血小板lncRNA 在肺腺癌早期筛查中的生物标志物初步研究

熊博雯 尹兴 罗怀超 刘鱼

(1.中国医学科学院北京协和医学院输血研究所，四川 成都 610052；2.四川省肿瘤医院 检验科)

肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤[1]，肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)是最常见的肺癌亚型，约占全部肺癌病例的50%[2]。 肺癌早期阶段缺乏特异性临床表现，约70%的患者确诊时已处于局部晚期或发生远处转移[3]。 因此，肺癌的筛查和早期诊断对于制定最佳治疗策略及提高预后效果尤为重要。

目前肺癌的早期筛查方法主要为胸部低剂量CT(low-dose CT，LDCT)，但LDCT 具有高成本、高假阳性率和辐射剂量累积性等限制[4]。 临床上肺癌辅助诊断最常用的血清肿瘤标志物是癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)，但其敏感性较低[5]，尚不能满足临床对肺癌早筛的需求。 近年来，液体活检成为癌症无创早期检测和病程监测的重要工具，血小板是液体活检重要生物样本来源之一[6]。 血小板不仅在止血、炎症反应中发挥重要作用，同时也是肿瘤发生发展中的重要参与者和全身应答者[7]。 血小板在肿瘤微环境中与肿瘤细胞相互作用后，其RNA 谱会发生特异性改变。 已有多项研究表明血小板RNA 谱能够作为肿瘤标志物用于癌症的诊断[8]。

长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA) 是指长度大于200 个核苷酸且无蛋白质编码功能的RNA，具有组织特异性和疾病特征性，通过多种作用模式参与人类癌症进展[9]。 有研究发现 血 小 板 lncRNA MAGI2-AS3、 ZFAS1、 linc-GTF2H2-1 、RP3-466P17.2 和lnc-ST8SIA4-12 在肺癌患者与对照组间差异表达，表明血小板lncRNA可作为肺癌诊断标志物[10，11]。 本研究旨在探索早期肺腺癌患者与健康人群之间血小板lncRNA 谱的差异，为肺腺癌的早期筛查诊断提供有价值的液体活检生物标志物。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

血液总 RNA 快速提取试剂盒( 批号B028007023，北京百泰克)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(批号AMG1405A， Takara)、 TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus) (批 号AMG1589A，Takara)、氯仿(批号2018050701，成都科隆化学品)；低速离心机(3-5N，恒诺仪器)、台式高速离心机(Legend Micro 17R，Thermo)、PCR 仪(Biometra Tadvanced，德国耶拿)、荧光定量PCR 仪(CFX96，Bio-Rad)；LINC01088 及内参GAPDH 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 标本来源

选取2022 年9 月—2023 年11 月在四川省肿瘤医院首次接受手术治疗的LUAD 患者。 纳入标准:1)具有基本的临床特征，首次诊断且未做任何放疗、化疗及切除手术等；2)病理结果采用国际癌症控制联盟(union for international concer control，UICC)第8 版肺癌TNM 分类法确认组织学类型为LUAD。 排除标准:1)经手术或活检未确诊的患者；2)患有其他癌症和急性炎症的患者；3)服用过阿司匹林等影响血小板的药物的患者；4)半个月内接受过输血的患者。 LUAD 组共纳入受试者54 名(Ⅰ期37 名，Ⅱ期8 名，Ⅲ期3 名，Ⅳ期6 名)，在受试者入院首日采集EDTA 抗凝血。 另收集51 名同期健康体检者的EDTA 抗凝血设为健康对照组(healthy control，HC)，所有血样在采集后的6 h 内进行血小板的分离。

临床和实验室资料包括:1)一般临床资料:患者性别、年龄、临床病理分期；2)实验室资料:血小板计数(platelet，Plt)和癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)。

1.3 研究方法

1.3.1 数据获取与处理

在GEO 数据库(http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) 检索血小板RNA 测序数据集，包括GSE183635 和GSE89843，所有数据来自同一平台GPL16791。 用在线工具GEO2R 对GSE183635 数据集中的16 名Ⅰ期或Ⅱ期LUAD 患者与26 名无症状健康对照者做差异分析。 用在线工具GEO2R对GSE89843 数据集中的54 名未转移的非小细胞肺癌患者(NSCLC)和96 名健康对照者做差异分析。 以| log2(FoldChange) |＞0.5，P＜0.05 为阈值，筛选基因类型为ncRNA的基因，获得差异表达lncRNA(differentially expressed lncRNA，DElncRNA)。用GEPIA2 (http:/ /gepia2.cancer-pku.cn/) 中的ANOVA 算法分析LUAD 患者肿瘤组织与正常对照组织中DElncRNA 的差异表达。 设定| log2(Fold-Change) |＞0.5，P＜0.05 为差异表达。 LUAD 患者肿瘤组织基因表达数据来自TCGA 数据库，正常对照组织数据来自TCGA 与GTEx 数据库。

