猫肥厚型心肌病生物标志物的应用现状和研究进展

丁婉霜,刘萌萌

(海南大学热带农林学院,海南 海口 570100)

肥厚型心肌病(Hypertrophic cardiomyopathy,HCM)是猫最常见的心脏病,在猫中总体发病率为10%～15%[1],在老年猫中尤其高发,发病率可高达近30%[2]。猫HCM的典型特征为左心室壁异常增厚。根据病因不同,该病可分为原发性和继发性。在原发性HCM中,部分猫品种有一定的易感性或遗传倾向,如缅因猫、布偶猫、英国短猫和斯芬克斯等[3]。继发性HCM患猫的临床表现多样,有些猫发病急,迅速出现充血性心力衰竭(Congestive heart failure,CHF)和动脉血栓栓塞(Arterial thromboembolism,ATE)的症状,极少数猫可能突然死亡;还有些猫可能终生处于亚临床期,不表现任何临床症状[4]。目前,临床上对猫HCM的诊断主要依赖于超声心动图技术,结合心电图、X线技术和基因筛查等方法辅助诊断。传统的HCM诊断方法对动物医院设备条件、临床兽医从业者的技术水平和经验均有较高要求,且这些方法往往昂贵且耗时,无法反映心脏微观层面的病理变化。

生物标志物是指可以标记器官、组织、细胞和亚细胞结构或功能改变的、具有一定特异性的生化指标,其释放与组织/器官的损伤程度通常成正比,因此可用于疾病诊断、分期或者用来评价治疗方案的安全性和有效性。近年来,生物标志物在人类和伴侣动物心血管疾病中的应用广受关注。与传统的心脏病诊断技术相比,生物标志物检查操作简便、快速、侵入性低,还可以提供疾病分子层面的病理信息。目前,心血管生物标志物的临床应用包括以下5个方面：(1)亚临床疾病检测;(2)急慢性综合征诊断;(3)疾病风险分级;(4)监测疾病进展或评估治疗效果;(5)辅助选择合适的治疗方案[5]。目前,临床上针对猫HCM的诊断已有商品化心脏生物标志物,比如利钠肽和肌钙蛋白。此外,近期研究表明,与心肌重塑、炎症、凝血和肾脏功能相关的生物标志物在猫HCM或心肌病的发生发展中也发挥一定的作用,本文将对上述标志物展开探讨。

1 利钠肽

利钠肽是一组在心房和心室中合成的结构相关的肽,主要包括心房利钠肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)、脑利钠肽(Brain natriuretic peptide,BNP)和C型利钠肽等,目前临床常用ANP和BNP。利钠肽基因编码mRNA组成具有长肽序列的利钠肽前体,成熟的活性ANP和BNP从前体分子上被切割下来,并与它们各自的非活性形式氨基末端心房利钠肽前体(N-terminal pro-atrial natriuretic peptide,NT-proANP)和氨基末端脑利钠肽前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)一起释放到循环中。当心壁受牵拉时,心脏分泌ANP和BNP进入循环,以对抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS),并抑制心肌细胞肥大和凋亡,刺激血管再生,抑制器官纤维化[6]。因此,ANP和BNP的升高被认为是对心房和心室机械应力的保护性激素反应,目的是维持心肌健康和心血管稳态。目前,利钠肽被用于多种心血管问题的诊断和预后,如高血压、充血性心力衰竭和急性冠状动脉综合征[7],其中BNP被认为是反映心功能障碍最敏感、最特异的利钠肽[7-8]。由于非活性NT-proBNP比具有活性的BNP更稳定,因此临床上通常检测NT-proBNP。目前,市面上已有多种检测猫NT-proBNP的商品化试剂盒用于诊断猫的心脏病,尤其是鉴别患有严重心脏病的病例。例如,Connolly等[9]发现健康猫血清中NT-proBNP浓度明显低于患有心脏病且伴有CHF的猫,且以NT-proBNP浓度是否高于49 fmol/mL来区分健康猫和患有心脏病且伴有CHF的猫时,其诊断敏感性和特异性分别为100%和89.3%。NT-proBNP浓度的检测方法包括定量和半定量,二者均可用于区分健康猫和患有心脏疾病的猫。半定量床旁护理检测(Point-of-care,POC)可对NT-proBNP浓度进行快速评估,10 min内获取结果,因此适用于急诊。NT-proBNP半定量检测法适用于鉴别患猫是由心脏原因或非心脏原因所致的呼吸窘迫,而对于POC检测出异常的NT-proBNP浓度,建议进行心脏超声以确定该结果的意义[10]。相较于半定量法,定量检测法对于诊断患有严重HCM的猫通常具有更高的敏感性和特异性[11]。传统的定量检测法一般需要送样到第三方实验室进行检测,24～48 h后才能得到检测结果,因此限制了其在紧急情况下的应用。最近几年,国内外生物公司陆续开发了便携式猫NT-proBNP定量检测仪,可用于一线临床,但这些检测仪的诊断表现有待于进一步确定。由于定量检测法可以给出明确的BNP浓度,因此适用于个体病例的追踪研究,可为临床治疗效果和预后提供更多信息。在HCM患猫生物标志物浓度是否能预测心脏死亡的研究中,单因素分析结果显示,血浆NT-proBNP界限值>250 pmoL/L与HCM患猫预后较差有显著相关性[12]。在笔者先前开展的一项针对12只CHF患猫的追踪研究中,血清NT-proBNP浓度在初诊和复查时始终高于检测上限(1 500 pmol/L)的患猫,1年内死亡率为100%,支持了NT-proBNP的持续显著升高提示预后不良,而研究中80%存活患猫的NT-proBNP浓度均稳定或下降[13]。

