Toll样受体在冠心病中的研究进展及靶向药物分析

张景，王可，来利红（河南科技大学临床医学院 河南科技大学第一附属医院 心内科，河南 洛阳 471003）

以冠心病（coronary heart disease，CHD）为代表的心血管疾病是全球人类死亡的常见原因[1]。研究发现免疫系统介导产生的炎性信号参与了CHD的发病[2]。病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）激活多种模式识别受体，其中Toll样受体（Tolllike receptors，TLRs）在冠状动脉粥样硬化的发生发展中发挥着重要的作用。研究表明平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞等多种细胞均可表达TLRs。TLR2和TLR4 表达于富含脂质和动脉粥样硬化斑块部位，参与动脉粥样硬化相关炎症反应[3]。TLR7和TLR9具有加速或减轻动脉粥样硬化的双向调节作用[4]。总之，在CHD的发生、进展、斑块的不稳定及破裂等各个时期，TLRs信号均发挥着重要作用，大量研究表明，抑制TLRs可以在一定程度上减少血管炎症和动脉粥样硬化斑块的形成进而减缓疾病的进展[4]。

1 Toll样受体简介

Toll样受体是Ⅰ型跨膜模式识别受体，通过识别PAMPs在固有免疫和适应性免疫中发挥关键作用[5]。截至目前，在人类和小鼠中共发现13种TLRs[6]，其中10种在人类中，12种在小鼠中[7]。根据TLRs的细胞定位和特异性配体将其分为两大类，其中一类在细胞表面表达并识别微生物的膜组分，例如脂质、脂蛋白等（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR11）；另一类在细胞内如内质网、溶酶体等囊泡的表面上表达，识别微生物核酸（TLR3、TLR7、TLR8和TLR9）[4]。TLRs主要由胞外区、跨膜区和胞内区三个功能区构成[8]。胞外区是与配体结合的特异部位，由十到二十余个存在较大差异的富含亮氨酸重复序列组成。跨膜区是富含半胱氨酸的结构域。胞内区由于其保守结构和人类白细胞介素1受体（interleukin-1 receptor，IL-1R）结构相似，故被称为 TIR结构域。该结构域是TLRs向下游转导信号的枢纽部位。依据募集到TLRs的不同配体，可将TLRs信号传导途径大致分为两类：髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖性通路和β干扰素TIR结构域衔接蛋白（Toll/interleukin-1 receptor domain containing adaptor inducing interferonβ，TRIF）依赖性通路[8]。当内源性或外源性配体被TLRs识别并结合后，程序性激活MyD88或TRIF及其下游蛋白，通过核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、干扰素调节因子（interferon regulatory factor，IRF）等信号通路释放肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、Ⅰ型干扰素（typeⅠinterferon，IFN-Ⅰ）等炎性因子，最终参与动脉粥样硬化等多种疾病的发生发展[2]（见图1）。

图1 TLRs信号在动脉粥样硬化中的调节机制Fig 1 Regulatory mechanism of TLRs signaling in atherosclerosis

2 TLRs与CHD

固有免疫系统在激活炎症级联反应导致组织损伤过程中起着关键作用。TLRs激活后介导炎症介质参与CHD的发生。TLRs识别PAMPs后，通过释放促炎细胞因子和诱导适当的免疫反应来保护心肌细胞免受病原体的侵害[9]。它们还可以通过损伤相关的分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）检测血管中的脂质沉积，并引发无菌炎症，对CHD起保护作用[10]。然而，TLRs的过度激活可能引起持续性炎症刺激进而打破免疫耐受。当TLRs识别到其相应配体时，DAMPs会介导细胞因子风暴加速心肌及血管受损。因此，TLRs在CHD中扮演着复杂的双重调节作用。

