早期胚胎极性建立及对谱系分化的影响

朱奕，陈雪沁，冷丽智,2，林戈,2

综 述

早期胚胎极性建立及对谱系分化的影响

朱奕1，陈雪沁1，冷丽智1,2，林戈1,2

1. 中南大学基础医学院生殖与干细胞工程研究所，长沙 410000 2. 中信湘雅生殖与遗传专科医院，长沙 410000

极性建立是影响早期胚胎发育的关键因素之一。极性建立起始于8细胞胚胎的肌球蛋白磷酸化，磷酸化激活肌动蛋白导致其启动收缩力。随后，肌动蛋白发生重组在每个卵裂球的非接触表面形成富含微绒毛的顶端结构域，并在极性蛋白复合物等的共同作用下形成标志着顶端结构域成熟的肌动球蛋白环。从极性建立的过程可知，顶端结构域的形成受到肌动蛋白相关蛋白以及极性蛋白复合物的影响，并且部分合子基因组激活(zygote genome activation, ZGA)和谱系分化特异性基因也会调控极性建立。在早期胚胎发育过程中，极性建立是第一次细胞谱系分化的基础。它通过影响不对称细胞分裂、谱系分化因子的不对称定位以及Hippo信号通路的活性来调控谱系分离和形态发生。本文对哺乳动物早期胚胎极性建立及对谱系分化影响的相关研究进行了梳理和总结，并讨论了目前已有研究在调控机制和物种方面的不足，以期为阐明早期胚胎极性建立提供线索与系统性视角。

早期胚胎发育；胚胎极性建立；谱系分化

细胞极化是指细胞形状、蛋白质分布和细胞功能的不对称性，是细胞的基本特性之一[1]。细胞极化可以使细胞发生不对称分裂，产生具有不同功能和细胞命运的细胞，进而发育成完整的正常组织并维持组织的稳态。细胞极化已被证明是进化生物学中的一个关键事件。对于单细胞生物，例如酿酒酵母()和裂殖酵母()等，极化是繁殖发生的机制[1]。对于更复杂的生物，如秀丽隐杆线虫()和黑腹果蝇()等，极化导致不同身体部位的发育和组织，包括神经系统和翅膀组织[2,3]。因此，细胞极化是细胞分化、迁移、形成多细胞复杂生物体并维持基本生命活动的基础[4]。

哺乳动物新一代的生命起始于卵母细胞与精子融合形成的受精卵，从受精卵到植入子宫之间的发育窗口称为植入前胚胎发育过程。在人早期胚胎发育过程中，受精卵发生合子基因组激活(zygote genome activation，ZGA)、经历致密化(compaction)、建立胚胎极性并分化为内细胞团(inner cell mass，ICM)和滋养外胚层(trophectoderm，TE)，在第5天左右形成有腔囊胚[5]。人和小鼠早期胚胎的第一次细胞命运决定促使ICM和TE谱系分化，而触发谱系分化的关键事件是胚胎极性的建立[6]。本文对早期胚胎极性建立过程进行了阐述，强调了肌动蛋白相关蛋白、缺陷性分配(partitioning defective，PAR)极性蛋白复合物和部分ZGA基因在极性建立过程中的重要作用，并总结了目前关于极性建立影响谱系分化的可能途径。