除了血浆样本或血清样本,患猫的其他体液也可以用于NT-proBNP浓度的检测,如胸腔积液[14-15];Humm等[15]的研究表明,将胸腔积液中的NT-proBNP临界值设定为322.3 pmol/mL,可以区分产生胸腔积液的原因是心源性还是非心源性,且胸腔积液中检测NT-proBNP的精准度与血浆NT-proBNP的观察值相似,该研究还对尿液样本中的NT-proBNP进行了检测,但效果并不理想。

NT-proBNP的检测在临床中发挥重要作用,但也存在一定的局限性,例如,该检测无法诊断早期HCM。Hanås等[16]的研究表明,POC法和定量检测法都可以鉴别出患有左心房扩张的HCM猫,但均无法识别无左心房扩张的HCM猫。Hsu等[11]在对40只缅因或缅因混合品种猫的研究中发现,血浆NT-proBNP可鉴别重度HCM,但并不适用于区分轻度到中度的HCM。同时,需要注意样本来源不同猫的NT-proBNP浓度变化,如胸腔积液样本和血浆样本中NT-proBNP浓度之间存在差异,这就需要对不同的样本来源制定不同的临界值。快速检测试剂盒对检测血浆样本表现出良好的特异性和敏感性,但对胸腔积液样本的特异性较差[17]。猫血液NT-proBNP浓度也存在一定的日间波动[18],除此之外,还受激素和肾脏功能等因素的影响[19],因此判读时应当考虑上述因素。在实际检测中,可能还会受到激素的影响,干扰真实结果的判定,一项对猫短期服用泼尼松龙的临床学调查结果显示,在所有受试猫中4只接受泼尼松龙治疗的患猫和1只对照组猫在不同时间的NT-proBNP浓度均超过了疑似心脏病的临界值(>100pmoL/L),但其超声心动图均无异常[20],提示NT-proBNP浓度在评估糖皮质激素引起猫血流动力学变化时可能诊断价值有限,而且在临床上正常猫亦可能出现假阳性结果。

2 心肌肌钙蛋白

心肌肌钙蛋白由附着在肌动蛋白丝上的3个亚基(T、C 和 I)组成,在心肌细胞收缩中起调节作用。心肌细胞损伤可导致肌钙蛋白释放,因此肌钙蛋白循环浓度增加可提示心脏损伤。目前,在HCM患猫临床研究中最敏感和最常用的肌钙蛋白是肌钙蛋白I(Cardiac troponin I,cTnI)[21-22],其次是肌钙蛋白T(Cardiac troponin T,cTnT)。