1.3.2 血小板的分离

将1.5 mL EDTA 抗凝血以120 g 离心20 min，吸取上层的富血小板血浆(platelet rich plasma，PRP)，将PRP 以360 g 离心20 min，吸去上层的贫血小板血浆(platelet poor plasma，PPP)，沉淀于管底的即为血小板。

1.3.3 实时荧光定量PCR 检测血小板LINC01088 水平

使用血液总RNA 快速提取试剂盒提取血小板总RNA，使用Takara PrimeScriptTMRT reagent Kit 试剂将血小板总RNA 逆转录为cDNA。 采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR， qRT-PCR) 检测血小板LINC01088 和内参基因GAPDH 的水平。LINC01088 引物序列为:F:5′- CCTGGCTATCCTGGAGTTTTC，R:5′- TCATATCAGGGACAGGGCTTA；GAPDH 引 物 为:F:5′- ACCCAGAAGACTGTGGATGG，R:5′- TTCAGCTCAGGGATGACCTT。 用2-ΔΔCt表示LINC01088 的相对表达量。

1.4 统计学分析

采用SPSS 26.0 和Graphpad Prism 9 软件进行统计学分析，正态分布的计量资料采用独立样本t检验或Welch′s t 检验作2 组间比较；非正态分布的计量资料，采用Mann-Whiney U 检验作2 组间比较；计数资料以构成比(%)表示，组间比较采用χ2检验；二元Logistic 回归用于构建联合诊断模型，受试者工作(receiver operator characteristic，ROC)曲线用以评价指标的诊断效能，并计算曲线下面积(area under the curve，AUC)和Youden 指数取最大值时的灵敏度和特异度；采用Delong 检验比较各指标间AUC 差异。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 差异lncRNA 的筛选

对GSE183635 数据集中16 名Ⅰ期或Ⅱ期LUAD 患者和26 名无症状健康对照者的血小板RNA测序数据做差异分析，以|log2(FoldChange)|＞0.5，P＜0.05 为阈值，得到8 个DElncRNAs。 LINC01088 和DHRS4-AS1 在早期LUAD 患者血小板中下调，LOC100129034、HIF1A-AS2、LOC105374746、MIR22HG、CEBPB-AS1 和LOC101927556 在早期LUAD 患者血小板中上调(图1A)。 对GSE89843 数据集中54名未转移的NSCLC 患者和96 名无症状健康对照者的血小板RNA 测序数据做差异分析，构建火山图(图1B)，得到1 265 个DElncRNAs，957 个上调lncRNAs，308 个下调lncRNAs，其中差异倍数最大的DElncRNA 为LINC01088，log2(FoldChange)为-1.916。 LINC01088 和DHRS4-AS1 在GSE183635 和GSE89843 数 据 集 中 同 时 下 调， LOC105374746 在GSE183635 和GSE89843 数据集中同时上调(图1C)。

图1 差异lncRNA 的筛选Figure 1 Screening of differentially expressed IncRNA

2.2 差异lncRNA 在组织中的表达

分别比较DHRS4-AS1 和LINC01088 在483 个LUAD 组织和347 个正常对照组织中的表达。 如图2A 所示，DHRS4-AS1 在LUAD 组织中表达较正常对照组织更高，但差异未达到预设值(log2(Fold-Change)= 0.486，P＜0.05)。 LINC01088 在LUAD 组织中的表达水平低于正常对照组织(log2(Fold-Change)= -1.523，P＜0.05)(图2B)，这意味着LINC01088 的低表达可能在LUAD 的发展中具有一定作用，本研究将LINC01088 作为早期LUAD 诊断的候选标志物。

图2 差异lncRNA 在组织中的表达Figure 2 Expression of DElncRNA in tissues

2.3 血小板LINC01088 在肺腺癌患者中下调

为进一步确定LINC01088 在血小板中的差异表达，对收集到的54 名LUAD 患者和51 名健康对照者的血小板进行qRT-PCR 检测。 临床资料如表1 所示，2 组性别、年龄和血小板计数比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。 如图3A 所示，与健康对照组相比，血小板LINC01088 在LUAD 患者中的表达显著降低(P＜0.000 1)。 此外，血小板LINC01088 在45 名早期LUAD 患者与51 名健康对照者相比也显著降低(P＜0.001) (图3B)。

