阿尔茨海默病唾液诊断生物标志物的研究进展

贾云琪,韩景献,张雪竹(天津中医药大学第一附属医院针灸科,天津 300380;国家中医针灸临床医学研究中心;通讯作者,E-mail:zhangxuezhu999@6.com)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一种常见的痴呆类型,属于不可逆的中枢神经系统退行性疾病类别,是老年人中常见的神经变性疾病,该疾病以认知障碍为主要临床表现。目前全球超过5 500万人患有痴呆,预测到2030年这一数字将达到8 200万[1],其中AD患者人数约占所有痴呆病例的70%[2],在中国AD的年龄标化发病率为(56.47～207.08)/10万[3]。此外,据世界阿尔茨海默病报告估计全球75%的痴呆症患者没有得到诊断,作为痴呆主要原因的AD,也因此在医学界备受关注。

AD有较长的临床前疾病阶段,随着检验技术的发展,越来越多的证据表明患者在发病前存在大脑微结构变化与体液代谢变化。AD患者如果在早期阶段得到及时诊断并接受治疗,甚至在前驱期预测到AD风险并采取一些非药物手段进行预防,这将会大幅延缓疾病进程,患者生存率将得到提高,并减轻社会及家庭的负担。

目前,AD的主流诊断方法是脑脊液(cerebro-spinal fluid,CSF)检测及正电子发射断层扫描成像(positron emission computed tomography,PET)。CSF检测需做腰椎穿刺手术,因其属于有创操作,导致患者在AD早期诊断阶段对CSF检测的接受程度并不理想。PET由于价格昂贵同样不适用于AD的早期诊断筛查,因此这些方法都不能在早期诊断治疗中进行普及。而唾液中可能存在潜在的AD生物标记物,有利于临床早期诊断、病情监测以及预后判断[4]。本文通过总结AD发生过程中相关唾液生物标志物的研究进展及不足,对AD诊断的唾液生物标志物今后的研究方向进行进一步讨论及展望。

1 中枢神经系统损伤相关标志物

1.1 淀粉样β蛋白(amyloid β protein,Aβ)

Aβ过度沉积是导致阿尔茨海默病发生的一个重要因素,而Aβ42则是人体内Aβ中最常见的亚型,以Aβ42通过错误折叠导致过度沉积形成的可溶性Aβ42低聚物,会在脑内形成淀粉样斑块,期间加速Tau蛋白过度磷酸化、神经元之间信号传递障碍,甚至诱导氧化损伤,并最终导致神经元死亡,因此Aβ过度沉积被认为是AD病理改变的关键环节。近年Boschi等[5]首次运用超灵敏ELISA技术检测唾液中Aβ42,发现AD患者唾液Aβ浓度显著高于对照组和非AD组,为对照组的两倍,且Aβ唾液浓度诊断AD在ROC分析中敏感性为84%,特异性为68%。虽然唾液中的Aβ42与AD在病理机制上的联系尚未明确,但多数研究结果显示,AD患者唾液中的Aβ42浓度升高,这一指标足以将AD与非AD区分开[6-8],这些研究结果都有力地证明了唾液Aβ42可成为诊断AD的生物标记物。

1.2 Tau蛋白

Tau蛋白是一种微管相关蛋白,主要表达于神经元细胞质与轴突中,其作用主要在于稳定神经元细胞骨架结构和调控神经细胞生长发育。在AD病理进程中,Tau蛋白的过度磷酸化使微管结构遭到破坏,并与Aβ共同作用增加细胞毒性[9],最终加速神经元死亡。在PET成像中,Tau病理聚集与AD患者的神经变性和临床表现密切相关[10]。Marksteiner等[11]研究运用Lumipulse技术发现,AD患者唾液总Tau(total-Tau,t-Tau)蛋白水平显著低于对照组,而磷酸化Tau-181(phospho-Tau-181,p-Tau-181)水平显著高于对照组,上述研究以轻度认知障碍(mild cognitive impairment,MCI)患者唾液内存在≥18 pg/mg的Tau蛋白,或AD患者唾液内存在≤300 pg/mg的Tau蛋白为诊断界值,实验室诊断准确率为71.4%。Cui等[12]研究表明,AD患者唾液的Aβ42水平明显比对照组的更高,Aβ40、t-Tau和p-Tau无明显变化,p-Tau/t-Tau和Aβ42/Aβ40与AD诊断有一定的相关性,并且这4种生物标志物联合检测对AD诊断的正确率在92.11%。到目前为止,唾液检测生物标志物研究中Aβ和Tau联合诊断AD的准确率最高,这类AD主流唾液生物标志物研究运用了超灵敏ELISA技术和Lumipulse技术等检测标志物的数据变化,在数据上使被检测标志物展现出了一定的诊断优势,但由于水的含量在唾液中比在血液中高,所以未来研究要想获得更精准的数据,就需要探索更加精确的检验技术,类似于血液Tau蛋白检测的免疫磁还原(IMR)和Simoa技术等等。