1 早期胚胎极性建立的过程

从受精后至发育第3天，哺乳动物的受精卵会经历3次卵裂发育到8细胞。在8细胞阶段之前，小鼠植入前胚胎内早期卵裂球的细胞大小和形状在形态上是无法区分的[7]。此时，胚胎通过一个称为致密化的过程，相邻卵裂球的位置变得更近，形态上从松散附着的细胞组合转变成一个完整的实体，并在无细胞接触的表面形成富含微绒毛的顶端结构域[8]。有研究表明，胚胎发生致密化和建立细胞极性均与肌动蛋白重塑过程密切相关[9,10]，并且肌动球蛋白网络组织的极化是PAR极性蛋白复合物定位于顶端结构域的先决条件[11]。胚胎进入8细胞阶段后，卵裂球表面的肌球蛋白就会被其轻链的磷酸化激活，随后与肌动蛋白细丝结合[12]。这一过程的直接结果是肌球蛋白的收缩力被启动，这会导致卵裂球顶端表面张力的净增加，超过细胞连接处的张力，从而推动胚胎的致密化[13]。随着胚胎的发育，肌球蛋白皮质进一步重塑，在无细胞接触的表面中间形成肌动蛋白帽。此时各种顶端极性蛋白也会在顶端富集，包括受外部肌动球蛋白限制的PAR极性蛋白复合物和绒毛相关的ERM(ezrin/radaxin/meosin)家族成员蛋白以及一些紧密连接蛋白，如JAM-1[14]。当这种积累持续时，负向调节肌动球蛋白网状结构的PAR复合物和调节顶端蛋白横向迁移的RhoA激酶一起将肌动蛋白帽从中心排除到生长的顶端斑块的外围，最终形成标志着顶端结构域成熟的肌动球蛋白环[11,15]。在哺乳动物植入前胚胎发育过程中，顶端-基底极性建立被认为是导致第一次谱系分化的重要不对称线索[16]。

2 调控极性建立的关键因素

现有研究认为小鼠早期胚胎发育的极性建立过程分为两个阶段。从早期8细胞(细胞分裂后1 h内)到中期8细胞(细胞分裂后3～4 h)的第一个阶段，肌动球蛋白网络在胚胎致密化过程中极化到无细胞接触表面，肌动蛋白逐渐在顶端定位，此时PAR极性蛋白复合物在细胞皮层周围保持均匀分布；第二个阶段发生在中晚期8细胞阶段(细胞分裂后5～8 h)，PAR极性蛋白复合物与其他保守的顶端蛋白开始向顶端积累，在极性蛋白发生顶端富集时，肌动蛋白重新分布形成环状结构包围顶端结构域[11]。因此，调控肌动蛋白重塑以及影响PAR极性蛋白复合物表达的关键基因均会影响早期胚胎的极性建立。

2.1 调控极性建立的肌动蛋白相关蛋白

肌动蛋白相关蛋白2/3(actin-related protein 2/3, ARP2/3)复合物是一种关键的肌动蛋白成核因子，其核心成分是ARP2和ARP3以及将两种肌动蛋白相关蛋白连接到母丝上的5个亚基——ARPC1-5[17～19]。这些蛋白质最早是通过遗传和基因组方法在酿酒酵母、裂殖酵母[20,21]、黑腹果蝇[22]和秀丽隐杆线虫[23]中被分离鉴定出来的。后续研究发现ARP2/3复合物参与一系列生物学过程，如胞吞作用[24,25]、细胞迁移和粘附[26～28]，抑制该复合物的活性会导致有丝分裂期间细胞极性建立失败和细胞分裂异常[17,19]。

ARP2/3复合物对细胞极性建立的影响贯穿于卵母细胞成熟与精子发生以及胚胎发育的整个过程中。早在卵母细胞减数分裂成熟和精子发生时，ARP2/3复合物就起着重要的作用。2011年，Sun等[29]发现ARP2蛋白主要集中在小鼠卵母细胞的皮层中，并与肌动蛋白共定位。当用特异性抑制剂处理或RNA干扰(RNA interference，RNAi)破坏ARP2/3复合物活性时，肌动蛋白帽和皮质颗粒结构域的形成受到影响；从而导致小鼠卵母细胞减数分裂成熟期间纺锤体迁移和细胞分裂失败。该研究证明了ARP2/3蛋白通过对小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中皮质重组、纺锤体迁移、不对称细胞分裂的广泛影响来调节卵母细胞极化[29]。此外，敲除肌动蛋白相关蛋白复合物亚基1b (actin-related protein complex subunit 1b，)也会扰乱生殖细胞进入G2/M期的能力，阻碍细胞分裂，并导致成熟精子极性建立缺陷[30]。