表1 研究对象的基本特征Table 1 Basic characteristics of the study subjects

图3 血小板LINC01088 在肺腺癌患者中下调Figure 3 Platelet LINC01088 is downregulated in lung adenocarcinoma patients

2.4 血小板LINC01088 对LUAD 的诊断价值分析

为检验血小板LINC01088 对LUAD 的诊断能力，绘制图4 所示的ROC 曲线。 血小板LINC01088对LUAD 诊断的AUC 为0.755，灵敏度为81.1%，特异度为67.9%。 CEA 对LUAD 诊断的AUC 为0.662，灵敏度为43.2%，特异度为89.3%(表2)。血小板LINC01088 对早期LUAD 诊断的AUC 为0.727，灵敏度为80.0%，特异度为67.9%。 CEA 对早期LUAD 诊断的AUC 为0.593，灵敏度为33.3%，特异度为89.3%(表3)。 血小板LINC01088 和CEA 的联合诊断模型具有较好的诊断性能，对LUAD 诊断的AUC 为0.807，灵敏度为89.2%，特异度为71.4%；对早期LUAD 诊断的AUC 为0.770，灵敏度为86.7%，特异度为71.4%。 3 种诊断方法的AUC 比较结果显示，血小板LINC01088 与CEA 联合诊断模型优于CEA 对LUAD 及早期LUAD 的诊断效能(Z=-2.288， -2.34，P均＜0.05)(表4)。

表2 血小板LINC01088、CEA 和联合诊断模型对LUAD的诊断效能Table 2 Diagnostic efficacy of platelet LINC01088， CEA，and the combined diagnostic model for LUAD

表3 血小板LINC01088、CEA 和联合诊断模型对早期LUAD 的诊断效能Table 3 Diagnostic efficacy of platelet LINC01088， CEA，and the combined diagnostic model for early LUAD

表4 血小板LINC01088、CEA 和联合诊断模型对LUAD和早期LUAD 诊断的AUC 差异Table 4 Differences in AUC of platelet LINC01088，CEA，and the combined diagnostic model for the diagnosis of LUAD and early LUAD

图4 血小板LINC01088、CEA 和联合诊断模型对LUAD的诊断价值分析Figure 4 Diagnostic outcomes for platelet LINC01088，CEA and the combined diagnostic model in the LUAD

3 讨论

已有多项研究表明血小板RNA 谱可作为癌症诊断、预后或监测的有效液体活检工具[12]，血小板RNA 谱在癌症早期筛查方面的应用潜能有待进一步发掘。 经肿瘤细胞和肿瘤微环境“教育”后发生RNA 谱改变的血小板称之为肿瘤教化血小板(tumor-educated platelets，TEPs)[13]。 Sol 等[14]发现手术切除胶质母细胞瘤后，伴随着肿瘤负荷的降低，血小板被肿瘤“教育”的程度也会降低。 肿瘤患者体内的血小板RNA 谱受到肿瘤病理生理条件的动态影响，肿瘤发展的不同阶段可能呈现不同的血小板RNA 谱，然而此前对血小板lncRNA 谱的研究尚未对癌症的不同分期进行区分。 另外，Antunes-Ferreira 等[15]表示用晚期癌症标本为主训练出的血小板RNA 诊断算法在识别早期NSCLC 个体方面表现不足，将早期NSCLC 标本纳入算法训练过程可提高早期标本的检出率且不会显著降低晚期标本的检出率。 因此本研究对早期LUAD 患者与无症状健康人群的血小板lncRNA 谱进行差异分析，发现血小板LNC01088 在早期LUAD 患者中的特异性下调，血小板LINC0188 可能具有作为LUAD 早期筛查标志物的潜能。

