聚合人脐带血红蛋白增敏乳腺癌小鼠化学免疫疗法治疗效果的初步研究

郑诗凡 周文涛 李燊 吴嘉康 游训仪 刘嘉馨 王红

(中国医学科学院北京协和医学院输血研究所，四川 成都 610052)

2020 年世界卫生组织WHO 发布的癌症分布类型中乳腺癌新增人数首次超肺癌，成为全球第一大癌症[1]。 乳腺癌中恶性程度最高、五年生存率最低的是三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)，过去治疗方案仅为化疗，常用化疗药物为多柔比星(Doxorubicin，DOX)。 近年来，美国食品药品监督管理局(FDA)批准PD-1 抑制剂用于高风险的早期三阴性乳腺癌的辅助化学治疗， PD-1 抑制剂通过抑制体内免疫检查点分子发挥作用，可触发体内免疫系统特异性识别、追踪、破坏肿瘤细胞，是较为理想的肿瘤免疫治疗方案。 然而，TNBC 属于免疫细胞浸润少、免疫应答弱的“冷肿瘤”，导致PD-1 抑制剂临床疗效受限[2]。 因此中国临床肿瘤学会(CSCO)指南仅推荐化疗药联合PD-1 抑制剂疗法为三线治疗方案[3]。

研究发现[4-6]，缺氧是几乎所有实体瘤的典型微环境特征，在缺氧环境中生长的癌细胞，其在肿瘤发展中增殖、转移、侵袭性明显高于正常含氧量中生长的癌细胞。 缺氧对癌细胞的生物学行为和恶性表型具有深刻的影响，与各种癌症患者的不良预后密切相关[7]。 为提高TNBC 肿瘤治疗效果，研究缺氧与肿瘤微环境的关系是十分有必要的。 研究表明，缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α) 介导的对缺氧的适应性反应会赋予乳腺癌细胞更具侵袭性和治疗抗性的表型[8]。 缺氧除了公认的诱发和促进对化疗药物的耐药，还通过控制血管生成和促进免疫逃逸和肿瘤抵抗来引起免疫抑制[9]，因此，为最大限度地提高临床放化疗或免疫治疗TNBC 的肿瘤治疗效果，增加肿瘤内部氧供的方法可能是有前景的治疗策略。

血红蛋白类氧载体研发初衷是用于替代红细胞，减轻输血压力。 随着深入持续研究，科学家们利用血红蛋白类氧载体纳米级粒径和低粘度的特性，使氧载体粒子通过紊乱肿瘤血管网进行供氧，达到增敏肿瘤治疗的目的。 本课题组研发的聚合人脐带血红蛋白(polymerized human cord hemoglobin，PolyCHb)属于聚合形成的血红蛋白类氧载体，可以增敏不同肿瘤化疗疗效[10-11]。 本文采用小鼠模型建立乳腺原位癌，模拟TNBC 的生长状态，并观察PolyCHb 增敏免疫化疗的有效性，报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料与仪器

聚合人脐带血红蛋白(批号:20220418，来源于中国医学科学院输血研究所输血医学工程中心组)；氧亲和力(P50):14.36 torr(图1)，主要理化指标见表1。 PD-1 抑制剂(a-PD-1)(货号BE0146，BIOXCELL)，RPMI1640 基础培养基(货号C3010-0500，Viva cell)；DOX(货号HY-15142， MCE)； 磷酸缓冲液(PBS) (货号SH30256.01，Hyclone)；HIF-1α 抗体(货号bs-20399R，BIOSS)；胰蛋白酶(货号0457，Amresco)；胎牛血清(FBS) (货号10270-106， Gibco)革兰氏染液(货号G1065，武汉塞维尔)；DAB(货号SA-HRP，Servicebio)；TUNEL试剂盒(货号G1507，Servicebio)；双氧水(货号10011218，国药集团)；苏木素染液(货号BL700B，Biosharp)；DAB 显色剂(货号BL732A，Biosharp)；CO2恒温培养箱(型号MCO-18AC，Panasonic)；冰冻切片机(型号CRYOSTAR NX50，Thermo)；脱水机(货号JB-12S， 武汉俊杰电子)；石蜡包埋机(型号TB-L5，武汉俊杰电子)；病理切片机(型号RM2016，上海莱卡)；烤箱(型号101-3B，绍兴沪越)；正置荧光显微镜(型号MF23-LED，明美光学)；成像系统(型号MSX2，明美光学)；切片扫描仪(型号Pannoramic MIDI II，3D-HISTECH)。