1.3 乙酰胆碱与乙酰胆碱酯酶

在AD病理进程中,乙酰胆碱缺乏会破坏脑内前额叶皮质神经元[13],而乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)作为中枢神经传导中一种关键性酶,能够降解乙酰胆碱,终止神经递质对突触后膜的兴奋作用,保证神经信号在生物体内的正常传递。Pea-Bautista等[14]提出,AD认知障碍患者的唾液乙酰胆碱呈高水平状态,AD患者唾液中肌醇、肌酸、谷氨酰胺、乙酰胆碱4项联合预测AD的敏感度为61%,特异性为92%。Ahmadi-Motamayel等[15]发现,AD患者的唾液AChE活性明显比健康受试者的高,并提出唾液AChE活性可用于老年AD患者的早期检测及AD患者的病情监测。但到目前为止,关于检测唾液AChE诊断AD方面的研究样本数量都较小,这种唾液生物标志物的临床有效性还需要进一步在大样本临床研究中验证。

2 炎症及氧化应激损伤相关的标志物

2.1 乳铁蛋白

乳铁蛋白(lactoferrin,LF)是一种具有抗炎特性的免疫蛋白,其存在于黏膜表面。已有研究发现LF与神经退行性疾病AD之间存在一定联系[16],可能与其能够防止细胞损伤和组织损伤有关。LF通过舌下黏膜进入脑内,并通过抗炎和抗氧化功能的结合来保护大脑完整性[17]。Reseco等[18]通过ELISA检测发现,唾液LF水平与人体脑内Aβ负荷的增加有关,其中唾液LF水平减少可能反映了Aβ对老年脆弱皮质区域的最早影响,脑内Aβ沉积会增加人体发生AD的风险,因此这项研究提示唾液LF水平检测在未来或许能够帮助预测AD进展。近年来,已有研究数据证明唾液LF有成为AD特异性诊断标志物的希望[19]。然而也有研究人员未在AD患者中发现唾液LF有特异性表现[20]。Antequera等[21]的一项研究表明,双转基因APP/PS1小鼠AD初始阶段存在唾液LF水平降低的现象,且这种情况在AD中度至重度阶段仍然存在。目前来看,研究间存在不一致的数据结果可能是因为研究对象存在疾病阶段差异,因此唾液LF成为AD诊断生物标记物还需要进行规范化临床调查研究进行验证,而关于研究实验前的AD精神诊断标准,未来研究应注重探索完善全球通用与地区通用的标准。

2.2 神经胶质纤维酸性蛋白

神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是星形胶质细胞的中间丝蛋白,同时也是星形胶质细胞活化的特异性标志物,对神经起保护作用。在AD唾液检测研究中,Katsipis等[22]分别运用ELISA与Dot blot技术检测唾液中GFAP浓度发现,与对照组相比,MCI患者的GFAP浓度有所减少;与MCI患者和对照组相比,AD患者的GFAP浓度显著降低;这两种不同的免疫学方法确定的同组GFAP水平之间没有发现显著差异,其中唾液GFAP诊断AD在ROC分析中已经通过ELISA推荐临界值(GFAP<4.0 ng/mg,约登指数为0.75,灵敏度为75%,特异性为100%)和Dot blot推荐临界值(GFAP<5.6 ng/mg,约登指数为0.6,灵敏度85%;特异性为75%),研究提示唾液GFAP有望成为AD诊断生物标志物之一,也提示AD患者唾液GFAP浓度降低的原因是AD患者体外表达GFAP的星形胶质细胞退化,从而影响唾液中GFAP水平。

2.3 氧化应激损伤相关产物

氧化应激中的糖基化与AD高度相关,晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)通过活性氧调节淀粉样前体蛋白表达,增强Aβ集聚,导致AD患者脑内的神经元死亡[23-25]。Choromańska等[26]研究发现区分痴呆患者组与对照组的非刺激产生唾液中最佳的荧光性AGEs值(AUC 0.85,P<0.001)为<1.451 RFU/mg蛋白,灵敏度为75.68%,特异性为75.86%。由于这项研究中呈现的结果强调了唾液AGEs可能是诊断痴呆的生物标志物之一,且AD属于痴呆的主要病因,所以未来唾液中氧化损伤物的检测可能会成为诊断AD的辅助手段。

