转录因子HNF1α基因c.493T>C位点突变对其蛋白质水平的影响

梁淑杰，彭乙华，雷佳红，贾艾敏，蒋红，蔡燕1,,,5

研究快报

转录因子基因c.493T>C位点突变对其蛋白质水平的影响

梁淑杰4，彭乙华2，雷佳红3，贾艾敏3，蒋红3，蔡燕1,3,4,5

1. 川北医学院附属医院遗传与产前诊断中心，南充 637000 2. 川北医学院附属医院内分泌科，南充 637000 3. 川北医学院附属医院风湿免疫研究所，南充 637000 4. 川北医学院检验医学院，南充 637000 5. 川北医学院转化医学研究中心，南充 637000

肝细胞核因子1α (hepatocyte nuclear factor 1α，HNF1α)作为一种转录因子在维持胰腺β细胞功能、肝脏脂质代谢等过程中发挥着重要的调控作用。该基因突变是导致青少年起病的成人型糖尿病(maturity onset diabetes of the young，MODY)3型的致病原因，目前已报道的该基因的突变位点众多，如P291fsinsC、P112L等常见的突变位点，但其具体的分子机制尚不清楚。本研究对前期工作中发现的1例携带有基因c.493T>C位点突变的MODY3患者，通过应用Mutation Surveyor软件分析突变位点的致病性，构建野生型和突变型真核表达质粒，采用Western blot检测两种质粒表达的HNF1α蛋白质的量和稳定性变化，结果发现Mutation Surveyor软件分析提示c.493T>C位点突变可能为致病性变异基因，Western blot显示突变型真核质粒表达的HNF1α蛋白质的量和稳定性均明显降低，差异均具有统计学意义(<0.05)。上述结果表明c.493T>C (p.Trp165Arg)变异显著影响HNF1α的表达量及稳定性，可能为其导致疾病发生的原因，为后续深入探究MODY3的分子致病机制提供了新的方向。

MODY；HNF1α；基因突变

青少年起病的成人型糖尿病(maturity onset diabetes of the young，MODY)是一种以β细胞功能障碍和非胰岛素依赖为特征的单基因糖尿病，常被误诊为1型和2型糖尿病，具有常染色体显性遗传、发病年龄早于25岁等临床特点[1]。MODY的发病率约占糖尿病病例的1%～5%，约占儿童糖尿病的1%～6%[2]。其中肝细胞核因子1α (hepatocyte nuclear factor 1α，)突变导致的MODY3型是最常见的类型[3]。HNF1α是转录因子家族中的一员，在肝、胰腺、胃肠、肾中高表达，是一种以同源或异源二聚体形式发挥功能的转录调节因子，可以调控肝脏多种特异性蛋白的表达，影响肝脏中葡萄糖、蛋白质及脂质的代谢[3,4]。Shih等[5]研究也发现，HNF1α缺失导致了胰岛发育与代谢相关基因的异常，最终小鼠因胰岛素分泌功能受损而发展成了糖尿病，表明HNF1α是维持胰腺β细胞功能的重要转录因子。

随着基因测序技术的普及，基因新突变位点的发现不断增多，目前报道基因突变以错义、移码、剪接突变、启动子区突变、缺失等形式多见[6]，仍有大量突变尚未明确其致病性，因此需要进一步的研究工作来解释突变位点的确切功能。本课题组在前期工作中发现了1例携带有基因c.493T>C位点突变的MODY3患者，家族中多人具有早发型糖尿病表现。本研究通过生物信息学分析、基因表达载体构建、Western blot检测等方法，探讨了该位点突变对HNF1α蛋白表达水平的影响，以期解释该突变的可能致病性机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、菌株和质粒

HepG2细胞、293T细胞由川北医学院风湿免疫研究所保存，大肠杆菌DH5α、载体质粒pcDNA3.1-HR-Flag-H由川北医学院雷佳红博士提供。

1.1.2 培养基

DMEM高糖培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，LB培养基购自英国OXOID公司。

1.1.3 主要试剂

RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、无缝克隆试剂盒、高保真DNA聚合酶购自南京诺维赞生物有限公司，胶回收试剂盒购自北京擎科生物科技股份有限公司，I酶购自大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)，无内毒素质粒小提中量试剂盒购自美国Omega Bio-Tek公司，转染试剂Lipo2000购自北京聚合美生物科技有限公司，SDS-PAGE凝胶试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，PVDF膜购自美国Millipore公司，兔抗人HNF1购自英国Abcam公司，β-actin购自杭州华安生物技术有限公司，辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗购自北京中山金桥公司，环己酰亚胺购自美国AbMole公司。ECL超敏型试剂盒购自合肥白鲨生物科技有限公司，引物合成和序列测定均由浙江有康生物科技有限公司完成。

