中药活性肽发现方法研究进展

王鸿杰，王锐，高雯（中国药科大学 中药学院，南京 211198）

如何从中药复杂体系中分离并发现活性先导化合物一直是中药研究的一大挑战。目前，植物源中药小分子研究较为广泛，且具有较为成熟的活性成分分离和筛选方法，如亲和超滤法、生物色谱法、二维涡流色谱法、虚拟筛选法等[1]。然而除小分子外，植物源中药特别是种子类还含有各种活性肽/蛋白，如核桃仁中发现了含有血管紧张素转换酶抑制作用、酪氨酸酶抑制作用以及二肽基肽酶Ⅳ抑制作用的多种活性肽[2-4]，枸杞中含有抗肿瘤活性的枸杞环肽[5]，太子参中含有减轻慢性阻塞性肺疾病的作用的太子参环肽[6]等。同时，动物源中药如水蛭、鳖甲、地龙、鹿茸等含有的多肽和蛋白质被认为是其发挥疗效的物质基础[7]。如水蛭为破血消癥药，从中发现的水蛭素是迄今为止最强的天然凝血酶抑制剂[8]；鳖甲为补阴药，从中发现了具有保肝活性的鳖甲七肽[9]；阿胶为补血药，从中分离出具有刺激造血功能的十一肽[10]。菌类中药如冬虫夏草活性肽，具有提高免疫[11]、抗氧化、抗炎[12]等药理作用，灵芝活性肽具有抗氧化[13]、降压[14]、抗肿瘤[15]等药理作用。因此开发活性肽的发现及筛选方法也十分必要。

活性肽是通过酶解、发酵等方式从前体蛋白质水解产生的生物功能超越其营养价值的氨基酸序列片段，其长度通常为2～20个氨基酸残基，分子量通常小于6 kDa。它们以非活性形式存在于前体蛋白中，水解释放后具有抗菌、抗氧化、降压和免疫调节等广泛生物学活性，并且具有毒性低、易代谢、无耐药性的特点[16]，用药前景良好。本文对中药活性肽纯化鉴定的流程以及活性肽筛选新方法进行综述（见图1），以期为中药活性肽的发现提供理论参考。

图1 活性肽发现流程图Fig 1 Flowchart of active peptide discovery

1 基于活性导向的多肽分离鉴定法

中药来源的活性肽包括天然提取活性肽和水解活性肽。天然提取活性肽即天然存在于中药中的多肽；水解活性肽即蛋白质被水解/酶解/发酵后暴露的具有活性的多肽片段[17]。对于水解活性肽，其制备往往需要将提取到的蛋白质水解成肽段后，再开展分离纯化。由于多肽分子量远小于蛋白质，其分离材料的选择与分离蛋白略有不同，如超滤膜孔径（通常＜10 kDa）、凝胶（通常选择分子量分离范围1000～5000 Da）等。

1.1 多肽的制备

直接提取法可获得中药中的天然提取活性肽。此外，许多活性肽来自蛋白质的结构片段，因此第一步往往需要水解蛋白质暴露活性肽。目前，从蛋白质获得多肽的常用方法有酶解法、化学水解法、微生物发酵法等，其中，酶解法应用最为广泛。

1.1.1 酶解法 酶解法即采用一种或多种蛋白水解酶将蛋白质水解为小片段肽，具有条件温和、结果可控的优点[18]。常见的蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等。酶对底物具有特异性，不同酶对蛋白质的酶切位点不一样[19]，因此不同的酶酶解后获得的多肽分子量、活性可能会有所不同。例如，核桃的胃蛋白酶水解产物具有血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制作用，碱性蛋白酶水解产物具有酪氨酸酶抑制作用[2，4]。此外，也可以采用多种酶组合进行酶切，这种方法有助于提高蛋白质水解度[20]，可以获得更多、更短的多肽片段，有可能提高水解产物活性[21]。值得注意的是，不同的实验条件对酶解效果有较大的影响，因此需要优化水解温度、pH、酶底比、时间等条件，根据水解度、生物活性等指标确定最佳酶解条件[22]。

1.1.2 化学水解法 化学水解法即酸碱水解法，通过强酸或强碱催化水解蛋白质肽键制备多肽，其水解位点没有特异性、反应可控性不强，条件极端，易致氨基酸变性，如酸水解会导致色氨酸完全破坏，碱水解会导致大部分氨基酸完全损失[23]。同时化学水解法由于存在安全性、对环境不友好等问题，在活性肽研究过程中运用较少。