3 口腔微生物群相关标记物

牙龈卟啉单胞菌是一种革兰氏阴性细菌,是口腔微生物群落的重要组成部分。牙龈卟啉单胞菌能够随着循环系统到达血脑屏障,并增加血脑屏障通透性[27]。已经有研究提出,部分口腔致病菌数量的增加以及随之而来的全身炎症的增加可能是与AD相关的因素之一,这可能有助于将来更好地完善AD临床诊断[28]。有研究表明,牙龈卟啉单胞菌在感染小鼠口腔后会进入脑内,最终导致小鼠脑内淀粉样斑块成分Aβ1-42的生成量增加[29]。Wu等[30]通过PacBio-SMRT测序平台确定了口腔微生物群可以辅助诊断AD,而且还发现与对照组相比,AD组微生物多样性较低,乳酸杆菌、链球菌和类杆菌的数量显著增加,梭杆菌和变形杆菌的数量显著减少。实际上相比于在唾液中检测,诊断AD的微生物在脑脊液中检测优势更大,微生物标记物在唾液中检测首要考虑因素就是牙周病等口腔疾病这类混在因素的干扰,因此微生物唾液诊断更偏向为AD辅助诊断手段。

4 代谢组学相关的标志物

研究人员可通过代谢组学技术观察到人体内所有小分子代谢物的数据表达变化[31],由于代谢紊乱在AD患者神经病理进展中发挥着重要作用,所以许多AD研究开始重视AD患者的代谢产物变化,目前,关于检测血液代谢物诊断AD方面的研究已经取得了一些进展[32,33]。一项调查AD患者血清代谢组学分析的研究显示AD患者血清代谢组学数据有助于进一步了解AD的发病机制[34],并且已有研究[35]通过观察AD患者唾液代谢组学数据发现,唾液代谢有着与血液代谢类似的动态变化,而且已初步证明唾液代谢物在AD生物标志物研究进展中存在重要开发价值,研究显示与MCI组相比,AD组唾液中的β-丙氨酸通路、柠檬酸循环、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、苯丙氨酸代谢等通路的显著上调。因此,相比于血液代谢组学检测,唾液代谢组学检测为AD唾液诊断提供了一种更简单的非侵入性方法。Marksteiner等[36]在AD研究中通过靶向代谢组学方法检测唾液,发现脂质紊乱在AD组和MCI组中十分突出,其中AD组患者唾液中的酰基-烷基-磷脂酰胆碱减少,表明AD患者唾液中存在特定的脂质周转率变化,且研究中的唾液脂质代谢产物可以成为识别AD患者的潜在生物标志物。也有研究开发出了快速超高效液相色谱-飞行时间质谱联用(FUPLC/MS)非靶向代谢组学方法作为识别AD患者唾液特征的平台,并根据预测模型,选择了胞苷和二氢鞘氨醇-1-磷酸代谢物作为主要候选生物标志物,用于预测MCI向AD的转化[37]。上述研究均证明了唾液代谢组学的相关生物标志物具有帮助AD患者获得正确诊断的潜力,但由于人体内唾液代谢产物是动态变化的,所以今后研究不仅仅只考虑规范收集样本的时间,还应考虑到许多老年患者的身体状况,研究是否会有合并疾病及服用过药物对样本数据的干扰。

5 遗传学及基因组学相关的标志物

5.1 载脂蛋白Eε4

载脂蛋白Eε4(apolipoprotein E epsilon 4,ApoE4)等位基因是AD的主要遗传危险因素[38,39]。ApoE4等位基因在AD的淀粉样斑块沉积、神经原纤维缠结形成和神经炎症中都有重要作用[40-43]。González等[44]优化了Sanger测序,并从唾液中提取出DNA序列,分析了AD患者的ApoE基因型,研究发现与对照组相比,迟发性AD患者(34%)的ApoE4等位基因频率增加了8.5倍。提示尽管ApoE4等位基因不能作为明确的AD诊断物,但有作为AD风险预测因子的潜力。