1.2 生物信息学Mutation Surveyor软件分析突变位点的致病性

从NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载基因的mRNA序列，找到突变位点及其上下游的碱基序列，截取包含突变位点在内约10个碱基输入到生物信息学软件Mutation Surveyor在线分析网站(http://www.mutationtaster.org/)进行功能预测。

1.3 构建突变型和野生型HNF1α真核表达载体

1.3.1 构建pcDNA3.1-HR-Flag-HNF1α野生型真核表达质粒载体

培养HNF1α高表达的HepG2细胞提取总RNA，并进行逆转录，以逆转录产物为模板，PCR扩增基因编码区全长。上游引物：5′-CCCAA GCTTATGGTTTCTAAACTGAGCCAGC-3′，下游引物：5′-CGGAATTCTTACTGGGAGGAAGAGGCCATCT-3′。产物大小为1903bp。胶回收PCR产物，通过I酶进行酶切消化去除质粒模板DNA，采用无缝克隆试剂盒与线性化的pcDNA3.1-HR-Flag-H载体连接，将重组载体转化DH5α感受态细胞。挑取单克隆进行菌落鉴定，将阳性的重组质粒送公司进行测序鉴定。

1.3.2 构建pcDNA3.1-HR-Flag-HNF1α突变型真核表达质粒载体

设计定点突变引物，上游引物：5′-GTACACC TGGTACGTCCGCAAGCAGCGAGAGGTGGCGC-3′，下游引物：5′-CGGACGTACCAGGTGTACAGGGCG GCCCGCTTCTGC-3′。以野生型真核表达载体为模板进行PCR扩增，胶回收PCR产物，同样通过I酶进行酶切消化，取酶切后产物转化DH5α感受态细胞。挑取单克隆进行菌落鉴定，将阳性的重组质粒送公司进行测序鉴定。

1.4 Western blot检测c.493T>C位点突变对HNF1α蛋白表达的影响

选取内源性低表达HNF1α的293T细胞作为研究对象，培养条件：DMEM高糖培养基，添加10%胎牛血清，在湿度培养箱中保持37℃和5%CO2的恒定条件进行培养。分别提取野生型和W165R突变重组质粒备用。转染前一天，将细胞以每孔20万个细胞的密度接种在6孔板中。用Lip2000分别转染野生型和突变型的真核表达质粒，每孔转染4μg重组DNA和10μL Lip2000。

1.4.1 Western blot检测HNF1α蛋白表达量的变化

收集转染后24 h及1～4天的两组细胞提取总蛋白，用BCA蛋白测定法进行蛋白定量。10%SDS- PAGE电泳，每孔蛋白上样量为30μg。电泳完毕后，湿转膜250mA，2 h。PVDF膜室温封闭2h，抗人HNF1α重组单克隆抗体(1∶3000) 4℃摇床孵育过夜，PBST洗膜，辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗室温孵育1.5h，采用全自动凝胶成像系统进行显影，使用Image J.JS对条带进行归一量化。内参采用β-actin (1∶3000)。

1.4.2 Western blot检测HNF1α蛋白稳定性的变化

步骤同前，293T细胞经转染48 h后，每孔加入50μg/mL环己酰亚胺(Cycloheximide，CHX)于培养基中。CHX是一种真核生物蛋白质合成抑制剂，可以抑制蛋白的生物合成。收集转染野生型与W165R重组质粒经CHX处理不同时间(0h、4h、8 h、12h)的细胞，并分别提取细胞总蛋白。采用Western blot方法检测HNF1α蛋白稳定性的变化，步骤同前。对CHX处理不同时间的野生型和W165R突变型条带进一步归一化为0h处理的HNF1α条带。

1.5 数据统计

数据采用平均值±标准差显示。统计分析使用GraphPad Prism 8.0.1软件进行了统计分析，采用非配对检验，以<0.05确定差异具有统计学意义。

2 结果与讨论

研究表明，MODY3型在欧洲、北美洲最常见，但在中国的发病率相对较低，小于1%[7]，目前基因诊断尚未完全普及，关于MODY的报道仍较少，难以统计完整的发病率。自1974年Tattersall等[8]发现以来，如何正确诊断MODY一直是困扰临床医生的问题。虽然不同类型的糖尿病具有高度的异质性：2型糖尿病的特征为胰岛素抵抗和胰岛素相对缺乏，但不存在自身免疫性抗体，是遗传与环境两个危险因素的相互作用的结果[9]；1型糖尿病的特征是自身免疫性抗体导致β细胞的破坏，进而导致β细胞的衰竭、胰岛素的绝对缺乏，与2型糖尿病相比，其更具有遗传性[10,11]；而MODY与2型糖尿病最大的不同在于年龄，2型糖尿病一般发生在成年以后，而MODY的发病年龄常早于25岁，还具有非胰岛素依赖的伴有常染色体显性遗传的家族史，且不存在自身免疫破坏，但其临床表现又有一定交叠[4]，这极大地阻碍了疾病的正确诊断。