已有研究证实,HCM患猫循环血液中cTnI浓度显著升高[23]。如果血浆cTnI浓度<0.163 ng/mL,可排除HCM;血浆cTnI浓度>0.234 ng/mL,则可识别猫患有重度HCM[21],因此cTnI浓度的升高程度可反映HCM的严重程度。另一项研究表明,将血清cTnI浓度参考值设为0.06 ng/mL,可较有效地区分健康猫和HCM患猫[22]。为提高cTnI检测的灵敏度,人用测量cTnI浓度的超灵敏测量方法(Siemens ADVIA Centaur CP TnI-Ultra)被尝试用于猫,与普通测量方法相比,这种超灵敏测量方法可将cTnI浓度检测的下限降至0.006 ng/mL[21-22]。心肌肌钙蛋白对于区分心脏病与其他原因引起的呼吸困难具有一定的作用,但诊断表现逊于NT-proBNP[12,24]。此外,心肌肌钙蛋白也可用于评估心肌肥厚患猫的预后,Langhorn等[25]对原发性HCM患猫的研究表明,cTnI和cTnT浓度升高均与HCM患猫死亡显著相关,其中cTnI对心肌损伤的敏感性更高,而cTnT似乎更能指示预后,即cTnT浓度的增加通常提示更严重的心肌细胞破坏。另一项研究表明,HCM患猫循环血液中cTnI浓度与左心室壁厚度和左心房大小成正相关,伴左心房扩张的HCM患猫的cTnI浓度显著升高,提示循环cTnI浓度可反映心脏重塑程度[26]。

与利钠肽相似,肌钙蛋白也可在非心脏疾病中增加,包括甲状腺功能亢进、贫血、高血压和肾脏疾病等[19]。研究表明,慢性肾病患猫和HCM患猫血清cTnI浓度均可见升高,而且肾病组与HCM组之间没有显著差异;在人类医学研究中已证实,cTnI是受肾脏疾病影响最大的生物标志物[27]。此外,品种和性别也会影响健康猫血清cTnI的浓度[26],在对肌钙蛋白检测结果做出解释时,还应考虑这些可能影响其浓度变化的因素。

3 心肌重塑标志物

严重的心脏疾病往往伴随心肌成分和结构的改变,这一过程也被称为心脏重塑。心肌细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)重塑是心脏重塑的重要部分。在生理情况下,ECM是维持心脏结构和生理稳态的重要成分,主要由基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)及其组织抑制剂(Tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)调节,实现动态平衡。心肌ECM过度重塑时,MMPs和TIMPs调节失常[28]。因此,循环MMPs和TIMPs浓度可以为发生心脏重塑的临床病例提供更多信息,例如,TIMP-1水平升高提示高血压继发左心肥厚的患者出现CHF;发生心肌梗死后,MMP-8和MMP-9水平急剧上升等[29-30]。

临床上,与雌性猫相比,HCM更高发于雄性猫。研究发现,雄性HCM患猫心肌中MMP-2、MMP-3和TIMP-3的mRNA转录水平显著高于雌性猫,MMP-2和MMP-3通过诱导血管内皮生长因子表达,促进血管生成和ECM代谢,而TIMP-3降低血管内皮生长因子表达并抑制血管生成,该结果提示上述酶可能参与调节HCM患猫的心肌ECM重塑及该过程中出现的血管病变[31]。在重度心脏纤维化患猫中,MMP-2的表达增加,TIMP-3在轻度纤维化区域的成纤维细胞中表达增加[32]。MMPs不仅负责ECM的降解,还调节胶原蛋白的合成,引起心肌纤维化,因此,MMPs和TIMPs的上调可提示猫心脏纤维化和ECM重塑的发生。一项评价CHF患猫血清蛋白质组学的研究支持了上述结果,在心肌病晚期患猫的血清中,ECM重塑标志物显著上升[33];在猫HCM晚期,这些重塑标志物,特别是MMP-2、MMP-3和TIMP-3的区域性激活,参与心肌重塑,导致HCM患猫的心脏出现心壁变薄、收缩功能下降等结构和功能的变化[31]。而且这些重塑标志物在HCM和心房血栓患猫中,表现不同的转录水平,提示这些重塑标志物可能有助于区别不同的心脏疾病。

半乳糖凝集素-3(Galectin-3,Gal-3)由多种免疫细胞表达,包括肥大细胞、组织细胞和巨噬细胞,在多种生理功能中发挥重要作用。由于Gal-3在细胞表面表达,且较易由损伤细胞和炎症细胞分泌,因此认为Gal-3为心脏纤维化的循环生物标志物。在人类中,Gal-3升高可预测心肌纤维化和不良心脏事件[34]。最近的一项研究表明,Gal-3具有成为猫HCM新型生物标志物的潜能[35]。与健康猫相比,HCM患猫血清Gal-3升高,并且与左心房大小、左心室大小和心肌细胞外容积(一种无创测量心肌纤维化的指标)呈正相关。但有必要进一步研究和评估Gal-3与心肌纤维化和预后之间的关系。