5.2 DNA甲基化

DNA甲基化是参与AD发生的关键因素之一,在AD病理进展中,PP2A低甲基化诱导tau磷酸化发生,最终导致神经原纤维缠结[45],胚胎大脑中由DNA甲基化控制表达的海马突触肽基因能够调控中枢神经系统,该基因与神经发育和精神疾病相关,DNA甲基化又与脑内海马区的突触可塑性有关,当海马区内出现全局DNA甲基化不平衡时,海马体的完整性会遭到损坏,导致神经炎症和细胞应激等病理表现的增加[46,47]。此外,脑部前额叶皮层(prefrontal cortex,PFC)突触功能相关基因表达下的DNA甲基化,与衰老和年龄相关的认知障碍有关[48],而在2型糖尿病引起的认知障碍小鼠PFC中,参与突触稳态性的蛋白质降低,基因启动子位点CpG岛甲基化百分比会增加[49]。

有研究发现在AD病理早期阶段,人体额叶皮层的基因组中有71个离散CpG位点二核苷酸表现出与AD相关的DNA甲基化水平变化[50],这种变化一般发生在AD出现症状的初始阶段。脑部PFC基因组中的DNA甲基化差异在AD的Braak病理分期中发挥着重要作用,在PFC和血液中的多数CpG位点提示,大脑和血液中DNA甲基化水平之间的相关性适中[51],然而与血液相比,唾液中的DNA甲基化水平更类似于脑组织中的水平[52],这可能是由于外胚层主要形成表皮和神经系统,唾液中的大量细胞来自于表皮组织颊黏膜上皮,它与中枢神经系统的组织细胞起源相同[53]。而关于唾液中颊黏膜上皮细胞在AD方向的研究很少,主要集中在细胞核内的端粒结构、DNA结构等[54,55],目前尚无关于唾液内颊黏膜细胞DNA甲基化与AD诊断的相关研究。

Sommerer等[56]在对神经退行性疾病患者和对照组的尸检中,通过Illumina甲基化阵列检验口腔中颊黏膜上皮细胞和人脑PFC中的DNA甲基化,结果显示在约25 000个CpG位点(约为总位点数量的3%)中,两种组织存在显著的Spearman等级相关性,其中99%的CpG位点在两种组织中呈正相关,提示该条件下两种组织中DNA甲基化模式一致。因为口腔中检测的DNA甲基化可能会被口腔内细菌DNA干扰,所以有研究使用Illumina甲基化阵列与焦磷酸测序检测唾液中DNA甲基化,从中提取了高质量的甲基化谱,排除了口腔内的细菌对实验的影响[57],这与之前的多类生物标志物相比,唾液DNA甲基化在AD诊断中的应用优势很明显。先前研究人员在一项唐氏综合征与DNA甲基化的研究中,选取了颊细胞的全基因组包括APP基因,检验DNA甲基化模式,发现3 300个CpG位点在组之间的差异甲基化,并在其中发现了与AD病理学相关的TSC2基因探针[58]。这或许提示,未来在唾液生物标志物和AD诊断的研究中,还可以考虑从唾液DNA甲基化位点作为切入点,探索AD的诊断甚至靶向治疗。

6 总结与展望

唾液检测在AD诊断中的主要优势是简便、安全,可在短时间内重复收集,并属于非侵入性的标本采集。与血液、脑脊液采集等侵入性方法相比,唾液检测能够避免伤口感染,心理上也更容易接受。而在疾病后期,唾液诊断实际上对于AD这类有着认知障碍和运动障碍的高龄患者来说,更容易操作。不过,目前还没有文献明确提出基于唾液生物标志物可以进行AD诊断及疾病进展甚至预后的监测。且迄今为止并没有文献确定,仅单一的唾液生物标记物即可对AD进行诊断。展望未来,AD诊断唾液生物标记物可能是一组生物标志物,且最有可能是组合型的,即能与其他非唾液标记物联合诊断AD或判断AD发生风险指数。在疾病诊断过程中,唾液样本采集的明显缺点包括牙周组织疾病、口腔内食物残渣,甚至吸烟等干扰,因此以后的AD唾液生物标记物研究应在标本采集方法、采集时口腔状态、检测技术等方面更加注意严谨操作。现在关于生物标志物在疾病诊断与监测方面所需的技术研究越来越受到重视,但这项工作未来还需要收集更精确的临床样本数据。到目前为止,关于AD研究使用的诊断标准多种多样,这提示研究人员在今后临床方向的研究中,不仅要考虑规范样本采集,还要考虑尽量规范临床诊断标准,这样才能最大程度地保证研究中呈现的数据结果能够准确反映要解决的临床问题。如今,AD诊断在唾液生物标记物方面的研究并不只在于发现新的诊断标记物,还在于验证那些有诊断潜力的生物标记物,开发足够灵敏的检测方法,并阐述它们的使用方法。