2.1 TLR2与CHD

既往研究发现TLR2激活与CHD有着密切的关联。Wen等[11]通过生物信息学技术发现TLR2与动脉粥样硬化的发生有关。TLR2在心肌细胞中高表达，并通过与MyD88结合激活NF-κB信号通路以调节基因转录和炎性细胞因子的产生从而介导心肌炎症、心肌纤维化、心肌细胞凋亡和心肌梗死等过程[12-13]。TLR2亦可通过激活中性粒细胞和自由基介导的内皮损伤而诱导缺血再灌注后冠状动脉内皮功能障碍[14]。此外，心肌梗死患者外周血单核细胞的TLR2表达和体外缺氧介导的单核细胞的TLR2表达和促炎细胞因子表达呈时间依赖性增加，这表明，急性心肌梗死患者的TLR2上调和循环单核细胞中促炎细胞因子表达增加与疾病的严重程度相关[15]。生物信息学技术亦发现TLR2的上调可能对急性心肌梗死具有较好的筛选价值[16]。相反，在缺乏TLR2的小鼠中观察到动脉粥样硬化进展受限、巨噬细胞募集减少和促炎细胞因子释放减少[17]。因此，TLR2介导的免疫反应在CHD的整个发病过程中发挥着重要的作用。

2.2 TLR4与CHD

TLR4是心脏组织中最常见的TLR，是心脏炎症和凋亡过程的关键介质[3]。研究表明，TLR4可能参与动脉粥样硬化形成及动脉粥样斑块向易损斑块的进展，贯穿于单核细胞活化、内皮细胞损伤、血管平滑肌细胞纤维化以及巨噬细胞和泡沫细胞形成的整个过程[18]。冠状动脉中TLR4激活后，亦可通过MyD88/NF-κB信号诱导多种炎症介质产生，并且可能通过协同作用促进TLR2信号的传导，加速冠状动脉斑块不稳定和破裂，最终导致冠状动脉闭塞[11]。研究发现，不稳定型心绞痛和急性心肌梗死患者循环单核细胞中TLR4表达升高[19]。类似地，与健康个体相比，急性心肌梗死患者的心肌和血浆中TLR4和促炎细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-10和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）的表达增加。此外，与Tlr-KO小鼠相比，WT小鼠心肌梗死后α平滑肌肌动蛋白上调，表明TLR4加剧了心脏重构并增强了梗死区域纤维化[20]。而抑制TLR4信号可以减少动脉粥样硬化病变过程中巨噬细胞的浸润，减少斑块[21]。TLR4缺陷小鼠模型由于左室重塑减少，心肌梗死后梗死面积显著减小，存活率提高[22]。研究发现，心肌梗死大鼠中的活性氧（reactive oxygen species，ROS）和NF-κB水平明显高于对照组；进一步的探索揭示心室旁核（paraventricular nucleus，PVN）内小胶质细胞的激活通过TLR4/NF-κB信号通路和ROS的产生参与心肌梗死后的交感兴奋；此外，抑制PVN中TLR4和NF-κB可减轻交感神经过度活跃和心肌梗死后的室性心律失常[23]。这一系列发现表明TLR4与CHD的发病有着密切关联。

2.3 TLR7与CHD

TLR7是一种定位于核内体或内质网的胞内受体，显著表达于病毒感染及自身免疫性疾病中，在冠状动脉疾病中亦可表达[24]。除免疫细胞外，TLR7还在内皮细胞、动脉粥样硬化斑块内的巨噬细胞和血小板中表达，这些细胞在血管和心脏事件中高度活跃[25]。研究表明巨噬细胞通过TLR7/MyD88信号途径诱导TNF-α、IL-6和IL-10等细胞因子的释放而发挥炎症作用[25-26]。TLR7亦可识别斑块形成过程中宿主细胞凋亡后释放的内源性ssRNAs，进而形成免疫风暴，加剧心肌细胞的损伤及动脉粥样硬化斑块形成[24]。更为严重的是，TLR7可导致心肌梗死后不良左心室重塑[27]。TLR7激活的血小板可加速中性粒细胞聚集，增加血栓形成的风险[28]。而另一方面，TLR7可能干扰TLR2和TLR4的炎症效应，减少单核细胞趋化蛋白-1的产生，并减少巨噬细胞在动脉粥样硬化病变中的聚集，抑或是通过降低血浆胆固醇来发挥其潜在的保护作用[28-29]。TLR7这种促进与抑制动脉粥样硬化的双向调节机制可能是由于其介导的抗炎细胞因子IL-10与促炎细胞因子的相互拮抗。

