猪繁殖与呼吸综合征病毒入侵宿主细胞途径研究进展

李 睿,乔松林,张改平

[河南省农业科学院动物疫病防控研究所(河南省农业科学院动物免疫学重点实验室),河南 郑州 450002]

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)属于套式病毒目(Nidovirales)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、β-动脉炎病毒属(Betaarterivirus)(https：//ictv.global/taxonomy/taxondetails?taxnode_id=201851832),是具有囊膜的单股正链RNA病毒。PRRSV感染主要引起妊娠母猪流产、早产、死胎、弱胎和木乃伊胎等繁殖障碍,新生仔猪高病死率以及各年龄段猪呼吸系统疾病[1]。当前,PRRSV是危害全球养猪业最主要的病原之一,每年均造成巨大的经济损失[2]。然而,PRRSV毒株多样,导致目前疫苗免疫、抗病毒治疗等防控手段面临巨大的困难和挑战。作为非细胞型病原,PRRSV首先入侵宿主细胞,然后利用细胞生命系统完成自身复制周期[3]。因此,追踪PRRSV入侵宿主细胞这一关键步骤的最新研究进展,有助于深入理解PRRSV感染及其致病机制,为抗病毒策略开发提供新的理论依据。

1 动物囊膜病毒入侵宿主细胞途径

病毒是一类非细胞型病原,根据其是否具有脂质双分子层的囊膜结构(Envelope),可被进一步划分为有囊膜病毒(Enveloped viruses)和无囊膜病毒(Non-enveloped viruses)。作为细胞内寄生病原,病毒必须感染宿主细胞才能完成自身复制周期进行增殖。病毒复制周期由一系列受高度调控的过程组成,一般包括入侵(Invasion)、脱壳(Uncoating)、生物合成(Synthesis)、组装(Assembly)和释放(Release)等阶段[4-5]。

在入侵宿主细胞途径方面,关于动物囊膜病毒的研究较为充分,包括通过病毒囊膜与宿主细胞质膜(Plasma membrane)直接膜融合(Membrane fusion)和利用细胞内吞作用(Endocytosis)两种入侵途径[6]。前者是由病毒囊膜蛋白与宿主细胞表面受体相互作用或/和被定位于宿主细胞质膜上的蛋白酶、外源蛋白酶等切割,引起病毒膜融合蛋白(Fusion protein)构象发生改变,触发病毒囊膜与宿主细胞质膜发生膜融合,从而在宿主细胞表面释放病毒基因组进入宿主细胞内进行复制[7]。后者可根据细胞内吞作用机制细分为网格蛋白介导的内吞途径(Clathrin-mediated endocytosis,CME)、小窝蛋白(Caveolin)介导的内吞途径、脂筏(Lipid raft)介导的内吞途径和巨胞饮(macropinocytosis)等[8]。动物囊膜病毒利用内吞作用进入宿主细胞内体(Endosomes)后,病毒膜融合蛋白在内体蛋白酶、低pH等作用下构象发生改变,引起病毒囊膜与内体膜融合,释放病毒基因组进行复制[9]。大量研究证实,动物囊膜病毒往往利用多种途径入侵宿主细胞以提高感染效率。例如,严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)纤突糖蛋白(Spike glycoprotein)与受体血管紧张素转化酶2(Angiotensin converting enzyme 2)结合后,被位于宿主细胞质膜上的跨膜丝氨酸蛋白酶2(Transmembrane protease serine 2)切割,引起病毒直接在宿主细胞表面发生膜融合[10];另一方面,SARS-CoV-2还能利用CME[11]和巨胞饮[12]等多种内吞作用入侵宿主细胞建立感染。