4 炎症标志物

急性期反应是机体对潜在致病刺激的反应,其始于炎性细胞释放白细胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)。这些细胞因子可诱导发热、白细胞增多和急性期反应蛋白(Acute phase protein,APP)的释放[36]。C反应蛋白(C-reactive-protein,CRP)、血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid A protein,SAA)、α1-抗胰蛋白酶(Alpha-1 antitrypsin,A1A)等APP在炎症刺激后可成倍增长。心脏病晚期心衰时,常伴随炎症相关因子的过度表达。1956年,研究人员首次在心衰患者血液中发现CRP升高[37]。此后,大量研究调查了心衰与炎症标志物之间的相关性,强调了CRP、TNF-α和IL-6在慢性心衰中的预测价值[38]。且已有研究指出,猫的HCM与炎症有关[31]。例如,HCM患猫存在炎症细胞浸润心肌(尤其是巨噬细胞募集和增殖),炎性细胞因子IL-1、IL-6、IL-18和TNF-α的转录水平上升以及APP在HCM患猫外周血中显著升高等等。

SAA是猫主要的APP。先前研究表明,患病住院的猫血清中SAA浓度增加[39];在HCM患猫中,相对于心肌局灶性或多灶性肥厚的病例,左心泛发性肥厚患猫的SAA浓度升高,鉴于该值升高后仍在实验室检测参考范围内,提示此时可能仅存在局部炎症,组织学证据支持亚临床HCM患猫的心肌中有轻度炎性细胞浸润[23]。另一项研究发现,猫原发性心肌病晚期发生CHF时,SAA浓度也有所增加;与健康猫相比,心衰患猫血清中富亮氨酸α2糖蛋白1(Leucine-rich-alpha-2-glycoprotein 1,LRG1)和铜蓝蛋白也有所增加[13]。LRG1的生物学功能目前尚不完全明确,有研究表示,其与炎症有关,并可能通过与转化生长因子β相互作用而在心肌纤维化中发挥作用[40]。铜蓝蛋白则是一种在急性期反应中增加的铜氧化酶,具有抗氧化功能。SAA、LRG1和铜蓝蛋白水平与原发性心肌病患猫的左心房大小和NT-proBNP浓度呈正相关,提示这3种APP具有成为猫心肌病分期和预后标志物的潜能。

研究还发现了一种称为α-1酸性糖蛋白(Alpha-1-acid glycoprotein,AGP)的APP,在人群中已证实AGP是心血管疾病患者死亡率和全因死亡的独立预测因子[41]。在原发性心肌病和CHF患猫血清中,AGP水平与cTnI和NT-proBNP浓度呈显著正相关,多因素分析显示,AGP是猫CHF死亡风险的独立预测因子[33]。上述标志物的研究尚在起步阶段,未来需要进一步研究阐明它们与猫心肌病之间的关系。

CHF中最常研究的APP是CRP。在人和犬的研究中均显示,CRP在CHF中增加,并与疾病严重程度相关[42]。虽然CRP在猫中不是主要的APP,但在猫原发性心肌病引起的CHF和心肾综合征的研究中,CRP与肾脏功能标志物呈显著正相关[13]。

A1A通过抑制中性粒细胞弹性蛋白酶和纤溶酶原激活剂在肺脏组织中发挥抗炎作用,以避免过度的组织损伤。CHF患猫血清的A1A显著升高,这与先前人类医学中心衰患者的循环A1A增加的研究结果一致[43]。而且,这种蛋白酶抑制剂与心肌病患猫的血清NT-proBNP浓度呈密切正相关,被认为是与氧化应激相关的生物标志物。在Michaek等[44]对HCM患猫抗氧化防御和氧化应激标志物的研究中,HCM患猫血清中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性不同,过氧化氢酶活性仅在疾病无症状阶段显著降低;在兽医学中,鲜有过氧化氢酶活性在心血管疾病中的研究;在人类医学中,随着病变血管数量的增加,过氧化氢酶活性逐渐降低[45],这也提示抗氧化物可能为区分潜在HCM患猫提供有益信息。