1.1.3 微生物发酵法 微生物发酵法是将微生物直接接种于蛋白质中，通过微生物发酵产生的蛋白酶或肽酶将蛋白质水解成多肽或游离氨基酸[24]。发酵法利用微生物的生长特性，将酶的生产和酶的水解过程合二为一，节省了酶的分离和纯化步骤，缩短了生产过程，降低了生产成本[22]。不同微生物具有不同的蛋白质水解系统，不同培养物的蛋白质水解产物也不同。Jakubczyk等[25]发现大豆蛋白经植物乳杆菌发酵后，随着发酵进行，肽含量逐渐增加，发酵后分子量为3.5～7 kDa的部分具有α-淀粉酶抑制活性，IC50值为（1.94±0.16）mg·mL-1。

1.2 活性肽的纯化

活性肽的纯度对活性肽的理化性质、生物活性和结构鉴定等研究至关重要。因此，对活性肽进行分离纯化是不可缺少的一步[20]。

1.2.1 膜分离技术 膜分离技术是利用膜两侧的压力差截留和分离不同质量的分子，一般作为多肽纯化的第一个步骤[26]。根据膜孔径大小分为微滤、超滤、纳滤和反渗透四类，其中超滤因其快速、简便而被广泛应用于多肽的纯化[23]。选用合适的超滤膜可富集一定分子量范围的多肽。Luo等[27]应用超滤法初步分离了苦荞的蛋白水解液，基于实验发现分子量＜3 kDa的馏分清除自由基活性高于3～10 kDa和＞10 kDa的馏分。Xia等[28]对绿豆蛋白酶解液进行超滤分离，同样发现低分子量部分（＜3 kDa）具有较强的抗氧化活性，这说明酶解可有效地暴露蛋白质中具有活性的多肽片段，且活性肽存在于低分子量部分。然而，仅采用超滤技术不能分离分子量相近的多肽，实际研究中常与其他分离纯化技术相结合[26]。

1.2.2 电泳技术 不同的多肽具有不同的电荷水平，在电场中向电荷极性相反的方向移动的速度不同，从而实现分离[22]。一般来讲，电泳技术由于其上样量太少而较少用于多肽的纯化制备[17]，多用于多肽分子量范围表征或色谱、质谱分析样品的制备。如Kong等[3]用Tricine-SDS-PAGE对核桃蛋白及其水解产物进行了表征，发现随着水解程度的增加，高分子量条带的强度逐渐降低，低分子量条带的强度逐渐增大。

1.2.3 色谱技术 色谱技术是分离纯化活性肽的有效手段，其中凝胶过滤色谱、离子交换色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）等均较为常用。

① 凝胶过滤色谱（尺寸排阻色谱）：凝胶过滤色谱利用分子筛效应按分子量从大到小分离多肽，该方法一般以水为洗脱剂，条件温和，可有效保护多肽的生物活性。如Zhao等[29]采用凝胶过滤分离纯化鹿茸多肽，共分离得到4个具有抗炎活性的组分。Yang等[30]采用凝胶过滤从紫苏子蛋白水解物中发现了具有抗氧化活性的组分。

② 离子交换色谱：多肽作为两性电解质，可以采用离子交换色谱法进行分离[31]。离子交换色谱分离具有较高的分辨率，但洗脱液会引入杂质离子，故其常与凝胶过滤色谱联用以除去引入的无机盐。另外，离子交换色谱不适合分离对pH、金属离子敏感的生物分子[17]。Kong等[3]采用SP Sephadex C-25葡聚糖凝胶柱分离核桃中＜5 kDa的水解多肽，获得具有二肽基肽酶-Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制活性的组分。Zhang等[32]将牡丹籽超滤液用DEAE-52阴离子交换柱（3.0 cm×40 cm）纯化获得两个组分（F1和F2），其中F2具有更强的抗氧化活性。

③ RP-HPLC：具有分离效率高、分离能力强、保留机制清晰、馏分活性显著等特点，尤其适用于分离纯化＜5 kDa分子量的极性多肽[22]，常作为多肽分离纯化的最后一步。研究者[33]对酸枣水解产物进行3 kDa超滤后，进行RP-HPLC分离，共分离得到7个组分F1～F7，其中F2和F4组分具有最强的ACE抑制活性，IC50分别为0.144 mmol·L-1和0.228 mmol·L-1，经质谱鉴定两者氨基酸序列分别为IER和IGK。

值得注意的是，上述几种多肽分离纯化技术各有优缺点，单一的分离纯化技术并不能完全满足多肽高效分离纯化的要求。故多肽分离纯化的实际研究中，常常综合考虑多肽的多种性质，采用分离组合技术进行分离纯化，以达到更好的分离纯化效果[26]。