在小鼠植入前胚胎发育过程中，ARP2/3复合物集中在2～8细胞胚胎每个卵裂球顶端的皮质层以及桑椹胚和囊胚的外围区域，在受精卵阶段，抑制ARP2/3复合物的活性会导致细胞分裂失败，在单个细胞内观察到两个或多个细胞核。在后续发育过程中，小鼠胚胎的肌动蛋白表达水平下降，胚胎未能致密化并失去顶端-基底极性，抑制8细胞胚胎表达ARP2/3复合物将导致囊胚形成失败，具体表现为胚胎极性丧失以及TE和ICM谱系分化失败[31]。这些数据表明ARP2/3复合物是小鼠植入前胚胎发育所必需的[31]。另外，在小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)分化为外胚层样细胞(epiblast- like cells，EpiLCs)过程中，其集落形态和肌动蛋白结构的变化取决于ARP2/3复合物的活性，复合物活性的丧失会延迟胚胎进入多能状态的进程，继而破坏所有3个胚层(外胚层、滋养外胚层和原始内胚层)的谱系分化[32]。

2.2 调控极性建立的PAR极性蛋白复合物

PAR极性蛋白复合物广泛存在于秀丽隐杆线虫单细胞胚胎[33～35]、果蝇神经母细胞和上皮细胞[36,37]以及哺乳动物上皮细胞[38,39]中，在细胞连接和细胞极性建立过程中发挥着重要作用。PAR极性蛋白复合物是一类能够相互结合并和多种其他细胞极性调节蛋白结合的多结构域蛋白，包括PAR3、PAR6和非典型蛋白激酶C (atypical protein kinase C，aPKC,也称为PKCζ)[40]。在早期胚胎发育过程中，PAR极性蛋白复合物在小鼠胚胎中的不对称分布始于致密化过程中的8细胞阶段，并且参与胚胎的第一次谱系分化和囊胚形态发生[41]。随着早期胚胎发育过程的推进，PAR3和aPKC逐渐局限于卵裂球顶端质膜和紧密连接处，干扰它们的表达会导致细胞偏向于发育为ICM[42]。但是aPKC的表达对8细胞和桑椹胚极性的影响是不同的，其表达对于8细胞胚胎极性的建立是可有可无的，但对于桑椹胚极性的定位和稳定至关重要[43]。

在哺乳动物植入前胚胎发育过程中，研究最多的PAR极性蛋白复合物成员是PAR6。在小鼠中发现了3种PAR6同系物，即PARD6A、PARD6B和PARD6G[44]，其中是植入前胚胎发育过程中表达的主要基因[41,45]。是囊胚形态发生所必需的，其通过调控顶端-基底细胞极性建立、紧密连接形成、细胞旁通透性封闭和TE谱系特异性基因的表达来影响囊胚形成[46]。同时，Hippo信号通路的异常激活将拮抗PAR复合物组分PARD6B和aPKC蛋白的顶端定位，抑制顶端结构域的正常形成，从而将细胞引导到内部的ICM命运[47]。

2.3 调控极性建立的其他关键因子

首先，除了肌动蛋白相关蛋白会调控早期胚胎极性建立外，另一细胞骨架成分——角蛋白在细胞分裂过程中会被外层子细胞不对称遗传，它是小鼠和人类早期胚胎的细胞骨架中第一个表现出显著细胞间异质性的主要成分。它会通过稳定肌动蛋白皮层以促进胚胎顶端极化和基因的特异性表达，从而指定早期胚胎的滋养外胚层谱系分化[48]。

在探究小鼠胚胎从头极化机制的研究中发现，顶端结构域的形成需要两个关键条件：在小鼠胚胎中发生在1～4细胞阶段而在人胚胎中发生在2～8细胞阶段的ZGA和肌动球蛋白复合物的皮质定位，该研究找到了两个对胚胎极性建立起关键调控作用的ZGA基因——转录因子AP-2γ (transcription factor AP-2 gamma,)和TEA结构域转录因子4(TEA domain transcription factor 4，)[5,15]。干扰和会延迟8～16细胞阶段的极化，而过度表达则会导致4细胞胚胎提早极化，和通过激活等ARP2/3复合物基因的表达来调控胚胎极化。干扰基因的表达以及用CK666 (一种ARP2/3蛋白复合物的抑制剂)处理都会导致胚胎顶端结构域形成缺陷，并抑制了和诱导的4细胞胚胎顶端蛋白提早极化，依赖于和的肌动蛋白动力学调节是ezrin簇生长和顶端蛋白形成所必需的[15]。事实上，早在2012年，Choi等[49]就发现对于小鼠植入前胚胎发育过程中桑椹胚到囊胚的过渡至关重要，它直接与、、、和等基因的启动子结合，进而调控胚胎极性建立、紧密连接、液体积聚和细胞增殖。对的进一步研究发现，其在小鼠早期胚胎中充当CDX2表达和位置依赖性Hippo信号传导的新型上游调节因子，它通过激活表达、控制肌动蛋白动力学以及增强细胞极性等多种途径抑制Hippo信号传导，进而调控小鼠胚胎的TE分化[50]。

