川枳壳黄酮类成分及其对成骨细胞增殖作用的研究

向丹，李玉玫，王靖雯，徐伟，何洁月，杨云芝*（.南充市中医医院骨伤科，四川 南充 67000；2.筋骨病中医药防治南充市重点实验室，四川 南充 67000；.南充市食品药品检验所，四川 南充 67000；4.南充市中医医院中药制剂中心，四川 南充 67000）

中药枳壳为芸香科（Rutaceae）柑橘属（Citrus）植物酸橙（CitrusaurantiumL.）及其栽培变种臭橙、香橙、枳橙的干燥未成熟果实，产地主要分布于江西、四川、湖南等地，按照产地的不同分别称为江枳壳、川枳壳和湘枳壳，其中江枳壳为道地药材，川枳壳为主流品种[1-2]。枳壳中化学成分类型主要包括黄酮类、挥发油类、生物碱类、苯丙素类等，其中黄酮类成分是枳壳的主要活性成分，也作为枳壳质量标准的重要标志物，其总含量可达15.44%[3-4]。目前已从中药枳壳中分离得到62个黄酮类成分，但多篇文献显示不同产地枳壳在黄酮类成分种类与含量上差异显著[5]。

骨损伤或骨折是骨伤科最常见的疾病，损伤初期有明显的肿痛表现，中医认为此肿痛病机为气滞血瘀，常用枳壳行行气散瘀止痛之功效。本研究团队前期对我院筋骨病常用中药进行抗骨质疏松活性筛选时发现川枳壳乙醇提取物对成骨细胞具有增殖作用。中药枳壳药理作用众多，包括抗肿瘤、抗炎、抗抑郁、降血脂、胃肠功能调节、免疫调节等[6-7]，但未见关于抗骨质疏松方面的研究。故本研究通过大孔树脂、聚酰胺树脂富集川枳壳煎煮液中的黄酮类成分，并采用小孔树脂、硅胶柱色谱等分离手段对川枳壳黄酮类成分进行系统分离，共分离鉴定出12个黄酮类化合物，分别为柚皮苷（1）、新橙皮苷（2）、柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷（3）、narirutin（4）、sarotanoside（5）、圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷（6）、柚皮素（7）、芫花素（8）、圣草酚（9）、angophorol（10）、南酸枣苷（11）、tetrahydroprotogenkwanone（12）（结构见图1），通过体外细胞实验对12个黄酮类成分进行活性筛选，确定各化合物对成骨细胞增殖的影响。

1 材料

1.1 仪器

Bruker Avance III-400 核磁共振仪、Bruker Daltonics MS质谱仪（德国布鲁克公司）；Multiskan FC酶标仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；二氧化碳培养箱（无锡沃信仪器有限）；CKX31倒置相差显微镜[奥林巴斯（中国）有限公司]；FA2004分析天平（上海力辰科技仪器有限公司）；TD5A医用离心机（常州市金坛高科仪器厂）；G-100S型超声波清洗器（深圳市哥能清洗设备有限公司）；ZF-2型三用紫外仪（上海市安亭电子仪器厂）；RE-1102型旋转蒸发仪（上海嘉鹏科技有限公司）；SYG-4型数显恒温水浴锅（常州朗越仪器厂）；LCK2000煎药机（天津三延精密机械有限公司）；LDZX-30KBS 压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）。

1.2 试药

硅胶（100～200目）和硅胶GF254薄层板（青岛海洋化工厂）；AB-8大孔树脂（河北沧州宝恩化工有限公司）；葡聚糖凝胶LH-20（湖南汇百侍生物科技有限公司）；MCI CHP-20（75～150 μm）（日本三菱公司）；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇等均为分析纯；CCK-8细胞增殖测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

川枳壳（成都吉安康药业有限公司，批号：210209-11，采自四川省南充市营山县清水乡银鸽村）经南充市中医医院张德明中药师鉴定为芸香科柑橘属植物酸橙CitrusaurantiumL.的干燥未成熟果实。