目前已经确定了14种基因突变与MODY相关，其中MODY3、MODY2、MODY1和MODY5约占所有MODY的90%[12,13]。MODY2是由葡萄糖激酶的杂合突变导致，而MODY1和MODY5分别由同为转录因子的HNF4α和HNF1β编码的基因变异引起。虽然MODY3、MODY1与MODY5的临床表现相似，MODY3与MODY1一样，其特征是β细胞分泌胰岛素的进行性减少。但MODY3患者早期可出现尿糖阳性早于血糖升高表现，与之相比，MODY1一般肾糖阈正常，且尿糖阳性少见，但二者均可服用磺酰脲类药物控制血糖。而MODY5患者对磺酰脲类药物常无反应，通常需要胰岛素进行治疗，可能与其产生胰岛素抵抗和高胰岛素血症相关，此外患者肾脏常伴有囊性改变，还可能伴有阴道或子宫畸形与血脂异常[14]。不同亚型的临床表现存在异质性，这使得糖尿病类型的临床诊断更加困难。

本研究在临床工作中发现了基因存在c.493T>C(p.Trp165Arg，W165R)错义突变，结合文献并进行生物信息学分析，目前该位点国内尚未见报道，Mutation Surveyor在线分析软件预测结果显示基因c.493T>C位点突变可能导致疾病发生(Prediction disease causing: probably deleterious)，其中可能性接近1(pro:0.9999)，提示该突变导致临床表型的可能较大。为深入研究c.493T>C突变位点的功能，本研究通过同源重组系列实验，成功构建了突变型和野生型pcDNA3.1-HR-Flag-HNF1α真核表达载体。经测序验证并与NCBI数据库中的人序列比对分析，结果显示序列一致(图1A)。Western blot蛋白检测结果表明：(1)与未转染质粒载体的293T细胞对照组相比，转染野生型和突变型质粒均成功表达HNF1α蛋白，转染突变型的蛋白表达量明显低于转染野生型的蛋白表达量(<0.05)(图1，B和C)；(2)随着转染时间的延长，野生型与突变型的HNF1α蛋白表达水平的差距逐渐增大，表明蛋白表达水平存在明显差异，即突变型蛋白表达量明显低于野生型(图1，D和E)；(3)与未加入CHX处理的0 h组相比，野生型与突变型表达的HNF1α蛋白均呈现下降的趋势，但突变型蛋白的半衰期明显快于野生型蛋白，表明加入CHX处理细胞后，293T细胞表达的突变型HNF1α蛋白的稳定性明显低于野生型(<0.05)(图1，F和G)。

根据ClinVar数据库，已经报道了798个基因突变，其中278个突变被认定为致病性或可能致病性。基因定位于染色体12q24.31区域，包含10个外显子[15]。HNF1α蛋白包括3个功能域：一个N端二聚体结构域(1～32)，一个DNA结合结构域(83～279)和一个C端反转录激活结构域(281～ 631)[16]。基因突变可以发生在任何一个结构域，但缺乏突变热点，其中以第4外显子(p291fsinsc)的突变最为常见[17]。Vaxillaire等[18]发现，76%与MODY3相关的错义突变发生在DNA结合结构域。这表明DNA结合结构域比其他结构域对单个氨基酸的改变更敏感。而DNA结合结构域又包括POU特异性结构域(POUs)、POU同源结构域(POUh)以及一个核定位信号，有研究者发现POU结构域在维持蛋白质稳定性方面起着至关重要的作用[19]。

本研究发现的c.493T>C错义突变，位于DNA结合结构域中的POU亚结构域中，通过软件分析提示致病性可能大。本实验结果显示与野生型的HNF1α蛋白比较，c.493T>C突变后HNF1α蛋白的表达量和稳定性明显降低。Kind等[16]发现基因POU结构的P112L变异在稳态条件下的表达水平低于野生型蛋白，本研究结果与其相符，W165R突变也会导致HNF1α蛋白的表达减少。

