三色藜麦多糖含量测定及其抗氧化研究

◎ 于智远，张 楠，田向阳，何春龙

（内蒙古医科大学 药学院，内蒙古 呼和浩特 010110）

藜麦是一年生的藜科双子叶草本作物，其籽实麸皮呈红、白、黑三色，在20 世纪90 年代引入我国。藜麦中含有8 种人体必需氨基酸、多糖、多酚、黄酮等活性物质[1]。藜麦可以起到调节免疫应答和内分泌系统、均衡人体所需营养、修复机体损伤、强健体魄的功能。内蒙古自治区作为藜麦的主产地之一，市场占有率很高。本文通过超声提取法测定内蒙古自治区红、白、黑3 种不同颜色藜麦的多糖含量，并比较藜麦多糖的抗氧化性[2-8]，为内蒙古自治区藜麦的质量评价和推广应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

藜麦（红色、白色、黑色）为市场采购，产地为乌兰察布。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（批号：110773-101915），合肥巴斯夫生物科技有限公司；无水葡萄糖对照品，国药集团化学试剂有限公司；蒸馏水。

TU-1901 型紫外可见分光光度计，北京普析通用有限责任公司；SB25-12 DTD 超声仪，宁波市新芝生物科技股份有限公司；分析天平（十万分之一、万分之一），赛多利斯科学仪器有限公司；TQL-20M 高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；HYCD-282C 医用冷藏冷冻箱，青岛海尔生物医疗股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 藜麦预处理

将红、白、黑这3 种颜色的藜麦置于烘箱中烘干至恒重，粉碎过40 目筛，密封备用。①脱脂：分别取3 种颜色藜麦粉5.0 g 于离心管中，各加入50 mL 石油醚，离心管静置过夜，4 000 r·min-1离心10 min，弃去上清液，残渣挥干石油醚。②除单糖和低聚糖：向上述残渣中加入50 mL 95%乙醇，静置过夜，4 000 r·min-1离心10 min，弃去上清液，残渣挥干溶剂。收集藜麦残渣并放入减压干燥箱中，干燥至恒重。

1.2.2 藜麦多糖提取

取处理后的藜麦残渣加入适量蒸馏水后，在超声功率300 W、超声时间30 min、超声温度60 ℃条件下超声提取藜麦多糖后，4 000 r·min-1离心10 min，将上清液倒入另一个离心管中，向离心管中加入4 倍体积的95%乙醇，置于4 ℃冰箱中醇沉24 h。接着4 000 r·min-1离心10 min，收集沉淀。沉淀依次用无水乙醇和丙酮洗涤后，低温减压干燥，得到藜麦多糖。

1.2.3 藜麦多糖提取试验优化

取藜麦粉末适量，按照“1.2.1”方法处理，残渣按照“1.2.2”方法，按照不同料液比，即藜麦残渣∶水（g∶mL）（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30），采用超声波提取法，在超声功率300 W，超声温度60 ℃，超声30 min，提取3 次的条件下，提取藜麦多糖，计算多糖提取率。藜麦多糖提取率=藜麦多糖重量/藜麦粉末称样量×100%。

1.2.4 标准曲线制备

取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成0.1 mg·mL-1葡萄糖对照品溶液。精密量取对照品溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL 和0.5 mL，分别置于6 支10 mL 具塞试管中，分别加蒸馏水2 mL、1 mL 5%苯酚溶液、5 mL 硫酸，蒸馏水稀释至刻度，摇匀，配制成浓度分别为0 mg·mL-1、0.001 mg·mL-1、0.002 mg·mL-1、0.003 mg·mL-1、0.004 mg·mL-1和0.005 mg·mL-1的葡萄糖对照品溶液，放置10 min 后，40 ℃水浴15 min，取出，迅速冷却至室温，以浓度为0 mg·mL-1的试管为空白对照，分别在517 nm 波长下测定吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖对照品浓度（mg·mL-1）为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.5 精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验

（1）精密度试验。取“1.2.4”项下葡萄糖对照品溶液（0.1 mg·mL-1）0.2 mL，置于10 mL 具塞试管中，另取1 支10 mL 具塞试管做空白对照管，分别加蒸馏水2 mL，5%苯酚溶液1 mL、硫酸5 mL，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放置10 min 后，40 ℃水浴15 min，取出，迅速冷却至室温，以空白对照管为空白对照，在517 nm 波长下测定吸光度。重复测定6 次，记录吸光度值，计算吸光度值的RSD，考察精密度。

（2）稳定性试验。取黑色藜麦样品2 g，按照“1.2.1”“1.2.2”方法，“2.1”确定的最佳提取条件制备黑色藜麦多糖，加蒸馏水溶解并稀释至500 mL容量瓶刻度线，摇匀，精密量取该溶液0.1 mL 至10 mL具塞试管中，其余操作按照“1.2.5”项下“精密度试验”方法操作，在517 nm 波长下，分别于0 min、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min和150 min 测定吸光度，计算吸光度值的RSD，考察溶液的稳定性。

（3）重复性试验。取黑色藜麦样品约2 g，共6 份，按照“1.2.1”“1.2.2”方法，“2.1”确定的最佳提取条件分别制备黑色藜麦多糖，分别加蒸馏水溶解并稀释至500 mL 容量瓶刻度线，摇匀，从中分别精密量取该溶液0.1 mL 至6 支10 mL 带塞试管中，其余操作按照“1.2.5”项下“精密度试验”方法操作，在517 nm波长下分别测定其吸光度，并代入“1.2.4”项下标准曲线，计算多糖浓度，计算每份样品的多糖含量，并计算RSD，考察重复性。