图1 PolyCHb 的氧解离曲线Figure 1 Oxygen dissociation curve of PolyCHb

表1 PolyCHb 制品主要理化指标Table 1 Main physical and chemical indexes of PolyCHb products

1.2 实验动物与细胞株来源

SPF 级雌性BALB/c小鼠，4 ～6 周龄，体质量(20±2)g(购自成都达硕实验动物有限公司)，给与足量食物和水饲养，饲养温度保持在(24±2)℃。小鼠乳腺癌4T1 细胞1 株(购自上海酶研生物科技有限公司)。

1.3 小鼠4T1 乳腺原位瘤模型建立

使用含10%FBS 的RPMI1640 完全培养基培养4T1 细胞，细胞培养箱37℃、5%CO2条件下培养1～2 周；待细胞处于对数生长期时收集细胞，配置成细胞密度为1×107个/mL 的细胞悬液备用。 将50 μL 细胞悬液接种至小鼠右侧第四对乳腺脂肪垫处，接种完成继续饲养约1 周，待肿瘤体积达到120 mm3左右时可进行下一步实验。

1.4 实验动物分组和用药

将15 只肿瘤小鼠随机均分为3 组，空白组:无干预；对照组:DOX+a-PD-1 治疗，腹腔注射DOX 5 mg·kg-1、1 次/周，腹腔注射a-PD-1 12.5 mg·kg-1、1 次/周，a-PD-1 于DOX 给药后1d 注射；实验组:DOX+a-PD-1+PolyCHb 治疗，DOX 和a-PD-1 用法同上，PolyCHb:尾静脉注射PolyCHb 600 mg·kg-1、3 次/周；PolyCHb 于DOX 给药后3 h 注射；给药周期为4 周。

1.5 绘制肿瘤生长曲线及计算抑瘤率

使用游标卡尺每周测量小鼠肿瘤长径(mm)和短径(mm)3 次；根据公式计算肿瘤体积和抑瘤率，肿瘤体积计算公式:肿瘤体积(mm3)= 1/2×(肿瘤长径×肿瘤短径2)，抑瘤率计算公式:抑瘤率(%)=(空白组平均瘤体积-计算组瘤体积)/空白组平均瘤体积×100%；29 d，颈椎脱臼处死所有小鼠，剥瘤称取瘤重并做各项实验检测。

1.6 肿瘤组织免疫荧光发检测HIF-1α

将肿瘤组织固定后放入脱水机完全脱水，脱水后将组织进行石蜡包埋和切片并再次脱水；滴加组织自发荧光淬灭剂A 液覆盖组织室温孵育30 min，纯水洗涤5 min； 5%山羊血清工作液室温封闭30 min；轻轻甩掉封闭液，切片与一抗在4℃孵育过夜； PBS 洗涤3 次，再与相应种属的二抗室温孵育50 min；PBS 洗涤3 次，复染DAPI；洗涤3 次，滴加自发荧光淬灭剂B 液覆盖组织，室温避光孵育5 min，流水冲洗3 min；轻甩干后封片；显微镜观察并采集图像；采用Image-Pro Plus 图像分析系统分析数据。

1.7 肿瘤组织HE 病理检测

使用4%多聚甲醛固定肿瘤组织，经梯度乙醇脱水、石蜡包埋后，于病理切片机进行切片；60℃烘箱烤片；二甲苯和乙醇对病理切片进行脱蜡至水化；苏木素染色3 min 30 s，伊红染色2 min；最后脱水封片；镜检分析肿瘤病理情况。

1.8 肿瘤组织TUNEL 凋亡检测

肿瘤组织经4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、石蜡包埋后，于病理切片机进行切片；60℃烘箱烤片；脱蜡至水化； 3%过氧化氢溶液孵育25 min；PBS 洗涤3 次，每次5 min；按照TUNEL 试剂盒说明书进行标记；PBS 洗涤3 次，每次5 min； DAB 显色； 苏木素复染细胞核；脱水封片并镜检；每张片随机选取3 个视野，计数肿瘤细胞凋亡阳性率，取其平均值作为该张片子肿瘤细胞凋亡阳性率。

1.9 肿瘤组织免疫组化法检测Ki67

肿瘤组织经4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、石蜡包埋后，于病理切片机进行切片；60℃烘箱烤片；二甲苯和乙醇对病理切片进行脱蜡至水化；3%过氧化氢溶液孵育25 min；PBS 洗涤3 次，每次5 min；5%山羊血清封闭30 min；一抗4℃孵育过夜；PBS 洗涤3 次，每次5 min；二抗室温孵育30 min；PBS 洗涤3 次，每次5 min；DAB 显色；苏木素复染细胞核；最后脱水封片并镜检。