1.3 细胞

小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14又称MC3T3-E1（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）。

2 提取分离

川枳壳中药饮片5 kg，制成粗粉后用8倍量水煎煮2次，每次2 h，减压浓缩至浸膏（1782.6 g），浸膏用适量水分散，加至含AB-8大孔树脂的水溶液中，吸附过夜，装柱，分别用4倍柱体积的20%、75%、95%乙醇水洗脱；75%乙醇水洗脱部位浓缩成浸膏，水分散，加入适量聚酰胺树脂吸附2 h，装柱，分别用4倍柱体积的35%、70%、95%乙醇水洗脱，收集70%乙醇水洗脱液，减压浓缩至浸膏（801.4 g）。

70%乙醇水洗脱部位用硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-乙醇为溶剂系统进行梯度洗脱（1∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、0∶1），以薄层色谱为检测方式，紫外254 nm显色或10%硫酸乙醇烤板显色，对相似流份进行合并，得8个组分Fr.A～Fr.H。组分Fr.F溶液析出淡黄色颗粒物，经丙酮反复洗涤得化合物1（646.8 mg），经MCI柱色谱30%甲醇水洗脱得化合物2（358.5 mg）；Fr.E经MCI柱色谱32%甲醇水洗脱、硅胶柱色谱得化合物3（185.6 mg）、化合物4（62.1 mg）、化合物5（35.8 mg）；Fr.D经MCI柱色谱39%甲醇水洗脱、硅胶柱色谱二氯甲烷-甲醇30∶1洗脱、葡聚糖凝胶LH-20甲醇-水（1∶1）过筛得化合物6（91.8 mg）、化合物11（29.5 mg）；Fr.C经硅胶柱色谱二氯甲烷-甲醇（30∶1）得Fr.C1～Fr.C5，Fr.C1经硅胶柱色谱二氯甲烷-甲醇（60∶1）洗脱得化合物7（185.2 mg）、化合物10（68.3 mg），Fr.C3经葡聚糖凝胶LH-20色谱柱，二氯甲烷-甲醇（1∶1）过筛得化合物8（64.3 mg），Fr.C4在石油醚-乙酸乙酯（3∶1）中重结晶得化合物9（59.6 mg），经反复葡聚糖凝胶LH-20二氯甲烷-甲醇（1∶1）过筛得化合物12（16.2 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：淡黄色粉末（甲醇）；C27H32O14；ESI-MSm/z：581.2 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：12.06（1H，s，5-OH），7.21（2H，d，J＝8.7 Hz，H-2'，6'），6.72（2H，d，J＝8.7 Hz，H-3'，5'），6.15（2H，m，H-6，8），5.62（1H，dd，J＝13.2，2.8 Hz，H-2），4.82（1H，d，J＝4.9 Hz，H-1''），4.67（1H，d，J＝5.3 Hz，H-1'''），3.15～3.70（10 H，m，H-2''～6''，H-2'''～5'''），3.28（1H，m，H-3β），2.76（1H，dd，J＝16.2，2.8 Hz，H-3α），1.14（3H，d，J＝6.2 Hz，H-6'''）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：79.4（C-2），42.5（C-3），198.7（C-4），163.5（C-5），97.6（C-6），165.8（C-7），96.4（C-8），161.1（C-9），104.2（C-10），129.1（C-1'），128.1（C-2'，6'），118.1（C-3'，5'），158.3（C-4'），101.4（C-1''），73.2（C-2''），77.8（C-3''），70.5（C-4''），76.6（C-5''），65.7（C-6''），100.4（C-1'''），70.2（C-2'''），71.8（C-3'''），72.5（C-4'''），67.6（C-5'''），18.3（C-6'''）。以上数据与文献报道[8]的柚皮苷数据一致，故确定化合物1为柚皮苷。

