HPLC法同时测定羌活药材中甲基托布津和辛硫磷农药的残留

周瑞雪,连云岚,郝云芳,冯 贞,李民生,张远芳,李 倩,崔广青(山西省检验检测中心药品检验技术研究所生物制品室,太原 03000;山西省检验检测中心药品检验技术研究所中药室;通讯作者,E-mail:450889749@qq.com)

农药残留(pesticide residues)指使用农药后一个时期内没被分解而残留在生物体、收获物、水体、环境和空气中微量的农药原体、有毒的代谢物以及杂质的总称。农药对农林收获物和空气、水、土壤等的污染,大多源于农药的利用率偏低以及农药的施用不合理[1]。如何合理、高效地施用农药,提升农产品质量安全,同时不断开发灵敏、快速、高效的农残检测技术,对保障人体健康、改善农产品质量及减少环境污染具有重要意义[2]。

目前应用于农药检测的前处理方法很多,其中常用的有:液液萃取法、固相萃取法、固相微萃取法和分散液相萃取法等[3-5]。苯并咪唑类农药仪器分析主要集中在多菌灵(即辛硫磷)和噻菌灵的同时检测分析,而同时测定农产品中多菌灵和甲基托布津种苯并咪唑类农药的方法仅在国外文献中有部分报道[6]。同时检测羌活药材中常见的这两种农药甲基托布津和辛硫磷,未见文献报道。震荡法具有提取效率高、操作方便等优点,因此本试验采用震荡提取结合高效液相色谱法来对羌活样品中的辛硫磷和甲基托布津进行提取分析,旨在建立一种操作简单、易于推广应用、并可满足羌活药材中辛硫磷和甲基托布津残留量同时测定的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料

Agilent 1260高效液相色谱仪购自安捷伦科技公司,CM-1000型高速振荡机购自上海爱朗仪器有限公司,乙腈(色谱纯)和甲酸(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司。

甲基托布津标准溶液(1 000 μg/L),购自农业部环境保护科研监测所;辛硫磷标准溶液(1 000 μg/L),购自农业部环境保护科研监测所。

收集的羌活药材及饮片为国家药品监督管理局组织的全国评价性抽验专项任务样品,分别来自于四川、安徽等药材生产基地和全国批发零售企业等地的抽样,样品共计202批次,取适量进行粉碎,分别过四号筛,即为所需羌活药材粉末。

1.2 溶液配制

1.2.1 标准溶液配制 将甲基托布津和辛硫磷用乙腈分别配制成甲基托布津0.67 mg/mL、辛硫磷0.20 mg/mL的母液,置于-20 ℃冷冻保存。临用现配,稀释成约20 μg/mL的溶液。

1.2.2 液相色谱条件 硅胶柱C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为乙腈与0.1%甲酸(含10 mmol/L甲酸铵)(70∶30),柱温30 ℃,流速为0.8 mL/min,检测波长为280 nm,进样量10 μL。

1.2.3 供试品溶液制备 取羌活药材粉末约3 g,加入氯化钠约5 g,精密加入10 mL含0.1%甲酸的乙腈溶液,置于100 mL具塞量筒中,避光操作,猛烈振摇150次,放置1 min,再振摇100次,静置1 h,经过0.25 g无水硫酸钠及0.45 μm滤膜滤过,取续滤液即得。

1.3 样品前处理因素的筛选

1.3.1 样品前处理提取溶剂的选择 参照文献[7],本研究分别对乙酸乙酯、乙腈及0.1%甲酸的乙腈溶液几种提取溶剂进行了考察。

1.3.2 样品前处理提取方法的选择 参照文献[7,8],分别对这两种提取方法进行考察:涡旋1.5 min后静置1 h;或样品加氯化钠共同振摇2遍,每遍100次左右,然后静置1 h,用无水硫酸钠过滤。

1.3.3 检测波长的选择 分别对甲基托布津和辛硫磷标准品进行全波长光谱扫描,选择最优检测波长。

1.4 方法学考察

1.4.1 线性关系及检出限的考察 取约20 μg/mL的甲基托布津及辛硫磷对照溶液,分别按照1,2,4,6,8,10 μL进样,按上述1.2.2项下色谱条件测定,计算此两种农药的对照溶液标准曲线。

1.4.2 方法精密度及回收率试验 取约3 g羌活药材粉末,分别添加不同体积的甲基托布津和辛硫磷标准品储备液,制得不同浓度的回收率待测样品,按照供试品溶液制备方法对样品进行提取及净化,通过外标法定量的方法,计算出各自相应的平均回收率及相对标准偏差。

1.4.3 稳定性试验 甲基托布津和辛硫磷皆对光和热比较敏感,所以对两者的稳定性进行了相关的试验。将此二者标准溶液分别放在棕色进样瓶中,置于液相仪器进样盘上,无光进入,在实验室常规环境中,在16 h内连续检测标准品变化情况,考察稳定性。