2.4 TLR9与CHD

除TLR2、TLR4和TLR7外，TLR9对血管炎症和动脉粥样硬化的发展亦有贡献。动脉粥样硬化病变过程中血管坏死释放未甲基化的寡核苷酸CpG基序，作为内源性配体被TLR9识别，从而激活巨噬细胞发挥固有免疫效应，促进IL-6、干扰素（INF）-α等炎症因子的产生，加快泡沫细胞的聚集以及动脉粥样硬化斑块的形成，亦可增加CD4＋T细胞对血管平滑肌细胞的细胞毒活性[30]。类似地，浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）通过TLR9信号活化，产生IFN-Ⅰ等促炎因子加剧血管病变。一项小鼠研究显示，与远端或非梗死区相比，心肌梗死区Tlr9基因表达增加[31]。TLR9的刺激会损害急性血管损伤后的再内皮化，不改变内皮依赖性血管舒张，同时增加Apoe-/-小鼠的斑块形成。但也有一些研究者认为，TLR9除了加速动脉粥样硬化斑块的形成，还对动脉粥样硬化具有潜在的保护作用。TLR9通过调节能量代谢和血管生成改善心肌梗死后的心脏功能[32]。此外，研究者发现某些药物（如养心舒脉颗粒）可以通过TLR9/MyD88/NF-κB信号通路调节巨噬细胞极化，减轻动脉粥样硬化[33]。TLR9在动脉粥样硬化中的双向调节作用体现出TLR9的独特机制。

3 靶向TLRs药物治疗CHD

TLRs靶向治疗最初的临床应用主要集中在肿瘤和感染，但越来越多的证据表明，TLRs在动脉粥样硬化中发挥重要作用，选择性靶向TLRs可能成为一个有前景的CHD治疗策略。

3.1 TLR2调节剂

阻断TLR2途径被认为可以抑制动脉粥样硬化过程中细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白质产生。抗TLR2单克隆抗体可通过减少NF-κB介导的炎症细胞因子、白细胞内流和促凋亡信号通路，减少梗死面积并改善心功能[34]。T2.5是具有治疗潜力的抗TLR2抗体之一，其通过抑制心脏中的巨噬细胞募集和炎症来预防血管紧张素Ⅱ诱导的心脏纤维化[8]。同样作为TLR2抗体的Opn301，可以阻断TLR2诱导的细胞因子信号传导，改善心脏功能并减少缺血再灌注损伤小鼠的梗死面积[6]。丹参素通过抑制巨噬细胞TLR2/NFκB 信号通路发挥显著的抗炎作用，这一现象支持了其在治疗动脉粥样硬化和心脏的缺血再灌注损伤中的疗效[35]。人参皂苷Rh1通过阻断脂多糖与TLR2和TLR4的结合来抑制脂多糖诱导的内皮细胞炎症和细胞凋亡[36]。此外，黄芪甲苷可以上调miR-101a表达，从而抑制TLR2的表达，具有潜在的抗炎活性和治疗心血管疾病的作用[37]。

3.2 TLR4调节剂

一些心血管药物可以通过减弱TLR4信号来发挥多效抗炎和抗动脉粥样硬化作用。例如他汀类药物可以抑制TLR4/MyD88信号传导并引起免疫应答转变为抗炎应答来降低氧化应激，也可通过降低TLR2和TLR4的表达抑制NF-κB途径来介导动脉粥样硬化斑块的稳定[6]。阿托伐他汀可显著降低TLR4和NF-κB的表达水平，同时下调TNF-α水平，并且可以抑制C-反应蛋白诱导的TLR4过表达和人CD14单核细胞促炎细胞因子的大量释放。噻唑烷二酮类药物的抗动脉粥样硬化作用也可能是通过抑制TLR4信号通路而实现的[17]。此外，柯里拉京（一种水溶性鞣质）通过抑制TLR4-NF-κB/MAPK信号通路的激活来对抗M1型巨噬细胞极化和炎症，从而发挥抗动脉粥样硬化作用[38]。益生元菊粉已被证明可以降低脂多糖管腔浓度并减轻Apoe-/-小鼠的动脉粥样硬化[6]。大黄通过调节血脂及抑制TLR4和炎症因子的表达，也显示出抗动脉粥样硬化和斑块稳定特性。尽管这些药物尚未应用于CHD的治疗，但它们可能通过靶向TLR4信号传导来预防动脉粥样硬化的形成。