LINC01088 是位于4 号染色体上的基因间型长链非编码RNA，此前有多项研究发现LINC01088在不同肿瘤中通过不同机制发挥着不同作用。 例如LINC01088 通过LINC01088/miR-24-1-5p/PAK4轴抑制卵巢上皮细胞的肿瘤发生[16]， 并且LINC01088 在上皮性卵巢肿瘤组织中下调，其下调与上皮性卵巢癌患者的不良预后有关[17]。LINC01088 在胃癌组织和细胞系中表达显着降低，通过ceRNA 机制调控miR-95/LATS2 通路，抑制胃癌细胞的生长、侵袭和迁移[18]。 LINC01088 在食管鳞癌中下调，通过靶向NPM1-HDM2-p53 轴抑制食管鳞癌进展[19]。 还有研究表明LINC01088 在前列腺癌中上调，通过LINC01088/miR-22/CDC6 轴激活PI3K/AKT 通路调节前列腺癌[20]。 结直肠癌细胞系和结直肠癌组织中的LINC01088 显著上调，结肠癌组织中上调的LINC01088 通过调节microRNA/G3BP1/PD-L1 轴促进结直肠癌的恶性表型和免疫逃逸，并且高水平LINC01088 与结直肠癌患者的不良结局相关[21]。 LINC01088 也在神经胶质瘤组织中显着上调，通过调控小核糖核蛋白多肽A(SNRPA)转录促进胶质瘤细胞的生长和侵袭[22]。这些研究表明LINC01088 在肿瘤的发生发展中作用复杂，可能发挥着双重作用，在某些癌症中促进肿瘤发生发展，而在某些癌症中抑制肿瘤的发生发展。 此前有研究发现肺鳞癌原发肿瘤标本中LINC01088 的高表达与不良预后相关[23]。 本研究通过GEPIA2 分析首次发现LINC01088 在LUAD组织中的表达水平低于正常肺组织，这意味着LINC01088 可能在LUAD 的发生发展中发挥抑癌作用，未来需进一步阐明LINC01088 在LUAD 发生发展中的生物学作用和肿瘤学意义。

本研究发现并验证了LINC01088 在LUAD 患者血小板中的下调，表明血小板可以反映来自肿瘤的信息。 在肿瘤的发生发展中，血小板与肿瘤微环境以及肿瘤细胞之间存在着复杂的相互作用。 一方面，肿瘤细胞以直接或间接的方式通过不同的信号分子或受体影响血小板，改变血小板RNA 谱。另一方面，血小板可以吸收或携带来自肿瘤细胞的RNA，还可以通过释放血小板来源的细胞外囊泡向外传递RNA[24]。 然而，LINC01088 在LUAD 患者血小板中下调的机制，以及血小板LINC01088 在LUAD 发生发展中的生物学作用有待进一步研究。

本研究评价了血小板LINC01088 对LUAD 具有较好的诊断能力，其对LUAD 诊断的AUC 为0.755，灵敏度为81.1%，特异度为67.9%。 在早期LUAD 诊断中，AUC 为0.727，灵敏度为80.0%，特异度为67.9%。 目前临床常用的血清肿瘤标志物中，对于肺癌诊断尤其是对于肺腺癌的诊断，表现最佳的是CEA。 但CEA 的灵敏度较低，因此对于早期肺癌表现出较差的诊断效能[5]。 本研究中，CEA 对LUAD 诊断的灵敏度为43.2%，特异度为89.3%，测试结果与其他文献报道基本一致。 本研究还发现，血小板LINC01088 与CEA 构成的联合诊断模型对LUAD 和早期LUAD 的诊断效能明显优于CEA，这一发现未来将进一步在更大样本量的队列中进行验证。

近年，血小板因数量大、易分离和包含相对较高质量的RNA 等优势成为液体活检极具发展前景的标本来源，用以癌症的辅助诊断、疗效预测和指导治疗等[25]。 本研究通过对早期LUAD 患者与无症状健康对照的血小板lncRNA 谱进行差异分析，发掘出差异表达的血小板LINC01088。 通过GEPIA2 分析发现，与正常肺组织相比，LINC01088 在LUAD 组织中的表达水平更低。 本研究验证了血小板LINC01088 在LUAD 患者中的特异性下调，评价了血小板LINC01088 对LUAD 患者的早期诊断效能，构建了血小板LINC01088 与CEA 的联合诊断模型。 本研究拓宽了血小板lncRNA 在肿瘤液体活检中作为生物标志物的应用范围，为LUAD 的早期筛查提供了新的方向。

利益冲突说明/Conflict of Interests

所有作者均声明不存在利益冲突。

伦理批准及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究通过四川省肿瘤医院伦理委员会批准(SCCHEC-02-2020-043)。 本研究豁免患者知情同意。

作者贡献/Authors' Contribution

熊博雯:整理文献、设计研究、实施实验、审核数据、统计分析、撰写文章；尹兴:采集标本、采集病例、采集病史、收集数据；罗怀超:对文章知识性内容做批判性审阅，文章学术性与专业性校对；刘鱼:文章全面把关并审核，指导修改论文、确认终稿、定稿。