1.5 验证实验

检测全国产地及药材市场收集的202批次羌活药材中甲基托布津和辛硫磷两种农药残留的含量,按1.2.3供试品溶液制备方法进行处理,每个供试品处理2份平行样,按1.2.2液相色谱条件检测,采集谱图峰面积。根据峰面积计算含量。

2 结果

2.1 样品前处理提取溶剂的选择

经对样品前处理提取液进行考察,结果发现,使用0.1%甲酸的乙腈溶液作为提取溶剂时,目标物回收率有较明显提高(见表1),因此选择使用含0.1%甲酸的乙腈溶液作为提取溶剂。

表1 样品前处理提取溶剂的选择Table 1 Selection of extraction solvents for sample pretreatment

2.2 样品前处理提取方法的选择

对羌活药材粉末前处理提取方法考察结果显示,药材粉末加入0.1%甲酸的乙腈溶液进行涡旋1.5 min后静置1 h提取,甲基托布津和辛硫磷回收率分别为71.55%和65.01%;羌活药材粉末加0.1%甲酸的乙腈和氯化钠共同振摇2次,每次100次左右,然后静置1 h,用无水硫酸钠过滤的提取方法,回收率分别为101.33%和88.59%。第二种方法回收率更高,因此作为供试品前处理提取方法。

2.3 检测波长的选择

经对甲基托布津和辛硫磷标准品进行全波长光谱扫描,光谱图显示分别在267 nm和283 nm处有最大吸收峰(见图1),参考文献[9,10]并综合考虑,因此选用280 nm作为检测波长。

图1 甲基托布津和辛硫磷全波长扫描光谱图Figure 1 Full-wavelength scanning spectrogram of thiophanate-methyl and phoxim

2.4 线性关系及检出限的考察

建立甲基托布津和辛硫磷这两种农药的对照溶液标准曲线,结果见表2。从表2中可以看出甲基托布津和辛硫磷这两种农药的线性相关性较好,R2均大于0.995,按照信噪比即S/N=3得到该方法对甲基托布津和辛硫磷的仪器检测限分别为4 ng/mL和3 ng/mL,可以满足目前国内对蔬菜水果样品的最高残留限量标准0.05 mg/kg的检测要求。

表2 两种农药标准曲线方法线性方程、线性相关系数及检出限Table 2 Standard curve linear equation, linear correlation coefficient and detection limit for two pesticides

2.5 方法精密度及回收率试验

通过外标法定量的方法,计算甲基托布津和辛硫磷各自相应的平均回收率及相对标准偏差,测定结果见表3。从表3中的测定结果可以看出,甲基托布津和辛硫磷在不同添加量时的回收率均较高,相对标准偏差值较低,重现性也比较理想。甲基托布津的回收率为92.14%～112.56%,辛硫磷的回收率为87.85%～103.45%。

表3 两种农药成分回收率及精密度试验结果Table 3 Results of recovery rate and precision test of the two pesticides

2.6 稳定性试验

取羌活药材粉末,按1.2.3供试品溶液制备方法进行处理,得供试品溶液,2～8 ℃放置,分别于1,2,3,6,8,12,16 h上样检测,采用1.2.2液相色谱条件检测,采集谱图峰面积。结果显示,16 h以内的峰面积的RSD分别为0.45%和1.02%,表明溶液在16 h内稳定。

2.7 样品农药残留含量检测结果

对202批次羌活药材样品进行检测,测出疑似辛硫磷样品为36批次,含量范围为10.18～87.73 μg/g;甲基托布津样品为15批次,含量范围为0.19～1.66 μg/g其中两者均检出的有3批次,甲基托布津和辛硫磷对照品液相色谱图及羌活药材样品液相色谱图,并将相应峰进行光谱确认,结果见图2。

图2 羌活药材阳性供试品液相色谱图和光谱图Figure 2 Liquid chromatogram and spectrum of Notopterygium incisum positive sample

3 讨论

甲基托布津和辛硫磷为羌活药材种植中常用的农药,对人体有一定的毒性,使用过程中难免会有残留,但目前尚未见到羌活药材常用的农药残留相关文献报道。甲基托布津和辛硫磷2种成分对温度和光较敏感,尤其见光易分解,所以对羌活药材样品前处理过程中要注意避光操作。本文建立的检测方法,使用氯化钠粉末和无水硫酸钠粉末进行两步除杂净化,不需要昂贵的净化小柱,检测成本较低,更经济,且前处理操作简单,方法的灵敏度、准确度和精密度均较高。故本文建立的方法有较好的使用价值,适合大范围推广,能满足羌活药材农药残留的定量检测要求,可用于羌活药材中常用农药甲基托布津和辛硫磷的残留检测。