3.3 TLR7调节剂

TLR7在动脉粥样硬化过程中调节免疫应答，平衡促炎-抗炎细胞因子的分泌。研究发现，TLR7拮抗剂通过干扰其配体来阻断TLR7信号传导，从而减少新生内膜、管腔狭窄和泡沫细胞的形成，同时减少了动脉壁巨噬细胞浸润[26]。卡那单抗通过选择性抑制TLR7下游的IL-1β水平进而改善心血管结局，并且具有降低血脂的作用[24]。脑心通显著抑制脑缺血时大脑皮层和心脏中TLR7的表达，可能在一定程度上减少动脉粥样硬化的发生[39]。黄连解毒汤可通过调节TLR7/MyD88/NF-κB通路抑制氧化低密度脂蛋白干预的RAW264.7源性泡沫细胞炎症反应，这可能是黄连解毒汤抗动脉粥样硬化的分子机制之一[40]。加味补阳还五汤抑制TLR7及其下游信号转导改善主动脉细胞的炎性浸润程度和斑块管腔占比[41]。这些研究表明TLR7及下游通路的阻断可能是一种有效的CHD治疗方法。有研究用TLR7配体咪喹莫特刺激小鼠后，观察到IL-10和TNF-α的分泌浓度与咪喹莫特剂量成正相关。考虑到IL-10和TNF-α分别为典型的抗炎和促炎因子，因此，该研究表明TLR7的活化能够双向调节动脉粥样硬化的发生发展[24]。目前TLR7激动剂及拮抗剂在CHD中可能带来的影响仍不清楚，因此未来需要开展更多的研究，以更好地了解其治疗效果。

3.4 TLR9调节剂

研究发现，通过干预TLR9配体来调控免疫反应，进而控制动脉粥样硬化的发展，可作为心脏缺血或其他损伤后组织修复的治疗措施。E6446是一种具有口服生物活性的TLR9抑制剂，小鼠实验表明其可通过阻断TLR9与配体的结合，从而预防左心室扩张、心功能不全及纤维化的发生或延缓其进展[42]。羟氯喹可以通过阻断TLR9与其配体的结合，进而抑制IFN-Ⅰ的产生来减轻心肌梗死程度[43]。解毒祛瘀滋阴方可通过促进胆固醇外排，抑制TLR9/MyD88激活，缓解系统性红斑狼疮合并动脉粥样硬化的症状[44]。养心舒脉颗粒通过TLR9/MyD88/NF-κB信号通路调节巨噬细胞极化，减轻动脉粥样硬化程度[33]。Wang等[45]报道了抗菌肽CRAMP通过激活心肌细胞中TLR9/AMPKα途径改善心肌梗死中的心功能障碍。考虑到TLR9有促动脉粥样硬化和抗动脉粥样硬化的双向调节作用，需要更好地了解TLR9激动剂和抑制剂的治疗效果，以实现把TLR9作为治疗靶点的CHD治疗策略。

截至目前，一些靶向TLRs治疗CHD的潜在药物已被发现，其疗效及安全性亦被探索，汇总见表1。

表1 TLR调节剂在冠心病临床开发中的潜在作用Tab 1 Potential role of TLR modulators in clinical development of CHD

4 总结展望

TLRs激活引发的促炎活性可能是促进动脉粥样硬化病变发展的关键因素。因此该信号通路可能作为CHD潜在的治疗靶点。然而，靶向TLRs的调节治疗是否可以改变CHD的进展尚未可知。总之，TLRs信号是一把双刃剑，作为生理和病理介质发挥双重作用，因此在开发相关药物时，必须掌握这一通路的信号强度。此外，最佳干预时机的确定亦极其重要。值得注意的是，人体内有许多信号通路，存在相互串扰的现象，并且人和小鼠之间的物种差异可能会加大转化医学的难度。因此，基于免疫的心血管治疗仍存在许多不确定性。目前对TLRs的研究还很有限，需要对TLRs信号及其交叉通路进行更深入地研究。