入侵是病毒完成复制周期的第一关键步骤,因此一直是病毒学领域的研究前沿和热点,也是疫苗和抗病毒药物设计的靶标。深入研究病毒入侵宿主细胞途径对于全面揭示病毒感染及其致病机制、开发高效抗病毒策略具有重要的科学意义和应用价值。如上所述,目前国内外针对SARS-CoV-2入侵途径的研究成果丰硕,为全球防控SARS-CoV-2提供了可靠的理论支持;同时基于SARS-CoV-2入侵途径的抗体类药物已成功用于感染患者的临床治疗,另有众多小分子类和多肽类抗病毒药物正在临床试验中,有望助力抗击肆虐全球的SARS-CoV-2疫情[13-14]。

2 PRRSV入侵宿主细胞途径

PRRSV具有高度的宿主细胞嗜性,在猪体内主要感染单核/巨噬细胞,包括猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs)和树突状细胞(Dendritic cells)[15-16];在体外感染必需受体CD163表达的非洲绿猴肾上皮细胞系MA-104及其衍生的MARC-145细胞等[17]。在PRRSV入侵途径研究方面,最初美国学者使用氯喹(Chloroquine)、氯化铵(Ammonium chloride)和巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1)处理MARC-145细胞影响细胞内囊泡pH,通过检测PRRSV感染过程中RNA复制和子代病毒产生发现,PRRSV入侵依赖于低pH,进一步通过电子显微镜(Electron microscopy)观察到PRRSV入侵时病毒颗粒被包裹在网格蛋白形成的细胞囊泡内,初步确定PRRSV通过低pH依赖的内吞途径入侵MARC-145细胞[18]。随后,比利时学者通过流式细胞术(Flow cytometry,FCM)、激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)等方法结合使用氯喹、氯化铵等试剂进一步明确PRRSV通过低pH依赖的受体介导的CME入侵PAMs[19]。

国内外学者后续鉴定出硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)、唾液酸粘附素(Sialoadhesin,Sn)、波形蛋白(Vimentin)、CD151、CD163、CD209、非肌肉肌球蛋白重链9(Non-muscle myosin heavy chain 9,MYH9)、多配体蛋白聚糖4(Syndecan-4)、表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor)、热休克蛋白家族成员8(Heat shock protein member 8,HSPA8)等细胞受体或因子参与PRRSV CME过程[20-22]。深入研究表明,PRRSV通过其结构蛋白与细胞受体或因子相互作用介导病毒入侵宿主细胞：PRRSV基质蛋白(Matrix protein,M)首先被HS吸附使病毒聚集到细胞表面,接着PRRSV囊膜糖蛋白(Glycoprotein,GP)5被Sn结合使病毒内吞进入细胞,随后PRRSV GP2、GP4与CD163相互作用促进病毒内吞;同时,PRRSV核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein)、GP5和GP4分别与波形蛋白、MYH9和HSPA8相互作用协助病毒入侵[20-22]。近期,本研究团队揭示了PRRSV进入内体后的膜融合细节[23-24],进一步丰富了PRRSV通过CME入侵宿主细胞的分子机制。

另外,国内多个研究团队使用甲基-β环糊精(Methyl-β cyclodextrin,MβCD)等去除MARC-145细胞或PAMs细胞膜中的胆固醇破坏脂筏后,通过多种方法监测PRRSV感染过程发现,MβCD显著抑制PRRSV入侵宿主细胞,而在MβCD处理后回补外源胆固醇会部分恢复PRRSV入侵宿主细胞,提示PRRSV利用脂筏介导的内吞途径入侵宿主细胞[25-27],然而相关分子机制还需进一步揭示。