（4）回收率试验。取黑色藜麦样品约1 g，共6 份，分别加入葡萄糖对照品60 mg，按照“1.2.1”“1.2.2”方法，“2.1”确定的最佳提取条件分别制备黑色藜麦多糖，加蒸馏水溶解并稀释至500 mL 容量刻度线，摇匀，从中分别精密量取该溶液0.1 mL 至6 支10 mL带塞试管中，其余操作按照“1.2.5”项下“精密度试验”方法操作，在517 nm 波长下分别测定其吸光度，并带入“1.2.4”项下标准曲线，计算相应多糖浓度、含量、回收率、平均回收率和RSD，考察准确度。

1.2.6 藜麦多糖含量的测定

分别取3 种颜色的藜麦样品各2 g，每种颜色各3 份，按“1.2.1”“1.2.2”方法，“2.1”确定的最佳提取条件分别制备藜麦多糖，分别加蒸馏水溶解于500 mL 容量瓶，摇匀，从中分别精密量取该溶液0.1 mL至10 mL 带塞试管中，其余操作按照“1.2.5”项下“精密度试验”方法操作，在517 nm 波长下分别测定吸光度，并带入“1.2.4”项下标准曲线，计算多糖浓度。多糖含量的计算公式为

式中：C为由标准曲线计算出的多糖浓度，mg·mL-1；W为藜麦粉末称样量，g。

1.2.7 藜麦多糖体外抗氧化活性测定

（1）溶液的制备。①DPPH 供试液的配制。精密称取50 mg DPPH，用无水乙醇溶解并定容到100 mL棕色量瓶中，摇匀。精密量取10 mL DPPH 溶液至另一100 mL 棕色量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，得到浓度为0.05 mg·mL-1的DPPH 供试液（a）。②藜麦多糖溶液的配制。分别取0.05 g、0.10 g、0.20 g、0.25 g 和0.30 g 的三色藜麦多糖置于100 mL 容量瓶中，用蒸馏水溶解并稀释至刻度，配制成浓度分别为0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1和0.30 mg·mL-1的多糖供试液（b）。

（2）DPPH 自由基清除试验。分别取1 mL 不同浓度的多糖供试液（b）至10 mL 棕色容量瓶中，再加入4 mL 的DPPH 供试液（a），蒸馏水定容并摇匀，在室温下静置约30 min，在517 nm 处测定吸光度A1，同时测定1 mL 蒸馏水与4 mL DPPH 供试液（a）混匀静置30 min 后的吸光度A2，按照DPPH 自由基清除率=[(A2-A1)/A2]×100%计算不同浓度下三色藜麦多糖对DPPH 自由基的清除率。

2 结果与分析

2.1 藜麦多糖提取试验优化

由图1 可知，藜麦多糖的提取率随着提取液用量的增加逐渐增大，当料液比为1 ∶25 时，藜麦多糖的提取率最高，为5.37%，而继续增加提取液用量时，提取率开始下降，故确定最佳料液比为1 ∶25。因此，藜麦多糖最佳提取条件为超声功率300 W、提取温度60 ℃、提取时间30 min、料液比1 ∶25、提取次数3 次。

图1 不同料液比对藜麦多糖提取率的影响图

2.2 标准曲线

由图2 可知，葡萄糖对照品的线性回归方程为y=107.4x-0.053，R2=0.999 1。

图2 葡萄糖对照品标准曲线图

2.3 精密度、稳定性、重复性和回收率试验

2.3.1 精密度试验

由表1 可知，葡萄糖对照品溶液的RSD为1.15%，不超过2.0%，表明仪器精密度良好。

表1 精密度试验结果表

2.3.2 稳定性试验

由表2 可知，黑色藜麦制备的多糖溶液在不同时间下的RSD为1.96%，不超过2.0%，表明藜麦多糖溶液在150 min 内的稳定性较好。

表2 稳定性试验结果表

2.3.3 重复性试验

由表3 可知，黑色藜麦平行测定6 份的RSD为1.42%，不超过2.0%，表明该方法重复性良好。

表3 重复性实验结果表

2.3.4 加标回收率试验

由表4 可知，黑色藜麦的平均回收率为99.48%，RSD为0.40%，表明方法的准确度良好。

表4 加标回收率试验结果表

2.4 藜麦多糖含量测定

由表5 可知，黑色藜麦多糖的平均含量为6.007%，白色藜麦多糖的平均含量为6.874%，红色藜麦多糖的平均含量为5.965%。

表5 藜麦多糖含量测定表

2.5 抗氧化活性测定

由表6 可知，3 种颜色藜麦多糖的DPPH 自由基清除率均随着藜麦多糖浓度的增加而增高，其中白色藜麦多糖在同一浓度下的抗氧化活性最高，黑色藜麦多糖抗氧化活性最低，当白色藜麦多糖浓度为0.30 mg·mL-1时，清除率达到了85.73%。

表6 藜麦多糖抗氧化活性测定结果表

3 结论

综上可知，不同颜色的藜麦多糖含量以及抗氧化活性能力不同。其中，白色藜麦多糖含量最高，红色藜麦最低。白色藜麦多糖抗氧化活性最高，黑色藜麦最低。藜麦虽然是一种食品，但在营养保健、医药领域方面表现出很大的优势，被人们越来越重视。本文通过对藜麦多糖含量的测定和抗氧化作用的研究，可为藜麦的进一步深加工提供参考。