5 凝血标志物

血栓形成和ATE是猫心肌病的常见并发症,尤其与左心房扩大相关。活化的凝血标志物可用于评价HCM患猫的凝血状态与左心房大小的关系[46]。通过检测活化的凝血标志物和纤溶标志物可评估受试者高凝状态,并为HCM患猫指示ATE风险,但目前的研究结果所提供的信息还非常有限。Bédard等[46]通过评价健康猫和无症状HCM患猫血浆凝血标志物,比较了二者的凝血酶-抗凝血酶复合物、D-二聚体和纤维蛋白降解产物(Fibrin degradation product,FDP)的血浆浓度,结果显示,凝血酶-抗凝血酶复合物是其中最敏感的标志物,其次是D-二聚体和FDP。凝血酶-抗凝血酶复合物反映体内凝血酶的生成,被认为是凝血激活的敏感标志物。研究表明,在特发性心肌病患者中,左心房直径与凝血酶-抗凝血酶复合物浓度显著相关[47]。D-二聚体由凝血酶介导的纤维蛋白原裂解和纤溶酶介导的纤维蛋白凝块裂解产生,在人类中被认为是形成血栓的敏感标志物。虽然在一些早期研究中,只有少数ATE患猫的血浆D-二聚体浓度较高,但是随着近年来相关研究的增多和深入,发现50%的ATE患猫中D-二聚体浓度升高[48]。一项评价HCM患猫血浆D-二聚体浓度的研究也表明,与健康猫相比,伴有ATE的HCM患猫血浆中D-二聚体浓度较高[49],提示较高浓度的D-二聚体可能增加了ATE的风险。

上述凝血标志物与猫HCM之间的联系还需要进一步研究。在患有高血栓风险疾病的病人中,评估高凝状态通常需要测量几种不同的凝血标志物,这种多标志物联合检查的手段或许也适用于评估HCM患猫的血栓风险。

6 肾脏标志物

心血管-肾轴疾病又称为心肾综合征(Cardiorenal syndrome,CRS),指心脏和肾脏其中一个器官的急性或慢性功能障碍,可能会导致另一个器官的急性或慢性功能障碍[50]。因此,在临床上对肾脏疾病进行诊断的相关生理指标是否应纳入对于心脏疾病的诊断也值得探讨。

肌酐是肌肉组织的代谢产物,主要由肾小球滤过排出体外。血清(或血浆)肌酐浓度随肾小球滤过率(Glomerular filtration rate,GFR)下降而升高。在心脏病发展过程中,神经体液系统的激活可能会潜在降低GFR,从而改变肾功能。晚期HCM患猫的每搏输出量和全身灌注减少,可能导致交感神经系统激活和RAAS活性增加[51]。Sampedrano等[52]研究证实,HCM患猫的循环肌酐浓度异常升高。

对称性二甲基精氨酸(Symmetric dimethylarginine,SDMA)是蛋白质代谢的产物,主要通过肾脏排出,因此也可以反映GFR情况。SDMA对GFR下降的敏感度高于肌酐。Langhorn等[53]关于猫HCM、原发性肾病与SDMA关系的研究表明,慢性肾病患猫的血清SDMA浓度显著升高,而HCM患猫的血清SDMA浓度与健康对照无显著差异。但是,Liu等[13]研究猫原发性心肌病的报道表明,肌酐、SDMA和NT-proBNP被定义为CRS标志物,出现CHF的心肌病患猫的血清SDMA和NT-proBNP浓度显著高于健康对照组和亚临床心肌病组,并且指标均超过了正常参考范围,提示存在心脏或肾脏问题;该研究中亚临床心肌病组与健康对照组猫的血清SDMA和肌酐浓度未见显著差异,这与之前的研究一致,支持CRS可能不会出现在猫心肌病的早期阶段[53]。此外,血清SDMA浓度升高与CHF患猫生存期缩短呈正相关,提示SDMA对心肌病患猫的预后具有潜在的应用价值。

肾脏相关的RAAS过度激活可导致心血管病变。血管紧张素II和醛固酮通过调节肾脏、血管和心脏中细胞因子和趋化因子的表达,引起促炎作用和心血管重塑[54-56],这些病理生理变化最终可导致心血管损伤[57]。与健康猫相比,心肌病患猫的RAAS相关标志物显著升高,如血管紧张素Ⅱ和醛固酮等[58]。RAAS标志物活性在心肌病晚期患猫血液中显著增加,提示RAAS参与猫心肌病的病程发展。

7 小结

目前,兽医临床上缺少能对猫HCM进行准确分级、诊断和预后的方法,这使得心脏生物标志物的开发成为新的趋势。本文所述生物标志物为猫的HCM提供了相关的病理生理信息,随着研究的不断深入,未来将心脏生物标志物与其他临床诊断方法相结合,有望对猫的HCM实现更准确的疾病分级,辅助制定最佳的治疗方案和预后追踪,最终推动兽医临床工作的发展。