银杏叶提取物基于TLR4/NF-κB通路对骨质疏松大鼠的干预效果及作用机制

詹兴洪 章国荣 罗鸿波 柯学英 魏俊杰

骨质疏松属于多因素导致的集体骨组织以单位体积量降低的一种病症,该疾病会令机体骨硬度降低,脆性增加,同时会伴随骨微细结构的破坏,严重者会诱发慢性骨代谢及骨质性疾病。骨质疏松伴随全身性的肌无力及骨疼痛,对患者生活质量及身心健康造成严重影响[1-2]。骨质疏松的临床表现则是成骨细胞功能的降低及吸收的增加,且由于线粒体损伤加剧,机体氧化应激反应加剧[3]。银杏叶提取物有发挥抗氧化剂以此抑制过氧化脂质、清除氧自由基的作用,同时对微循环及细胞膜损伤也有一定改善作用[4]。相关研究显示,TLR4/NF-κB信号通路激活后会引起下游效应,改变机体中相关因子表达[5],在骨质疏松发病中发挥重要作用本研究以骨质疏松大鼠为实验对象,分析银杏叶提取物基于TLR4/NF-κB通路对骨质疏松大鼠的干预效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1 研究动物 选取周龄在4～6周的SPF健康雌性SD大鼠40只,平均体重(116±10) g,由浙江中医药大学实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK(浙)2021-0001。将全部大鼠均置于动物饲养室内,保证温度保持在(23±2)℃,室内光线充足,良好通风,昼夜节律12 h,相对湿度保持在50%～60%,定期清扫鼠笼、消毒,及时更换垫料,允许其自由摄食普通饲料及清洁水,保持1周适应性饲养时间。

1.2 主要试剂 国际通用银杏叶标准品(恒凯银杏制品有限公司);水合氯醛溶液(大连宝生物工程有限公司);酶联免疫检测相关试剂盒(上海美轩生物科技有限公司);己烯雌酚(Sigma公司);离心机(北京离心机厂);DM500型光学显微镜(赛默飞世尔科技);酶标仪(美国ABI公司)。苏木素伊红(HE)染色试剂盒(郑州市博奥实验器材有限公司);电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 方法 将40只大鼠随机分为4组,组别分别为对照组(A组)、骨质疏松组(B组)、阳性药物己烯雌酚组(C组)、银杏叶提取物(D组),每组10只。第2周建模,用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔麻醉B组、C组、D组大鼠,取仰卧位固定在手术台上,备皮消毒,于腹正中纵行切开大鼠皮肤2～3 cm,使用钝性分离大鼠腹部肌肉,进入腹腔后摘除大鼠双侧卵巢,将组织放置好后逐层缝合。造模3个月后,每组随机抽取1只大鼠进行股骨组织病理形态观察,确定造模成功。饲养3个月后起给予药物干预,C组大鼠给予己烯雌酚0.05 mg·kg-1·d-1,D组大鼠给予银杏叶提取物,以每日200 mg/kg的剂量给药,给药方式均采用灌胃给药。C组、D组进行药物干预6周,与此同时,A组、B组每天给予1 mL/100 g 0.9%氯化钠溶液灌胃。

1.4 指标观察

1.4.1 样本采集:给药周期满6周后,对大鼠禁水、禁食12 h,10%水合氯醛溶液(0.3 mL/100 g)注射大鼠腹腔进行麻醉,静待,成功后取大鼠主动脉血5 mL,然后于3 000 r/min条件下,离心15 min,置于-70℃低温中保存。处死大鼠,取出股骨组织,进行固定,包埋组织,切片后利用石蜡块固定,切4 μm厚切片,置于60℃烤箱烘烤,置于4℃低温中备用。

1.4.2 病理组织学观察:取出切片,HE染色后中性树胶封片,倒置显微镜下观察骨组织病理形态改变。

1.4.3 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、25-羟基维生素D3(25-hydroxyvitamin D3,25OHD)、抗酒石酸盐酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRACP)、钙离子(calcium ion,Ca2+)、镁离子(magnesian ion,Mg2+)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase,CAT)测定:将血清样本取出,在室温环境中静置后利用试剂盒酶标板进行检测,将血清样本用稀释液稀释,比例为1∶2,首先向反应孔中加入100 μL稀释成功的标准品,在37℃恒温箱中孵育2 h,然后利用洗涤液洗涤3次,加入100 μL抗体工作液,再次将其置于上述恒温环境中孵育60 min,洗涤3次后加入100 μL终止液终止反应,于450 nm波长出测定吸光度,绘制ALP、OPG、25OHD、TRACP、Ca2+、Mg2+、SOD、GSH-Px、CAT水平曲线。

1.4.4 蛋白免疫印迹(Western blot)法检测股骨组织toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)蛋白:取大鼠股骨组织依照1∶5加入裂解液裂解、匀浆、提取总蛋白,经电泳、转膜后,5%脱脂牛奶封闭2 h,加入一抗(1∶300),过夜孵育。加入二抗(1∶5 000),常温孵育2 h,显影、定影、冲洗、晾干,扫描胶片,采用Image J软件分析TLR4、NF-κB表达。