1.3 活性肽的鉴定

为了明确活性肽的结构组成，阐明其构效关系及作用机制，以便开发出合理的活性肽产品，需要进一步鉴定多肽的结构[26]。

1.3.1 活性肽一级结构鉴定 多肽一级结构鉴定方法包括N端测序法、质谱鉴定法等。N端测序法是获得纯度较高的多肽后采用Edman降解进行测序，较为耗时、灵敏度较低且可鉴定的氨基酸残基数目有限[31]。如Wang等[2]采用N端测序法从核桃水解物中鉴定出两条ACE抑制肽（VERGRRITSV和FVIEPNITPA）。随着质谱软电离技术及二级碎裂技术的发展，N端测序法逐渐被质谱法取代，如电喷雾电离质谱、基质辅助激光解吸质谱等。液质联用（LC-MS）技术可识别混合物中的多肽，大大减少样品制备的工作量[34]，同时，生物信息学工具为多肽进行更快、更准确的鉴定提供了可能[35]。此外，基于质谱的从头测序（De novo）法在多肽的结构鉴定中显示出显著优势，该技术可以在不需要蛋白数据库的情况下完成未知多肽的测序[36]。例如Memarpoor-Yazdi等[37]借助PEAKS Studio软件完成了酸枣果实中两条抗氧化肽VGQHTR、GWLK的从头测序。此外，核磁法也可用于多肽一级测序，尤其适用于测定氨基酸数量少于30个的肽[38]，如Tian等[39]通过核磁分析从金铁锁中成功鉴定了3种新的抗真菌环肽Tunicyclins B～Tunicyclins D。

1.3.2 活性肽二级结构鉴定 活性肽二级结构与其功能密切相关[40]，因此评估活性肽二级结构具有重要的意义。多肽中有序的α螺旋、β折叠、β转角和无规卷曲构象都具有特征光谱，这些独特的光谱构成了二级结构分析的基础[40]。目前常用傅里叶变换红外技术[41]、磁共振波谱以及圆二色性[40]分析多肽的二级结构，如Zhang等[42]使用傅里叶变换红外技术分析脱脂花生粉（DPF）与脱脂花生水解物（DPH）中多肽的二级结构，发现两者主要的二级结构为β型构象，DPF水解为DPH后，α-螺旋由20.93%减少到16.24%，β-折叠由43.54%增加到52.02%。

表1总结了近年来国内外分离鉴定的活性肽及其研究方法。

表1 中药活性肽研究进展Tab 1 Research progress in active peptides of traditional Chinese medicine

2 活性肽筛选新方法

基于分离纯化方法发现活性肽的流程步骤复杂，耗时较长，价格昂贵，制约了中药活性肽的发现效率，因此亟须开发活性肽筛选的新方法。

2.1 亲和筛选及在线鉴定

亲和筛选是目前常用的中药活性成分筛选技术[1]，其根据成分与生物靶标（酶、细胞等）或化学分子特异性结合的特点，从中药复杂成分中“垂钓”潜在活性成分，并结合LC-MS等高灵敏分析技术，实现筛选和鉴定。如Wang等[56]应用细胞亲和技术，从中华蟾蜍毒液中筛选并鉴定了76种肿瘤细胞结合肽。

亲和超滤质谱联用技术，是将亲和筛选与膜分离技术相结合，分离出多肽-靶蛋白复合物，解离后再进行鉴定。如Ma等[57]应用生物亲和超滤结合LC-Orbitrap-MS/MS技术，筛选并鉴定了纹鳢的7个新型ACE抑制肽，其中EYFR和LPGPGP具有较好的活性。Hu等[58]通过引入变性酶组作为对照以减少假阳性，从草鱼鳞明胶水解物中筛选并鉴定了4个新型酪氨酸酶抑制肽，其中DLGFLARGF活性最强，IC50为3.09 mmol·L-1。