尾部相关同源盒蛋白2(caudal-related homeobox protein 2，CDX2)是Hippo信号通路调控的下游分子，它是TE发育所必需的转录因子[51]。Jedrusik等[52]发现胚胎极性建立和表达之间存在互相增强的关系：可以通过上调的表达与稳定极性表型来促进极性建立，但CDX2分布也会受到胚胎极性建立的影响，顶端结构域的成功形成可以确保mRNA正确定位到外部卵裂球。另外，在小鼠4细胞胚胎卵裂球中具有异质性的组蛋白共激活剂相关精氨酸甲基转移酶1(coactivator-associated arginine methyltransferase 1，CARM1)[53]的过表达会下调细胞极性基因(如和)以及转录因子的表达，但会增加拮抗剂的表达，进而调控不对称分裂导致胚胎向ICM谱系分化[54]。

除此之外，最近的研究还发现，翻译调节因子BZW1(basic leucine zipper and W2 domains 1)在小鼠早期胚胎发育过程中，通过维持翻译起始密码子选择的平衡来保障蛋白质的翻译水平，从而推动胚胎发育和致密化进程，敲低胚胎无法进行压实，并表现出囊胚形成率降低[55]。

3 极性建立对早期胚胎谱系分化的影响

发生在哺乳动物8细胞胚胎中的顶端-基底细胞极性建立在早期胚胎TE和ICM谱系分化过程中起关键作用，它主要通过调控不对称细胞分裂、谱系分化因子的不对称定位以及Hippo信号通路的活性来影响谱系分化。

3.1 极性建立调控不对称细胞分裂

在有丝分裂过程中，顶端结构域的存在使细胞发生不对称细胞分裂，从而产生极性(有顶端结构域)和非极性(无顶端结构域)子细胞。在8细胞到桑椹胚阶段的过渡期间，定向分裂可以将部分子细胞推向胚胎内部，这一不对称分裂由顶端结构域中存在的差异收缩力驱动[56,57]。并且只有当表面收缩力的差异超过可预测的阈值时，细胞才会发生内化，用激光消融肌球蛋白的连接后，发现皮质张力的减小会导致某些细胞的顶端表面收缩力减小，进而导致它们无法被分配到胚胎内部[57]。后续还有研究利用生物物理测量的方法证实了顶端结构域的不对称分离会使得卵裂球产生不同的收缩力，从而引导它们分配到内部和外部位置[58]。Korotkevich等[16]则将顶端结构域移植到无顶端结构域的卵裂球上，发现顶端结构域会控制细胞分裂过程中纺锤体的方向，进而诱导不对称细胞分裂。

3.2 极性建立调控关键谱系分化因子的不对称定位

顶端结构域能保证微管和肌动蛋白细胞骨架的完整性，以维持和稳定关键谱系分化转录本及其调控元件在极性和非极性细胞中的不对称定位。例如调控TE谱系分化的基因，mRNA定位取决于开放阅读框(open reading frame，ORF)内的97 nt顺式元件，其正确定位依赖于完整的肌动蛋白和微管细胞骨架以及成熟的顶端结构域，在小鼠胚胎8细胞晚期，优先定位于顶端，在8细胞向桑椹胚过渡期间会不对称地遗传给内外子细胞。定位元件的不对称定位导致外部细胞获得更多的mRNA，进而指导外部细胞分化为TE；而内部细胞不会遗传转录本，不表达CDX2蛋白，使得它们发育为ICM[59]。最近，Hawdon等[60]使用荧光RNA染料实时成像的方法发现，在小鼠胚胎发育的2～8细胞阶段，RNA以点状病灶的形式广泛分散到卵裂球的整个细胞质中，没有明显的时空模式。而在晚期16细胞胚胎中，RNA的量从卵裂球顶端到基底逐渐增加，并且这种时空控制的转运过程需要微管、溶酶体囊泡和膜联蛋白共同发挥作用，但RNA翻译所需的组件在16细胞胚胎的外卵裂球中显示出优先的顶端定位[60]。