2 结果

2.1 病理组织学观察 A组大鼠骨小梁十分饱满、粗壮,其壁排列有序、紧密,形态结构十分完整,厚度、面积、密度均正常,且骨间隙较小。B组大鼠骨小梁变薄、变细,有扭曲、断裂现象,其形态结构较差;C组、D组大鼠骨小梁虽然有变薄现象,但排列较为整齐,且可以连接成网,面积、密度、厚度都较为正常,部分区域骨间隙有略微增大,D组骨组织状况更为良好。见图1。

图1 4组大鼠病理组织学(HE×40)

2.2 骨代谢指标比较 与A组比较,B、C、D组ALP水平升高,OPG、25OHD水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);与B组比较,C组、D组ALP水平降低,OPG、25OHD水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与C组比较,D组ALP水平降低,OPG、25OHD水平升高,差异有统计学意义(P<0.5)。见表1。

表1 骨代谢指标比较 n=10,

2.3 血清TRACP、Ca2+、Mg2+表达比较 与A组比较,B、C、D组TRACP表达升高、Ca2+、Mg2+表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);与B组比较,C、D组TRACP表达降低,Ca2+、Mg2+表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);与C组比较,D组TRACP表达降低,Ca2+、Mg2+表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 血清TRACP、Ca2+、Mg2+表达比较 n=10,

2.4 氧化应激指标比较 与A组比较,B、C、D组MDA水平升高,SOD、GSH-Px、CAT水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);与B组比较,C、D组MDA水平降低,SOD、GSH-Px、CAT水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与C组比较,D组MDA水平降低,SOD、GSH-Px、CAT水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 氧化应激指标比较 n=10,

2.5 TLR4、NF-κB蛋白表达比较 与A组比较,B、C、D组TLR4、NF-κB表达升高(P<0.05);与B组比较,C、D组TLR4、NF-κB表达降低(P<0.05);与C组比较,D组表达更低(P<0.05)。见图2,表4。

表4 TLR4、NF-κB蛋白表达比较 n=10,

图2 TLR4、NF-κB蛋白表达WB图

3 讨论

骨质疏松以单位体积内骨量降低、骨失衡、骨吸收为主要临床表现[6,7]。随着年龄的增加,机体氧化应激系统中清除能力降低,且细胞线粒体功能进一步降低,影响氧化应激过程,相关骨细胞逐渐凋亡,另外,细胞线粒体功能的降低也会对骨细胞的增殖、分化也有一定抑制作用[8-9]。银杏叶提取物中含有白果内酯、银杏内酯、黄酮甙类等成分,这些成分对骨质疏松临床症状的缓解有一定作用[10]。

ALP、OPG、25OHD属于最为常见的骨代谢指标[11]。本研究结果显示,采用银杏叶提取物治疗的骨质疏松大鼠骨小梁排列较为整齐,且可以连接成网,面积、密度、厚度都较为正常,骨组织状况改善程度明显,ALP水平降低水平显著,OPG、25OHD水平升高水平显著。提示银杏叶提取物可以有效改善机体骨代谢状态,其原因可能与促进骨形成和抑制骨吸收有关,TLR4/NF-κB信号通路是抑制破骨细胞的关键性通路,在银杏叶提取物抑制作用下,TLR4/NF-κB信号通路会有诱导成熟破骨细胞凋亡,干扰其特异性基因表达,最终会影响骨吸收和骨代谢[12-13]。本研究结果显示,采用银杏叶提取物治疗的骨质疏松大鼠TRACP表达降低水平显著,Ca2+、Mg2+表达升高水平显著,提示银杏叶提取物会降低TRACP活性,阻碍破骨细胞吸收,改善机体Ca2+、Mg2+水平。

氧化应激因子会参与骨形成与骨吸收过从,随着骨质疏松病情的加深,骨组织中骨细胞与成骨细胞存活、形成数量会逐渐降低,破骨细胞活动、分化会逐渐强化[14]。其中,MDA属于脂质过氧化作用的关键性物质,SOD、GSH-Px、CAT则是机体中抗氧化的重要因子[15-16]。本研究结果显示,采用银杏叶提取物治疗的骨质疏松大鼠MDA水平降低显著,SOD、GSH-Px、CAT水平升高显著,提示银杏叶提取物可以有效抑制骨质疏松大鼠的氧化损伤,而其中的作用机制可能与骨组织的磷酸化相关。

TLR4属于重要信号通路蛋白之一,可以有效识别病原分子,在相关辅助受体结合后会传递信号,结构域会发生活化,最终引发自磷酸化[17-18]。NF-κB则在炎性因子中产生,细胞凋亡及外基质交联都会通过该信号转导,其不仅会参与机体磷酸化,还会在泛素化中有水解作用,进而调控诱导机体相关基因表达[19-20]。本研究结果显示,采用银杏叶提取物治疗的骨质疏松大鼠TLR4、NF-κB表达处于显著降低的状态。提示银杏叶提取物可能会抑制TLR4/NF-κB,进而阻碍其活化激磷酸化的形成,对细胞损伤及骨代谢有积极的调控作用,同时对机体氧化反应有一定改善作用。

综上所述,银杏叶提取可能会通过抑制TLR4/NF-κB通路活化来改善骨质疏松大鼠骨代谢水平及氧化应激反应,影响破骨细胞吸收,同时会调节机体Ca2+、Mg2+水平,未来对临床骨质疏松的治疗有重要意义。