3 PRRSV入侵途径最新研究进展

除上述CME和脂筏介导的内吞途径外,本研究团队近年来在PRRSV入侵途径领域取得了新的进展。2020年,本研究团队使用细胞内吞作用抑制剂系统研究PRRSV入侵途径发现,即使阻断CME和脂筏介导的内吞途径,PRRSV仍能入侵MARC-145细胞和PAMs,提示存在新的途径参与PRRSV入侵宿主细胞。该研究使用巨胞饮特异性抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利[5-(N-ethyl-N-isopropyl)-amiloride]处理宿主细胞后发现,PRRSV入侵受到显著抑制,初步确定PRRSV可利用巨胞饮入侵宿主细胞;然后利用右旋糖酐(Dextran)指示巨胞饮、分拣连接蛋白5(Sorting nexin 5)指示巨胞饮体(Macropinosomes)、鬼笔环肽(Phalloidin)标记巨胞饮F-肌动蛋白(F-actin)膜凸起、细胞松弛素D(Cytochalasin D)和拉春库林A(Latrunculin A)影响巨胞饮肌动蛋白重排等手段进一步明确巨胞饮可参与PRRSV入侵宿主细胞[28]。为了揭示PRRSV调控巨胞饮的分子机制,该研究还采用斑点印迹法(Dot blotting)、免疫印迹法(Immunoblotting)、蛋白沉降法(Pulldown)、RNA干扰(RNA interference)、FCM和CLSM等试验,阐明了PRRSV囊膜暴露的磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)被宿主细胞表面PS受体-T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子(T-cell immunoglobulin and mucin domain)家族成员识别,激活下游Rho家族鸟苷三磷酸酶Rac1/细胞分裂控制蛋白42(Cell division control protein 42)-p21活化激酶1(p21-activated kinase 1)信号通路诱导巨胞饮[28]。该研究首次鉴定出PRRSV利用巨胞饮入侵宿主细胞的途径。

同年,本团队在研究高致病性PRRSV(Highly pathogenic PRRSV,HP-PRRSV)致病机制时意外发现,HP-PRRSV感染猪后会导致猪肺脏组织大量分泌弹性蛋白酶(Elastase);为了揭示弹性蛋白酶在HP-PRRSV感染过程中的作用,外源添加该蛋白酶发现其能够显著促进HP-PRRSV入侵MARC-145细胞和PAMs;随后通过多种方法验证了弹性蛋白酶促进HP-PRRSV入侵不依赖于上述已发现的内吞途径,而且添加多种抑制剂阻断低pH依赖的内吞途径后,该蛋白酶仍能介导病毒入侵;最终证实弹性蛋白酶是通过切割HP-PRRSV GP5介导病毒直接在宿主细胞表面发生膜融合,从而促进病毒入侵[29]。该研究鉴定了除内吞途径外HP-PRRSV入侵宿主细胞的另一种途径。除HP-PRRSV外,其他PRRSV毒株是否也能通过此途径入侵宿主细胞还需进一步验证。

4 小结和展望

综上所述,PRRSV通过自身囊膜与宿主细胞质膜直接膜融合、CME、脂筏介导的内吞途径和巨胞饮多种途径入侵宿主细胞。然而,PRRSV入侵途径研究领域仍然存在诸多问题有待解答,例如,膜融合、CME、脂筏介导的内吞途径和巨胞饮这些入侵途径的分子机制尚未完全阐明,包括调控的信号通路、参与其中的宿主和病毒蛋白及其相互作用等;又如,上述入侵途径如何在PRRSV感染过程中协同发挥作用以及哪种入侵途径发挥主要作用;再如,国内外学者新发现PRRSV还可利用纳米管(Nanotubes)[30]、外泌体(Exosomes)[31]等非传统入侵途径进行宿主细胞之间的传播,所以随着研究技术手段的进步,可能会鉴定出新的病毒入侵途径。因此,持续研究PRRSV入侵宿主细胞途径及其分子机制,可为疫苗和抗病毒药物等抗病毒策略开发提供新的参考。对此,目前已发现抗菌肽(Antimicrobial peptides)、黄绵马酸AB(Flavaspidic acid AB)、甘草酸(Glycyrrhizin)、姜黄素(Curcumin)和ι-卡拉胶(Iota-carrageenan)等能够在细胞水平通过阻碍PRRSV入侵,抑制病毒感染;另已证实25-羟基胆固醇(25-hydroxycholesterol)和楸毒素(Rottlerin)等可在猪体内干扰PRRSV入侵,发挥较强的抗病毒效果,具有较好的应用前景[21,32]。