固定化亲和筛选是将活性靶标（酶或金属离子等）固定在载体基质上，将混合物中具有潜在活性的组分进行“固定”以与非活性组分分离的方法。如利用过渡金属离子和一些蛋白质/多肽之间会特异性配位形成螯合物的原理开展亲和层析（固定化金属亲和色谱IMAC）筛选，也可首先将靶标固定在磁性微球（Fe3O4等）表面，通过磁固相萃取开展亲和筛选。Lan等[59]利用固定了ACE的琼脂糖磁性微球，从蛇鲻蛋白水解物中有效纯化了ACE抑制肽，对ACE抑制的活性由（26.8±1.78）%提高到（83.6±1.35）%，并通过RP-HPLC分离得到IC50＝（47.3±1.4）μmol·L-1的GMKACF。Thewissen等[60]使用Ni2＋-IMAC纯化经胰蛋白酶和嗜热菌蛋白酶连续水解得到的醇溶蛋白，纯化后的组分对ACE抑制活性明显提高，其IC50为0.02 mg·mL-1。Sun等[61]采用IMAC-Ni2＋色谱柱纯化蛇鲻肌肉蛋白酶解物，成功分离出ACE抑制肽RYRP。为了克服IMAC表面的金属离子对蛋白/多肽等发生的非特异性吸附导致假阳性问题，Liu等[62-63]将聚乙二醇甲基醚（mPEG）修饰在以磁性微球（Fe3O4）为核心的IMAC上，以减少非特异性吸附，从酪蛋白水解物及珍珠贝肉蛋白水解物中筛选出ACE抑制肽，并结合RP-HPLC从富集馏分中分离出了3条新型ACE抑制肽（LLYQEPVLGPVR，HLHT和GWA）。

金属有机框架（MOF）是一种以金属离子或金属离子簇与有机配体通过自组装形成的高度有序晶体多孔材料[64]，是酶固定化的优良载体。Feng等[65]将ACE固定在Fe3O4@ZIF-90上，固定后的ACE比游离ACE有更好的温度、pH耐受性及稳定性，并成功从裙带菜中筛选出一种新型降压肽KNFL（IC50＝225.87 μmol·L-1）。此外，多肽的金属螯合活性往往和抗氧化活性有相似性，Chen等[66]应用MIL-53（Cr）结合LC-MS技术，从米渣蛋白水解物中“垂钓”出抗氧化肽GDNMP和LLLRW，两者清除DPPH自由基活性的IC50分别为（0.120±0.007）mg·mL-1和（0.131±0.008）mg·mL-1。

2.2 基于计算机辅助的虚拟筛选

随着生物信息学的发展，基于计算机辅助的活性肽虚拟筛选也被广泛应用。一是基于已知的蛋白氨基酸序列，通过酶切工具进行理论酶切，使用计算机预测工具和生物活性肽数据库筛选出高活性、低毒性的未知活性肽，并与相关靶标进行分子对接，最后选取得分高的多肽进行后续活性实验验证[67]。如石嘉怿等[68]对稻米半胱氨酸蛋白酶抑制剂进行虚拟酶解及虚拟筛选，发现了潜在的生物活性肽TDW和AGR，分子对接显示两者具有ACE和DPP-Ⅳ抑制活性。此外，也可以首先基于肽组学完成水解肽的全面表征，再使用计算机预测工具和分子对接进行虚拟筛选，最后通过活性实验完成验证。如Zhang等[69]运用肽组学对豌豆酶解产物成功表征543个肽段后，通过DPP-Ⅳ抑制肽特征结构初筛与分子对接虚拟筛选，从中筛选出8条肽段，其中的7条肽段被证明具有较强的DPP-Ⅳ抑制活性。Yu等[70]表征阿胶水解物中519条活性肽后，通过水溶性预测、毒性预测、分子对接以及分子动力学模拟筛选出2条潜在的免疫调节肽（VQLSGEEK和GFSGLDGAKG），并通过体外细胞实验验证了其具有免疫增强活性和抗炎活性。相较于其他筛选方法，虚拟筛选省去了大量的实验步骤，但是需要根据已知结构的蛋白/多肽开展，同时在虚拟筛选中，由于参数设置的多样化，筛选出的活性肽也会有多重结果，需要结合实验验证或进一步发展人工智能预测模型等。

3 结论与展望

本文总结了中药活性肽发现及筛选方法，基于分离-纯化-测试的活性肽发现流程效率较低，因此开发和建立高效的筛选新方法对于活性肽的研究具有重要意义。目前活性肽的快速筛选方法主要包括亲和活性筛选以及虚拟筛选，有效提高了中药活性肽的发现效率。近年来，已有学者提出“活性中药肽的智慧预测与创制”方法，以基因组大数据为基础，结合人工智能、计算机虚拟筛选、转录组学等现代技术高通量筛选中药活性肽[71]。此外，多肽在体内是否能有效发挥活性也值得关注，例如口服给药由于胃肠道消化、结构功能屏障等致生物利用度差；皮肤给药需要克服皮肤生理屏障[72]等。因此，除了开发活性肽筛选新策略提高活性肽发现效率，研究多肽药物的体内过程及给药方案，确保有效性也十分必要。