1.10 统计学分析

采用Graph Pad8.0 软件处理和分析数据，符合正态分布的计量资料结果用“均数±标准差(±s) ”表示，两组样本比较采用独立样本t检验，多组样本比较采用单因素方差检验，多组样本间事后检验采用Turkey 检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫化疗+PolyCHb 能提升乳腺癌原位瘤小鼠的抑瘤率

至28 d 时，空白组、对照组、实验组肿瘤体积(mm3)分别为:1 682.82±192.28、1 314.67±282.98、607.340±155.75(F=31.71，P＜0.000 1)(图2A)，DOX+ a-PD-1+PolyCHb 治疗后肿瘤体积显著低于空白组、对照组(P＜0.05)。 对照组和实验组抑瘤率(%)分别为21.5±16.43、66.19±6.46，实验组和对照组相比差异有统计学差异(t=5.659，P＜0.05)。实验结束(29 d)，剥取实体瘤称取肿瘤重量(g)，三组结果分别为1.84±0.35、1.48±0.31、0.44±0.20(F=30.73，P＜0.001)(图2B)，实验组肿瘤重量显著低于空白组、对照组(P＜0.05)。

图2 各组小鼠在实验期间的原位瘤体积生长Figure 2 In situ tumor volume growth of mice in each group during the experiment

2.2 免疫化疗+PolyCHb 能降低乳腺癌原位瘤小鼠肿瘤组织HIF -1α 含量

荧光显微镜下HIF-1α 检测:空白组、对照组、实验组肿瘤组织平均光密度分别为: 0.016 36±0.003 06，0.002 42±0.000 22， 0.000 20±0.000 03，实验组和对照组比较差异有统计学差异(t=17.41，P＜0.001)(图3)。

2.3 免疫化疗+PolyCHb 能降低乳腺癌原位瘤小鼠肿瘤组织的病理病变

空白组肿瘤生长区明显深染，细胞排列密集生长旺盛，胞核核仁明显，核分裂象多见，坏死区及生长区交界处少量炎细胞浸润。 对照组肿瘤生长区细胞紧密度，胞核核仁明显，可见核分裂，与空白组比较，细胞排列较稀疏，异型性减弱。 实验组肿瘤细胞染色最浅，排列最为稀疏，生长最弱，坏死区及生长区交界处炎细胞增多(图4)。

图4 各组小鼠肿瘤组织的HE 染色Figure 4 HE staining of tumor tissues of mice in each group

2.4 免疫化疗+PolyCHb 能提高乳腺癌原位瘤小鼠肿瘤组织细胞凋亡率

空白组、对照组、实验组肿瘤组织细胞凋亡阳性率(%) 分别为18.79±0.62 、20.68±1.19、41.65±2.99(F=135.2，P＜0.001)，实验组与其余两组相比差异有统计学差异(P＜0.05) (图5)。

图5 各组小鼠肿瘤组织细胞凋亡情况Figure 5 Apoptosis of tumor cells in mice in each group

2.5 免疫化疗+PolyCHb 能降低乳腺癌原位瘤小鼠肿瘤组织Ki67 含量

空白组、对照组、实验组肿瘤组织平均光密度分别为:分别为0.010 2±0.004 1、0.003 1±0.000 3、0.000 8±0.000 1，实验组与对照组比较差异有统计学差异(t=11.20，P＜0.001)(图6)。

图6 各组小鼠肿瘤组织Ki67 含量检测Figure 6 Detection of Ki67 content in tumor tissue of mice in each group

3 讨论

TNBC 是1 种免疫细胞浸润较少、免疫应答较弱的“冷肿瘤”，新兴的免疫治疗在TNBC 中效果较为局限，因此其临床常用的药物治疗方案仅为化疗[12]。 研究发现，缺氧条件下的肿瘤细胞能够通过多种机制抑制免疫细胞的活性，降低免疫细胞对肿瘤细胞的识别和消灭能力。 这种抑制作用可能导致免疫逃逸和加强肿瘤的进展[9]。 最近的研究表明，通过针对缺氧环境下的肿瘤细胞进行治疗，可以逆转这种免疫抑制的状态，恢复免疫细胞的功能，从而增强免疫系统对肿瘤的攻击能力[13-15]。 以缺氧作为靶点进行治疗，不仅可以破坏肿瘤细胞的适应性和侵袭能力，还可以恢复免疫细胞的功能，增强对肿瘤的免疫应答。 因此，针对TNBC 的治疗而言，通过针对改善肿瘤部位缺氧环境可能对有增强免疫治疗的效果。

