升高(P<0.05),GSH-Px活性无显著差异性(P>0.05)。试验第7天,与对照组相比,3个试验组的T-AOC含量均显著降低(P<0.05);试验Ⅰ组SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量均无显著差异性(P>0.05);试验Ⅱ组SOD活性显著降低(P<0.05),MDA含量显著升高(P<0.05),GSH-Px活性无显著差异性(P>0.05);试验Ⅲ组GSH-Px活性显著降低(P<0.05),MDA含量显著升高(P<0.05),SOD活性无显著差异性(P>0.05)。试验第14天,与对照组相比,试验Ⅰ组各指标无显著差异性(P>0.05);试验Ⅱ组T-AOC含量显著降低(P<0.05),SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量均无显著差异性(P>0.05);试验Ⅲ组SOD活性显著降低(P<0.05),T-AOC含量、GSH-Px活性和MDA含量均无显著差异性(P>0.05)。试验第21天,与对照组相比,试验Ⅰ组的T-AOC含量显著降低(P<0.05),SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量均无显著差异性(P>0.05);试验Ⅱ组和试验Ⅲ组各抗氧化指标均无显著差异性(P>0.05)。结果表明,敌草快能够降低机体的抗氧化能力,以15 mg/(kg·bw)的剂量最为明显,氧化应激状态最长持续21 d,但试验第21天时,血清抗氧化指标有所恢复,说明敌草快对肉鸡的氧化损伤逐渐减退。

表8 各组肉鸡血清抗氧化指标

3 讨论

3.1 敌草快诱导的氧化应激对肉鸡生产性能的影响 消化道的主要功能是营养物质的消化、吸收和代谢,因此,消化系统功能是否正常直接影响到动物的生长性能[9]。应激状态下,动物机体内自由基大量产生,细胞膜结构的完整性遭到破坏,细胞的正常生理功能受到影响,肠道损伤和肠黏膜通透性升高引发消化系统紊乱;消化系统功能异常进而诱发肠源性感染等消化道疾病,动物表现出采食量下降和生产性能降低[10]。

敌草快作为一种具有肝毒性的联吡啶类除草剂,具有刺激性,可用于建立动物体内氧化应激模型,腹腔注射直接进入动物机体,可被动物肠道系膜消化和吸收,引起机体利用血液内的分子氧产生氧自由基,破坏细胞膜结构,影响细胞正常生理功能,消化道黏膜受损,通透性增高,造成肠道感染,诱发肠道疾病,临床表现为采食量降低,平均日增量减小,动物生产性能降低[11]。已有研究报道,敌草快诱导的氧化应激可降低仔猪的生长性能和营养代谢能力[12-13]。本试验中,所有试验组肉鸡均出现食欲减退、拉稀等现象,10和15 mg/(kg·bw)敌草快作用于肉鸡21 d,ADG和ADFI均下降,与李驰等[14]在肉鸡上构建的慢性氧化应激模型的研究结果一致,但本试验中对肉鸡注射20 mg/(kg·bw)敌草快可导致肉鸡部分死亡,说明此剂量过大,不适合利用此剂量构建氧化应激模型。

3.2 敌草快诱导的氧化应激对肉鸡肝脏功能的影响 肝脏是敌草快产生自由基攻击的主要靶器官,敌草快诱发的氧化应激会造成肝脏病理性损伤。李永义[15]研究表明,10 mg/(kg·bw)敌草快作用7 d可诱发仔猪肝细胞出现广泛性的空泡变性,肝细胞崩解,肝组织间质出现红细胞和炎性细胞浸润。当肝细胞受损或任何原因引起肝细胞膜通透性增加时,存在于肝脏细胞质中的AST和ALT就会被释放到血液中。因此,在医学上往往利用血液中 AST 和 ALT 活性的高低来判定肝脏细胞结构是否发生损伤。赵娇等[16]研究发现,敌草快诱导的氧化应激能够导致程序性肝脏损伤,血清中AST和ALT活性升高,与对照组相比分别升高了36.7%和40.0%。本试验中,注射15 mg/(kg·bw)敌草快可导致肉鸡肝脏肿大,表面分布多量出血点,表观病变明显,血清中 AST和 ALT活性升高,这与 Jia 等[17]和Chen等[18]得出的结论一致,且本试验结果显示,注射15 mg/(kg·bw)敌草快可对试验鸡造成明显的肝脏功能损伤,而10 mg/(kg·bw)敌草快对肝脏功能的损伤较小,可能是注射剂量偏低。

3.3 敌草快诱导的氧化应激对肉鸡免疫功能的影响 肠道屏障包括机械屏障、免疫屏障和生物屏障,免疫屏障在肠道屏障中起重要作用。sIgA 是肠道免疫屏障的重要组成部分,是肠黏膜免疫的主要效应因子。sIgA 是由肠黏膜固有层的浆细胞分泌产生的,由J 链、2条多肽链、2个IgA 单聚体和分泌片段(Secretory component,SC)构成[19]。sIgA 能够阻止细菌在肠黏膜粘附和繁殖,阻止细菌通过黏膜上皮进入机体,它还能中和肠道内的病毒、毒素和酶,且能和抗原结合形成免疫复合物之后被吞噬细胞清除[20]。本试验中对肉鸡注射敌草快,在21 d内可导致肉鸡肠黏膜sIgA含量降低,以15 mg/(kg·bw)剂量最为明显,说明敌草快诱导的氧化应激可导致肉鸡肠黏膜损伤和免疫功能下降。血清中免疫球蛋白含量的多少与机体的免疫功能有关,通常认为免疫球蛋白含量越高,机体的免疫能力越强[21]。本试验结果显示,注射敌草快后肉鸡的血清IgG含量大幅度下降,提示肉鸡的免疫机能出现紊乱。

3.4 敌草快诱导的氧化应激对肉鸡抗氧化性能的影响 正常生理状态下,肉鸡体内氧化系统和抗氧化系统处于平衡状态,可以及时清除自由基,保护机体免受损伤,而氧化应激状态下,体内氧化系统和抗氧化系统的平衡被打破[3]。血清抗氧化指标的高低可以反映机体的氧化应激水平[22]。SOD、GSH-Px和MDA是机体内最主要的抗氧化物质和氧化物质[23]。符清瑶等[24]研究发现,与空白对照组相比,腹腔注射敌草快后,仔猪GSH-Px和SOD活性显著降低(P<0.05)。贺琼玉等[25]研究表明,与对照组相比,注射敌草快后(第29天),仔猪血清和肝脏SOD和GSH-Px活性显著降低(P<0.05),血清和肝脏MDA含量显著增加(P<0.05)。本试验结果也显示,敌草快可显著降低肉鸡血清中抗氧化酶 SOD和GSH-Px活性,降低总抗氧化能力,且显著提高血清中脂质过氧化物 MDA含量,使肉鸡处于氧化应激状态,其中以注射15 mg/(kg·bw)敌草快效果最为明显。