不同级别宫颈病变女性阴道微生物分布特征和群落结构变化

田丽君,石继海,余艳琴,姚茹楠,米淑宏,贾喜梅(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院妇产科,包头 0400;内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院流行病学研究中心;通讯作者,E-mail:7063946@qq.com)

宫颈疾病是指发生在宫颈组织区域的病变,常见包括宫颈上皮内瘤样变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)、宫颈癌(cervical cancer,CC)等,CC是目前临床常见的女性恶性肿瘤,世界卫生组织(World Health Organization,WHO)统计显示,2020年全球估计有60.4万新发病例和34.2万死亡病例,其中80%的病例发生在发展中国家,我国每年新发病例约占全球新发病例的20%左右,发病率及死亡率均高居全球范围内女性恶性肿瘤的第4位[1,2]。CC的发展是一个逐步的过程,CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ级作为癌前病变可逐渐进展为子宫颈浸润癌,早期筛查宫颈疾病对提高治疗效果、改善患者预后至关重要[3,4]。既往研究发现,微生物群通常附着于人体中形成共生体,在宿主的功能、免疫力和饮食方面可发挥共生体或互惠体的作用,目前发现微生物群寄生的常见部位包括阴道及肠道[5,6]。现代研究表明,微生物群的改变诱发相关疾病,包括炎症和癌症。女性阴道微生物环境在正常情况下处于平衡状态,而阴道微生物群落是维持阴道微生态环境平衡的核心部分[7,8]。但目前的研究只是定性的描述了宫颈疾病治疗或手术后阴道菌群失调,未定量分析阴道微生物群落组成的变化。针对这个问题,本研究旨在分析不同级别宫颈病变女性阴道微生物的分布特征和群落结构变化,探讨阴道微生物群在宫颈病变中的作用及潜在的临床应用价值,筛选出与宫颈病变相关的关键微生物种类,为揭示宫颈病变的发病机制、探索有效的防治手段以及开发基于阴道微生物群落的诊断和治疗方法提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2021年1月至2023年6月于内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院收治的宫颈病变患者70例为观察对象,纳入标准:①患者均行宫颈液基细胞学、高危型人乳头瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)筛选法及宫颈活检病理,结果显示存在宫颈病变;②患者年龄在20～45岁之间;③1月内未行抗生素及阴道冲洗药物;④1周内无性生活。排除标准:①患者合并泌尿系统疾病;②合并其他恶性肿瘤;③合并糖尿病或重要器官严重功能障碍;④合并阴道炎症或盆腔炎症。根据病理类型分为CIN Ⅰ组(n=20)、CIN Ⅱ组(n=20)、CIN Ⅲ组(n=20)、CC组(n=10),本研究均经内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院伦理会批准同意(伦理批准号:2019031607)。

1.2 检查方法

阴道微生物群落结构检测:采用无菌棉拭子放置于受检者阴道后穹窿处旋转10～15 s,放置-80 ℃冰箱中保存,采用细菌基因组DNA试剂盒提取样本总DNA,提取后放置-20 ℃冰箱中冷冻保存,使用PCR扩增仪提取稀释后基因组的DNA,同时扩增16S rRNA的V3、V4区基因片段,实施PCR反应,置于4 ℃冰箱中保存,采用Illumina Miseq测序平台检测阴道微生物群落。

阴道微生物分布特征:采用无菌棉拭子放置于受检者阴道后穹窿处旋转10～15 s,常规行涂片、干燥、固定及革兰氏染色等操作,用显微镜观察阴道菌群密集度及多样性。阴道菌群密集度:采用油镜观察视野下细菌数目,放大倍数为10×100倍,其中视野下细菌数目1～9个为Ⅰ级,10～99个为Ⅱ级,≥100个为Ⅲ级,细菌聚集成团或密度覆盖于黏液为Ⅳ级。阴道菌群多样性:采用油镜观察视野下细菌类型数目,放大倍数为10×100倍,其中视野下细菌类型1～3种为Ⅰ级,4～6种为Ⅱ级,7～10种为Ⅲ级,≥11种为Ⅳ级。