本团队之前研究结果显示，PolyCHb 可增强裸鼠肝癌和胰腺癌皮下移植瘤对化疗的敏感性[10-11]。在此基础上，本研究进一步优化了动物肿瘤研究模型，选用免疫系统正常的Babl/C 小鼠建立原位4T1肿瘤模型以模拟TNBC 肿瘤，然后使用PolyCHb 对化学免疫疗法进行干预。

对实验结果进行分析发现: 联合PolyCHb 治疗的实验组显示出抑制肿瘤生长的趋势和减小肿瘤体积效果(图2A)，15 d 时，肿瘤体积开始降低，到实验终点时，实验组与对照组相比肿瘤体积显著降低(P＜0.05)。 并且，PolyCHb 联合治疗后的抑瘤率达到了66.19%，是对照组抑瘤率的3 倍(P＜0.05)。 此外，实验组肿瘤体重大大降低，均＜1 g(图2B)。 这表明，PolyCHb 在化学免疫疗法中起到了增敏作用，显著提升了免疫化疗敏感性，该结果可能与PolyCHb 进入小鼠体内后在低氧环境中释放氧气有关[16]。

使用免疫荧光法检测肿瘤部位低氧指标HIF-1α 的含量，结果显示，实验组中的HIF-1α 水平显著降低(图3)，说明PolyCHb 可到达肿瘤部位缓解缺氧微环境。 肿瘤缺氧通过介导HIF-1α 直接或间接调控着肿瘤的发生、生长及转移[17]，并且会最大限度地降低临床放化疗或免疫治疗等抗肿瘤治疗[18]。 有研究指出HIF-1α 会减弱免疫应答，降低抑瘤免疫细胞(毒性T 淋巴细胞、M1 型肿瘤相关巨噬细胞、自然杀伤细胞等)的数量、增加促瘤免疫细胞(调节性T 细胞、髓源性抑制细胞、M1 型肿瘤相关巨噬细胞等)的浸润[19-25]。 此外，HIF-1α 的激活也会增加肿瘤细胞上PD-L1 的表达，进一步抑制免疫反应[2]。 因此，缓解肿瘤缺氧微环境对肿瘤治疗具有积极作用。

在HE 和TUNEL 结果中观察到，实验组肿瘤细胞染色最浅，排列最为稀疏，生长最弱，肿瘤细胞凋亡率最高(图4 ～5)。 此外，Ki67 作为肿瘤增殖指标也对实验结果进一步验证，结果显示PolyCHb干预后Ki67 表达显著降低，实验组与对照组比较有统计学差异(图6)。 Ki67 被广泛运用于乳腺癌的分析分型和预后评估中[26-27]，有研究指出，通过减少HIF-1α 的表达可以降低肿瘤细胞Ki67 的表达[28-29]。 以上结果进一步证明了PolyCHb 联合化学免疫疗法对乳腺瘤有积极的抗肿瘤效果。

本研究仍存在改进空间，可进一步提升实验动物数量，优化给药剂量和给药频率。 深入研究将有助于探究PolyCHb 在抑制肿瘤中的具体作用机制，推动其在临床中的应用，提高肿瘤治疗的效果。

综上所述， PolyCHb 联合免疫和化疗药可显著延缓乳腺原位瘤的肿瘤生长速度、降低肿瘤体积和重量，并下调HIF-1α 的表达，增加肿瘤细胞的坏死和凋亡，同时降低肿瘤增殖指标Ki67 表达(图2 ～6)。 该方法有望成为临床乳腺癌治疗的1 种有前景的策略。

利益冲突说明/Conflict of Interests

所有作者均声明不存在利益冲突。

伦理批准及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

实验动物的管理和使用已通过中国医学科学院输血研究所伦理审查委员会评审(审批号:NO:2022037)。

作者贡献/Authors' Contribution

郑诗凡:实验实施、数据分析、论文撰写等；吴嘉康、游训仪:实验实施；周文涛、李燊:论文校对；刘嘉馨、王红:实验设计、论文审核、资金提供。

致谢/Acknowledgement

感谢成都奥创生物科技有限公司对本研究提供的技术支持。