此外，收缩力也会控制Yes相关蛋白(yes- associated protein，YAP)的亚细胞定位，当收缩力增加时，YAP更加定位在细胞核中，从而调控胚胎谱系分化[61]。在小鼠早期胚胎谱系分化过程中，随着细胞发生内化，卵裂球顶端皮层的核纤层蛋白表达降低，使得肌动蛋白成核因子FORMIN2和ARP2/3复合物的定位从细胞核转移到细胞质。细胞质中肌动蛋白丰度的增加可以稳定血管抑制素结合蛋白(angiomotin，AMOT)的表达，促进YAP磷酸化和ICM命运的获得；而在外细胞中核纤层蛋白表达升高，高水平的核纤层蛋白可以防止YAP磷酸化，未磷酸化的YAP可以进入细胞核与结合使表达指定TE谱系命运[62]。这些都说明顶端结构域能够通过调控核纤层蛋白的表达来控制肌动蛋白的分布，以差异调节谱系分化因子的定位。

3.3 极性建立调控Hippo信号通路的活性

早期胚胎的每个细胞都依赖于细胞极性和细胞粘附之间的平衡来调节位置依赖性Hippo信号通路的传导和下游谱系特异性基因的活性，极性状态将胚胎细胞分为两个具有不同Hippo信号活性的群体，进而调节TE和ICM谱系特异性转录因子的差异表达以决定细胞的谱系命运[51]。在外层极性细胞中，顶端结构域和RhoA激酶将AMOT从连接处隔离出来，将其定位在顶端与皮质肌动蛋白结合并保持未磷酸化状态，LATS1/2激酶活性因此受到抑制，Hippo信号通路处于失活状态。活性被抑制的LATS1/2激酶无法将转录辅因子YAP磷酸化，而未磷酸化的YAP会进入细胞核并与结合，进而激活调控TE分化的关键转录因子和表达，促使细胞向TE发育；在内层非极性细胞中，AMOT被包围在细胞的连接处并与E-钙粘蛋白和Nf2间接结合，在那里它通过LATS1/2激酶磷酸化而被激活，Hippo信号通路处于活化状态。LATS1/2激酶也会磷酸化YAP，磷酸化的YAP无法进入细胞核，激活因此受阻，多能性转录因子和表达上调，促使细胞向ICM发育[63～65]。

4 结语与展望

近年来，研究者们通过与其他物种和其他细胞(如上皮细胞和神经细胞等)进行类比的方式对哺乳动物早期胚胎的极性建立进行了探究，对此有了一些新的见解，图1总结了早期胚胎极性建立的过程及其对谱系分化的影响，但仍存在许多未解决的问题。首先，Hippo信号通路的重要效应分子YAP-TEAD复合物可能对早期胚胎极性建立也起到关键调控作用。Yu等[66]发现小鼠卵母细胞中积累的母源性YAP是早期胚胎ZGA的关键激活因子，母源YAP的敲除会影响小鼠2～4细胞胚胎的发育进程。并且，在人和小鼠的衰老过程中，卵母细胞的发育潜能下降与母源mRNA的降解不足密切相关[67]，而YAP-TEAD介导的转录对于母源mRNA清除至关重要，大多数清除不成功的胚胎未能发育成囊胚，并阻滞在4～8细胞阶段[68]。那么YAP-TEAD复合物是否是通过调控母源mRNA降解从而为8细胞胚胎的极性建立和致密化发生提供分子基础和前提呢？