1.3 观察指标

①比较各组受检者阴道群落结构,其中微生物菌门包括厚壁菌门、放射菌门、拟杆菌门及其他菌门类型,微生物菌群包括乳酸杆菌属、加德纳菌属、奇异菌属及其他菌属;②比较各组受检者菌落密集度、菌群多样性情况,其中Ⅱ-Ⅲ级为正常,Ⅰ级或Ⅳ级为异常;③CC组患者随访治疗后3个月,比较CC患者治疗前后阴道微生物分布特征、群落结构变化。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组受检者一般资料比较

各组受检者年龄、BMI等差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。

表1 各组受检者一般资料比较Table 1 General information of subjects in each group

2.2 各组受检者群落结构比较

健康组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组和CC组患者菌门分布以厚壁菌门为主,分别占99.08%,96.13%,80.60%,73.32%,59.19%,放射菌门、拟杆菌门、其他菌门等微生物占比逐渐增加,5组菌门分布情况两两比较差异具有统计学意义(P<0.05,见表2)。

表2 各组受检者菌门分布情况比较 菌门数(%)Table 2 Comparison of the distribution of bacterial phyla in subjects among five groups counts(%)

健康组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组和CC组乳酸杆菌属占比逐渐下降,健康组、CINⅠ组、CINⅡ组和CINⅢ组患者菌属分布以乳酸杆菌属为主,分别占88.90%,73.43%,60.84%,54.37%,CC组患者以加德纳菌属为主,占比25.24%,5组菌属分布情况两两比较差异具有统计学意义(P<0.05,见表3)。

表3 各组受检者菌属分布情况比较 菌属数(%)Table 3 Comparison of the distribution of bacterial genera in subjects among five groups counts(%)

2.3 各组受检者微生物分布特征比较

健康组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组和CC组患者菌落密集度正常占比分别为95.00%,80.00%,60.00%,50.00%,40.00%,CIN Ⅱ组和CIN Ⅲ组患者菌落密集度正常占比明显低于健康组,CC组患者菌落密集度正常占比明显低于CINⅠ组和健康组,差异均有统计学意义(P<0.05);健康组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组、CC组五组患者菌群多样性正常占比分别为90.00%,65.00%,55.00%,30.00%,20.00%,CIN Ⅱ组、CIN Ⅲ组、CC组患者菌群多样性正常占比明显低于健康组,CIN Ⅲ组、CC组患者菌群多样性正常占比明显低于CINⅠ组,差异均有统计学意义(P<0.05,见表4)。

表4 各组患者微生物分布特征比较 例(%)Table 4 Comparison of microbial distribution characteristics in subjects among five groups cases(%)

2.4 CC患者治疗前后群落结构比较

相较于治疗前,治疗后CC组患者厚壁菌门占比明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05,见表5);相较于治疗前,治疗后CC组患者乳酸杆菌属占比明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05,见表6)。

表5 CC患者治疗前后菌门分布情况比较 菌门数(%)Table 5 Comparison of the distribution of bacterial phyla in CC patients before and after treatment counts(%)

表6 CC患者治疗前后菌属分布情况比较 菌属数(%)Table 6 Comparison of the distribution of bacterial genera in CC patients before and after treatment counts(%)

2.5 CC患者治疗前后微生物分布特征比较

治疗前CC组患者菌落密集度异常和菌群多样性异常占比分别为60.00%和80.00%,治疗后CC组患者菌落密集度异常和菌群多样性异常占比分别为70.00%和90.00%,治疗前、后菌落密集度和菌群多样性异常情况比较差异无统计学意义(P>0.05,见表7)。

表7 CC患者治疗前后微生物分布特征比较 例(%)Table 7 Comparison of microbial distribution characteristics of CC patients before and after treatment cases(%)

3 讨论

宫颈疾病是目前临床常见的女性生殖系统疾病,从CIN发展至CC是一个持续性、漫长的过程,但临床症状不典型,无法引起患者的重视,部分患者就诊时已处于癌症阶段,治疗效果及预后普遍较差[9,10]。目前研究认为,阴道微生物分布特征及群落结构变化与宫颈病变的发生及发展密切相关[11,12],分析阴道微生态结构与宫颈疾病的关系有助于早期筛查宫颈疾病,对临床诊断及治疗方面发挥一定指导作用。