图1 HNF1α重组质粒测序和Western blot检测蛋白质表达

A：重组质粒测序结果；B：野生型(wild type)、突变型(W165R)过表达质粒转染293T细胞的HNF1α蛋白表达情况；C：图B蛋白条带对内参进行归一化处理后的HNF1α蛋白表达差异；D：野生型与突变型过表达质粒转染293T细胞1～4天后HNF1α蛋白表达情况；E：图D各时间点蛋白条带对内参进行归一化处理后的HNF1α蛋白表达差异；F：野生型与突变型过表达质粒转染293T细胞24 h后加入CHX 0、4、8、12 h 检测HNF1α蛋白表达情况；G：图F各时间点蛋白条带对0 h条带进行归一化处理后的HNF1α表达差异。**：<0.01；***：<0.001。

不同突变位点的临床表现与功能改变也有所不同。Li等[17]发现突变发生于二聚体结构域与DNA结合结构域的患者的发病年龄较低，而发生截短突变的患者发病年龄小于发生错义突变的患者；同时发现MODY3患者的基础胰岛素水平和胰岛素对高糖刺激的反应也存在差异，患者的空腹血糖或正常或明显升高；与血糖正常人群相比，MODY3患者的基础胰岛素分泌较低，但高糖刺激后胰岛素分泌增加，但程度不尽相同。这种差异可能是不同突变的结果，也提示了对于高糖刺激胰岛素分泌可能发挥直接调节作用。研究表明，不仅参与调控胰岛素的转录，还直接调控参与胰岛素分泌的重要基因，如葡萄糖转运蛋白2和肝细胞核因子4α、丙酮酸激酶[20]。有研究发现[21]基因POU结构的T260M致病性变异会导致靶基因表达减少。与都是转录因子调控网络中的重要组成部分，已被证实具有相互调节的作用，可以激活的表达与转录活性，而直接通过蛋白质相互作用下调介导的转录激活，还可以减弱自身的表达与激活。具有调控胰岛β细胞的功能，从而通过调节等靶基因来调控β细胞的功能和生长。Haque等[22]也证明了DNA结合位点发生突变可能会导致启动子活性下调干扰其表达，并破坏转录网络，从而影响其下游靶基因的表达，导致β细胞功能障碍进而发展为糖尿病。这些研究进一步强调了基因正常表达的重要性，本课题组也将完成后续功能实验进行验证。

综上所述，本研究探讨了c.493T>C位点突变对HNF1α蛋白表达的影响，结果表明c.493T>C变异能明显影响的表达，提示该变异可能是导致青少年起病的成人型糖尿病发生的原因，为后续深入研究MODY3的分子机制提供了一定的理论基础。

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Effect of mutation at c.493T>C locus of transcription factorgene on its protein level

Shujie Liang4, Yihua Peng2, Jiahong Lei3, Aimin Jia3, Hong Jiang3, Yan Cai1,3,4,5

Hepatocyte nuclear factor 1α (HNF1α) is a transcription factor that is crucial for the regulation to maintain the function of pancreatic β-cell, hepatic lipid metabolism, and other processes. Mature-onset diabetes of the young type 3 is a monogenic form of diabetes caused bymutations. Although several mutation sites have been reported, the specific mechanisms remain unclear, such hot-spot mutation as the P291fsinsC mutation and the P112L mutation and so on. In preliminary studies, we discovered one MODY3 patient carrying a mutation at the c.493T>C locus of thegene. In this study, we analyzed the pathogenic of the mutation sites by using the Mutation Surveyor software and constructed the eukaryotic expression plasmids of the wild-type and mutant type ofto detect variations in the expression levels and stability of HNF1α protein by using Western blot. The analyses of the Mutation Surveyor software showed that the c.493T>C site mutation may be pathogenic gene and the results of Western blot showed that both the amount and stability of HNF1α protein expressed by the mutation type plasmid were reduced significantly compared to those by the wild type plasmid (<0.05). This study suggests that thec.493T>C (p.Trp165Arg) mutation dramatically impacts HNF1α expression, which might be responsible for the development of the disease and offers fresh perspectives for the following in-depth exploration of MODY3's molecular pathogenic process.

maturity onset diabetes of young; hepatocyte nuclear factor 1α; mutation

2023-11-07;

2024-01-12;

2024-01-18

川北医学院附属医院第一批临床研究课题(编号：2021LC009)和川北医学院博士启动基金项目(自然科学类)(编号：CBY22-QDA28)资助[Supported by the First Batch of Clinical Research Topics of the Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College (No. 2021LC009), and the PhD Launch Fund of North Sichuan Medical College (Natural Science) (No. CBY22-QDA28)]

梁淑杰，硕士研究生，专业方向：基因突变功能研究。E-mail: liangsj16@163.com

蔡燕，主任技师，研究方向：基因突变功能研究。E-mail:caiyandd@163.com

10.16288/j.yczz.23-274

(责任编委: 孟卓贤)