化合物2：白色粉末（甲醇）；C28H34O15；ESI-MSm/z：611.2 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，C5D5N）δH：12.02（1H，s，5-OH），9.53（1H，s，3'-OH），7.06（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5'），6.98（1H，d，J＝2.8 Hz，H-2'），6.88（1H，dd，J＝8.4，2.8 Hz，H-6'），6.13（1H，d，J＝1.2 Hz，H-8），6.11（1H，d，J＝1.2 Hz，H-6），5.62（1H，dd，J＝12.4，1.8 Hz，H-2），5.25（1H，d，J＝5.3 Hz，H-1''），4.76（1H，d，J＝5.4 Hz，H-1'''），3.85（3H，s，4'-OCH3），3.22（1H，m，H-3β），2.62（1H，dd，J＝17.1，1.8 Hz，H-3α），1.15（3H，d，J＝6.5 Hz，H-6'''）；13C-NMR（100 MHz，C5D5N）δC：78.4（C-2），41.9（C-3），197.8（C-4），163.2（C-5），97.1（C-6），164.9（C-7），96.1（C-8），162.3（C-9），103.6（C-10），131.1（C-1'），115.1（C-2'），147.1（C-3'），148.2（C-4'），113.0（C-5'），117.6（C-6'），100.8（C-1''），73.3（C-2''），76.9（C-3''），70.2（C-4''），75.7（C-5''），66.2（C-6''），100.1（C-1'''），70.8（C-2'''），71.3（C-3'''），72.6（C-4'''），68.1（C-5'''），18.5（C-6'''），56.8（4'-OCH3）。以上数据与文献报道的新橙皮苷[9]数据一致，故确定化合物2为新橙皮苷。

化合物3：淡黄色针晶（甲醇）；C21H22O10；ESI-MSm/z：435.1 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：12.09（1H，s，5-OH），7.32（2H，d，J＝8.4 Hz，H-2'，6'），6.94（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3'，5'），6.23（2H，m，H-6，8），5.54（1H，dd，J＝12.7，2.8 Hz，H-2），4.84（1H，d，J＝7.5 Hz，H-1''），3.25（1H，m，H-3β），2.78（1H，m，H-3α）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：79.1（C-2），42.1（C-3），197.2（C-4），163.6（C-5），96.8（C-6），166.5（C-7），95.5（C-8），162.3（C-9），103.6（C-10），131.6（C-1'），128.1（C-2'，6'），117.4（C-3'，5'），157.9（C-4'），102.8（C-1''），73.4（C-2''），77.6（C-3''），69.8（C-4''），76.4（C-5''），61.6（C-6''）。以上数据与文献报道[10-11]的柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷数据一致，故确定化合物3为柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物4：淡黄色粉末；C27H32O14；ESIMSm/z：581.2 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：12.03（1H，s，5-OH），7.25（2H，d，J＝8.4 Hz，H-2'，6'），6.68（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3'，5'），6.12（2H，m，H-6，8），5.59（1H，dd，J＝12.9，2.6 Hz，H-2），4.76（1H，d，J＝4.8 Hz，H-1''），4.58（1H，d，J＝5.6 Hz，H-1'''），3.26（1H，m，H-3β），2.68（1H，dd，J＝16.8，2.6 Hz，H-3α），1.16（3H，d，J＝6.5 Hz，H-6'''）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：78.3（C-2），42.1（C-3），196.7（C-4），162.9（C-5），96.4（C-6），164.5（C-7），95.1（C-8），162.3（C-9），103.5（C-10），129.1（C-1'），128.4（C-2'，6'），116.6（C-3'，5'），156.9（C-4'），99.8（C-1''），76.4（C-2''），77.3（C-3''），69.8（C-4''），77.2（C-5''），60.5（C-6''），98.4（C-1'''），70.3（C-2'''），70.6（C-3'''），71.9（C-4'''），68.6（C-5'''），17.8（C-6'''）。以上数据与文献报道[8，12]的narirutin数据一致，故确定化合物4为narirutin。

