B 亚型新等位基因803delC 的分子生物学研究

王立萍 于晓梅 李书杰 李希 冀宝军 李新菊 孙福廷

(潍坊市人民医院 输血科，山东 潍坊 261041)

在人类血型系统中，ABO 血型系统的抗原性最强，ABO血型鉴定的准确性直接关系到患者生命安全[1]。 导致B 抗原变异的主要原因是B等位基因突变，B等位基因编码α-1，3-D-半乳糖转移酶，将α-D-半乳糖连接到底物H 糖链上，形成B 抗原[2]。 目前，经血清学和分子生物学验证并由国际输血协会确认的ISBT 命名的除正常B 血型外，还有抗原性减弱的B 变异型，主要有B3、Bel 和Bw[3]。 我们在对1 例正定O 型，反定B 型的患者标本进行研究，发现在B等位基因第7 外显子存在1 个新的碱基错义突变，造成B 抗原变异表型，报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

患者，女，36 岁，既往无输血史，无妊娠史。 因子宫肌瘤拟行手术治疗于2023 年2 月入住潍坊市人民医院北辰院区。 在常规术前备血时发现ABO 血型正、反定型不符，需进一步试验确定ABO 血型。

1.2 血清学主要试剂与方法

4 种微柱法血型鉴定试剂(长春博迅，批号:20220905；英国奥森多，批号:ABR356F；基立福，批号:22021.02；深圳爱康，批号:20221201)；单克隆抗-A、抗-B 血清(上海血液生物医药，批号:20220701)；抗-H 血清(荷兰Sanquin，批号:8000249550)。 应用全自动血型分析仪进行ABO 血型检测，同时采用经典试管法复检血型正、反定型，吸收放散试验及唾液ABH 物质测定严格按照文献[1]操作。

1.3 PCR-SSP 法检测ABO 血型基因

按照核酸提取及纯化试剂盒说明书提取全血标本DNA(EDTA 抗凝)，调整DNA 浓度30 ～50 ng/μL、A260/A280值1.6～2.0。 进行ABO基因分型检测。 严格按照试剂盒说明书操作[人类红细胞ABO 血型基因分型试剂盒(PCR-SSP法)，天津秀鹏生物，批号:K202212003]。 扩增条件如下，运行段:96℃2 min；96℃20 s，68℃60 s，5 个循环；96℃20 s，65℃45 s，72℃30 s，10 个循环；96℃20 s，62℃45 s，72℃30 s，15 个循环；72℃3 min，4℃保存。 琼脂糖凝胶电泳判定结果。

1.4 Sanger 测序ABO 基因1～7 外显子

对该例标本，先后进行ABO基因1 ～7 外显子编码区域双链测序和B基因克隆测序，以确定突变位点以及突变点所在基因具体位置。 根据NCBI 提供的ABO基因序列信息(NG_006669.2)设计ABO基因第1～7 外显子的测序引物以及ABO-B等位基因第7 外显子克隆测序引物。 采用Sanger测序法，将目的片段进行扩增后，测序仪进行测序。 测序扩增条件如下，运行段:96℃2 min；96℃20 s，68℃60 s，5 个循环；96℃20 s，64℃50 s，72℃90 s，10 个循环；96℃20 s，61℃50 s，72℃90 s，25 个循环；72℃4 min，4℃保存。 扩增产物使用琼脂糖凝胶确定产物条带均一且亮度足够后，进行测序。 使用chromespro 软件以及DNAMAN8.0 软件将测序的.ab1 序列与ABO 基因参考序列(NG_006669.2)进行比对，参比ISBT 数据库[Names for ABO (ISBT 001) blood group alleles v1.1 171023]确定基因型及命名。

2 结果

2.1 血清学检测ABO 血型

应用4 种不同品牌的血型卡鉴定患者ABO 血型，正定型为O 型，反定型为B 型，具体情况见图1。

图1 4 种品牌ABO 血型卡血型结果Figure1 Results of four brands of blood type cards

试管法检测结果与微柱法检测结果一致。 血型正定型均为O 型，反定型为B 型。 患者试管法血清学试验汇总结果见表1。

表1 试管法血清学试验结果Table 1 Results of test tube serological test

唾液ABH 物质测定未检出A、B 和H 血型物质，由于实验室条件所限，未做红细胞Lewis 表型及分泌基因等相关检测，患者是否为非分泌型有待进一步验证。

2.2 PCR-SSP 法检测ABO 血型基因

按照人类红细胞ABO 血型基因分型试剂盒读板纸判读结果为AO1 型(图2)。

图2 PCR-SSP 法ABO 血型基因检测结果Figure 2 Results of ABO genotyping by PCR-SSP

2.3 Sanger 测序

ABO基因1～7 外显子直接测序结果对比NCBI 数据库中ABO基因参考序列(NG_006669.2)，显示1 ～5 外显子未检测出突变，6、7 外显子突变点在ABO*B.01/ABO*O.01.01的基础上，第7 外显子803 位置缺失C 碱基，从而导致多肽链上发生p.Ala268Gly 和p.Phe269Ser 的氨基酸替换，并且从269 位置开始产生新的开放阅读框，新的开放阅读框第20 号氨基酸为终止密码子，导致B基因表达终止。 测序图谱见图3。 结合血清学结果分析，推测该突变可能位于B基因上，导致B 抗原表达缺失。 因为803 位置是所用ABO 血型基因分型试剂盒设计的A基因和B基因特异性区别点，所以导致PCR-SSP 基因分型检测结果为A基因。