图1 早期胚胎极性建立的过程及其对谱系分化的影响

在小鼠早期胚胎发育过程中，8细胞阶段的ZGA使、和等转录因子表达，从而调控顶端极性蛋白的协同募集。协同募集与RhoA激酶调控的顶端蛋白横向移动相互作用，成功建立顶端结构域。早期胚胎极性的成功建立会通过影响早期胚胎卵裂球的不对称细胞分裂、关键谱系分化因子的不对称定位以及Hippo信号通路的活性来调控谱系分化。

另外，尽管负责顶端结构域形成的分子相互作用——肌动蛋白的重塑以及肌动蛋白环的形成，已经得到了很好的研究，但激活哺乳动物早期胚胎极化的确切分子机制仍不清楚。最近的工作已经阐明了一些可能的信号通路。例如，在小鼠植入前胚胎发育过程中，磷脂酶C (phospholipase C，PLC)介导的磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate，PIP2)水解会激活PKC，从而启动顶端皮层肌动蛋白的积聚。PKC继续激活RhoA激酶，进一步促进肌动蛋白网络极化，PAR极性蛋白复合物也被招募到顶端表面，从而将肌动蛋白排除在外层，形成完整的顶端结构域[11]。同样，PLC信号通路也是人早期胚胎极性建立所必需的，其激活是触发人胚胎极化的上游机制，对TE谱系分化起着至关重要的作用[69]。但极性建立过程是否仅靠PLC信号通路就能完成？用来构建顶端结构域的其他分子机制还有哪些？近年来日益发展的实时成像技术、新组学技术以及计算建模和基于人工智能的技术可能有助于人们深入了解这些理论。

最后，目前关于早期胚胎极性建立的研究大多以小鼠胚胎为研究对象，但是小鼠与人早期胚胎的极性建立过程存在明显差异。例如，在小鼠胚胎中，只有当所有的8细胞胚胎卵裂球都发生极化之后，才会在后续的卵裂过程中分化出非极性细胞，但人胚胎中内部非极性细胞的产生可能不需要预先建立胚胎极性[69]。总体而言，早期胚胎极性建立的具体机制及其对谱系分化的影响十分复杂，并且许多问题迄今只在动物研究中得到了初步回答，关于人类的相关研究仍很缺乏。目前而言，伴随着人类类囊胚(blastoid)模型的成功构建与类囊胚培养技术的不断成熟，人们将不断拓宽和加深对人植入前胚胎发育过程以及过程中关键事件(如极性建立和谱系分化等)的认识[70]。

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Early embryonic polarity establishment and implications for lineage differentiation

Yi Zhu1, Xueqin Chen1, Lizhi Leng1,2, Ge Lin1,2

Polarity establishment is one of the key factors affecting early embryonic development. Polarity establishment begins with myosin phosphorylation in the 8-cell embryo, and phosphorylation activates actin leading to its initiation of contractility. Subsequently, actin undergoes reorganization to form an apical domain rich in microvilli on the non-contacting surface of each blastomere, and form the actomyosin ring that marks the maturation of the apical domain in conjunction with polar protein complexes and others. From the process of polarity establishment, it can be seen that the formation of the apical domain is influenced by actin-related proteins and polar protein complexes. Some zygote genome activation (ZGA) and lineage-specific genes also regulate polarity establishment. Polarity establishment underlies the first cell lineage differentiation during early embryonic development. It regulates lineage segregation and morphogenesis by affecting asymmetric cell division, asymmetric localization of lineage differentiation factors, and activity of the Hippo signaling pathway. In this review, we systematically summarize the mechanisms of early embryonic polarity establishment and its impact on lineage differentiation in mammals, and discuss the shortcomings of the currently available studies in terms of regulatory mechanisms and species, thereby providing clues and systematic perspectives for elucidating early embryonic polarity establishment.

early embryonic development; embryo polarity establishment; lineage differentiation

2023-10-25;

2023-12-21;

2024-01-10

国家自然科学基金项目(编号：82001556)资助[Supported by the National Natural Science Foundation of China(No. 82001556)]

朱奕，硕士研究生，专业方向：生殖遗传学。E-mail: 13387481620@163.com

林戈，博士，研究员，研究方向：生殖医学。E-mail: linggf@hotmail.com

10.16288/j.yczz.23-268

(责任编委: 杜茁)