微生物群落平衡一般被认为是健康的标志。既往研究发现,健康女性的阴道菌门大部分由厚壁菌门组成,乳酸杆菌属是育龄妇女健康阴道细菌群落中发现的优势微生物属群,被认为是对抗病原体的第一道防线[13,14]。乳酸杆菌属在阴道中寄生,通过竞争营养来源、产生乳酸、细菌素及生物表面活性物质等代谢物对抗其他细菌的黏附和生长,达到一种微生态动态平衡,保护宿主阴道上皮细胞免受性传播感染,还可增强子宫颈到子宫的精子的活力[15,16]。据报道,在健康的阴道里还可生存25种其他微生物,包括加德纳菌属、奇异菌属、葡萄球菌、链球菌等,当乳酸杆菌属相对丰度下降,其他厌氧菌及杂菌快速生长,不仅破坏阴道防御机制,还可导致有害代谢物质堆积,外来病毒侵袭能力增强,最终诱导宫颈疾病的发生及发展,最终诱发CC[17,18]。本研究中,健康组、CCINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组和CC组受检者菌门分布以厚壁菌门为主,但占比逐渐下降,放射菌门、拟杆菌门、其他菌门占比逐渐增加。健康组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组和CC组菌属分布以乳酸杆菌属为主,但占比逐渐下降,加德纳菌属、奇异菌属、其他菌属占比逐渐增加,CC组患者以加德纳菌属为主,占比25.24%。说明当厚壁菌门、乳酸杆菌属相对丰度下降,微生物群落结构紊乱时,其他厌氧菌及杂菌过度生长,可诱导CIN及CC的发生及发展,早期监测女性阴道微生物群落结构变化,有助于早期预测宫颈疾病的发生风险,在临床筛查CIN及CC等宫颈疾病具有一定指导意义,适当调节阴道微生物变化有助于增强阴道防御系统,降低宫颈疾病的发生。

1994年,学者首次发现阴道微生物群分布改变与HR-HPV感染存在密切联系[19],当机体阴道乳酸杆菌属占比降低,厌氧菌过度生长时,阴道防御系统降低,HR-HPV感染风险越高,HPV病毒表达越强[20,21]。aniewski等[22]研究认为,泌尿生殖器微生物群与妇科癌症有关,特别是与CC的发生及发展密切相关。本实验中,CC组患者菌落密集度正常占比明显低于CINⅠ组;CIN Ⅲ组和CC组患者菌群多样性正常占比明显低于CINⅠ组。说明阴道微生物分布改变与宫颈疾病的发生、发展密切相关,与Mitra等[23]研究结果相近,该研究认为,阴道微生物群成分可能是未来预测宫颈疾病治疗效果及预后监测的生物标记物,同时也为制定新的预防和治疗战略提供参考。另外本研究发现,相较于治疗前,治疗后CC组患者厚壁菌门占比明显降低;治疗后CC组患者乳酸杆菌属占比明显降低。治疗后菌落密集度、菌群多样性异常占比较治疗前加重,但差异无统计学意义。说明CC治疗过程中可能影响阴道微生物的分布及群落结构改变,对阴道微生态造成不良影响,导致阴道乳酸杆菌属进一步减少,容易造成感染等并发症,究其原因,放化疗或手术治疗可对阴道优势菌群造成直接破坏,增加菌群多样性[24],另外放化疗也可通过损伤机体免疫功能及内分泌功能损伤阴道微生态[25],治疗期间监测阴道微生态改变可能帮助降低感染等并发症发生风险,有助于改善患者预后情况。

综上所述,在不同阶段宫颈病变中,阴道微生物分布特征、群落结构出现明显改变,CC治疗可能对阴道微生物分布特征、群落结构造成不良影响,因此治疗期间需关注阴道微生态失衡情况。但由于本研究纳入对象均为我院就诊人员,样本量较少,研究结果可能存在一定误差,另外由于本研究时间较短,尚未分析远期预后与宫颈病变女性阴道微生物分布特征、群落结构变化,未来将以此为方向进一步进行探究。