图3 ABO 基因外显子7 测序结果Figure 3 ABO gene exon 7 sequencing result

为了进一步确定杂合突变所在染色体等位基因位置是位于ABO*B.01 还是ABO*O.01.01，进行ABO-B基因克隆测序，结果见图4。 克隆测序证明突变点位于ABO-B基因上，该标本第7 外显子在ABO*B.01 的基础上，发生803 位置缺失C 碱基的突变，属于新的ABO-B等位基因，NCBI 收录编号为OR343908。

图4 B 基因外显子7 克隆测序结果Figure 4 Clone sequencing result of B gene exon 7

3 讨论

ABO 血型系统是人类发现的第1 个红细胞血型系统。准确鉴定血型在临床输血、移植、法医学等工作中具有重要意义[4]。 研究证实ABO 血型基因是复等位基因，位于染色体9q34.1～9q34.2，含7 个外显子，超过90%的编码序列在第6 以及第7 外显子上[5]。 ABO 血型除了最常见的A、B、O和AB 型4 种之外，还存在一些亚型。 这些亚型血清学常表现为正、反定型不一致，同时由于病理、生理等因素也会造成正、反定型不一致。 遇到这种情况仅靠血清学很难准确鉴定患者血型，需要采用血清学联合分子生物学手段判断[6-11]。

该患者血型血清学显示ABO 正定型未检测出A、B 抗原，反定型仅检测出抗-A，推测可能为B 亚型。ABO基因分型检测显示患者为A/O 型，与血清学结果不一致，故怀疑存在试剂盒检测范围以外的突变点，进行ABO基因外显子1～7 编码区域测序，Sanger 双链测序结果为ABO*B.01/ABO*O.01.01 (c.803delC)；为了进一步确定杂合突变是位于ABO*B.01 还是ABO*O.01.01，对B基因外显子7 进行克隆测序。 克隆测序结果显示患者ABO*B.01 基因序列中第803 位碱基发生了点缺失C。 因为803G＞C 位置是A基因和B基因特异性区别点，试验中所用人类红细胞ABO 血型基因分型试剂盒设计原理是在803 位置区分A基因和B基因，这是导致PCR-SSP 基因分型检测成A基因的原因。 本例标本803delC 最终导致多肽链上发生p.Ala268Gly 和p.Phe269Ser 的氨基酸替换，并且从269 位置开始产生新的开放阅读框，新的开放阅读框第20 号氨基酸为终止密码子，导致B 基因表达移码突变造成终止，笔者推测以上机理是造成B 抗原缺失的原因。 如要了解该患者B 变异等位基因是否遵循孟德尔遗传规律，具有稳定遗传并显性表达，未来可进一步对其做3 代家系调查。 该突变被NCBI 数据库收录，序列号为OR343908。

笔者通过多项血清学实验均无法准确鉴定患者血型，最终通过分子生物学方法揭示了患者血型异常表达的原因。 目前基因检测方法结合血清学检测，成为准确鉴定疑难血型重要手段[12-15]。

本研究提示，利用分子生物学手段可以明确区分抗原表达异常是ABO 亚型所致，还是受病理、生理等因素影响导致。 如果是受病理、生理等因素影响，明确血型后选择同型血液输注；如果是血型亚型所致，因同型亚型获取困难，不同的亚型结合其血清学特点可采取不同的输血方案。 该例亚型可以考虑输注O 型洗涤红细胞或自体输血。 该患者拟行子宫肌瘤手术，身体各项指标符合自体输血的条件。 经与患者积极沟通，征得同意并签署《自体血采集知情同意书》，应用血细胞分离机为其采集300 mL 浓缩红细胞，采集过程顺利，无任何采血不良反应。 手术过程中仅输注预先储备的自体红细胞，既满足手术需要，输注过程又无任何输血不良反应。

多种血清学试验均未在该例标本中检测到B 抗原表达，笔者猜测可能与ABO基因第7 外显子的803C 作为B基因的特征性位点在B 抗原的表达中起到关键作用有关，803delC 导致的蛋白质分子三维空间结构以及功能的改变有待做进一步的蛋白质构象检测去验证。

利益冲突说明/Conflict of Interests

所有作者均声明不存在利益冲突。

伦理批准及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本文不涉及伦理审批及知情同意。

作者贡献/Authors' Contribution

王立萍:论文撰写；于晓梅:标本收集；李书杰:实验操作、结果分析； 李希:实验操作； 冀宝军:论文修改；李新菊:参与论文撰写与修改；孙福廷:项目设计指导、论文审核。

致谢/Acknowledgement

感谢天津市秀鹏生物技术开发有限公司、卫健委血型基因检测联合参比(江阴)实验室技术支持。