化合物5：淡黄色粉末；C27H32O13；ESI-MSm/z：565.2 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：12.25（1H，s，5-OH），7.5～7.8（5H，m，H-2'～H5'），6.62（1H，d，J＝1.8 Hz，H-8），6.45（1H，d，J＝1.8 Hz，H-6），5.74（1H，dd，J＝12.3，2.9 Hz，H-2），5.26（1H，d，J＝5.2 Hz，H-1''），5.18（1H，d，J＝5.4 Hz，H-1'''），3.54（1H，m，H-3β），2.75（1H，m，H-3α），1.28（3H，d，J＝6.8 Hz，H-6'''）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：77.3（C-2），42.9（C-3），196.8（C-4），162.6（C-5），96.8（C-6），164.8（C-7），95.7（C-8），162.8（C-9），103.9（C-10），139.4（C-1'），126.1（C-2'，6'），128.1（C-3'，5'），126.7（C-4'），98.4（C-1''），78.4（C-2''），76.1（C-3''），69.6（C-4''），76.8（C-5''），61.7（C-6''），100.5（C-1'''），70.6（C-2'''），70.8（C-3'''），71.3（C-4'''），68.1（C-5'''），18.0（C-6'''）。以上数据与文献报道[13]的sarotanoside数据一致，故确定化合物5为sarotanoside。

化合物6：黄色粉末（甲醇），C21H22O11；ESI-MSm/z：451.1 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：12.21（1H，s，5-OH），7.06（1H，d，J＝8.4 Hz，H-6'），6.98（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2'），6.81（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5'），5.92（1H，s，H-6），5.95（1H，s，H-8），5.24（1H，dd，J＝12.7，2.5 Hz，H-2），4.76（1H，d，J＝6.8 Hz，H-1''），3.15（1H，m，H-3β），2.64（1H，m，H-3α）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：79.1（C-2），42.6（C-3），196.7（C-4），162.5（C-5），95.8（C-6），166.7（C-7），96.7（C-8），165.5（C-9），103.2（C-10），129.7（C-1'），115.4（C-2'），145.8（C-3'），145.6（C-4'），114.8（C-5'），120.4（C-6'），102.8（C-1''），73.6（C-2''），77.4（C-3''），70.1（C-4''），76.4（C-5''），61.4（C-6''）。以上数据与文献报道[14]的圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷数据一致，故确定化合物6为圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物7：淡黄色粉末（甲醇），C15H12O5；ESI-MSm/z：273.1 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：12.12（1H，s，5-OH），10.35（1H，s，7-OH），9.16（1H，s，4'-OH），7.35（2H，d，J＝8.4 Hz，H-2'，6'），6.74（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3'，5'），5.92（2H，m，H-6，8），5.53（1H，dd，J＝12.6，2.7 Hz，H-2），3.25（1H，dd，J＝12.6，16.8 Hz，H-3α），2.73（1H，dd，J＝16.8，2.7 Hz，H-3β）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：78.9（C-2），42.1（C-3），196.9（C-4），163.4（C-5），95.4（C-6），167.2（C-7），95.8（C-8），164.1（C-9），102.3（C-10），131.6（C-1'），128.4（C-2'，6'），115.7（C-3'，5'），158.4（C-4'）。以上数据与文献报道[8]的柚皮素数据一致，故确定化合物7为柚皮素。

化合物8：黄色粉末（甲醇），C16H12O5；ESIMSm/z：285.1 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：12.26（1H，s，5-OH），10.16（1H，s，4'-OH），7.85（2H，d，J＝8.6 Hz，H-2'，6'），6.94（2H，d，J＝8.6 Hz，H-3'，5'），6.71（1H，d，J＝1.5 Hz，H-8），6.68（1H，d，J＝1.5 Hz，H-6），6.41（1H，s，H-3），3.83（3H，s，7-OCH3）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：163.9（C-2），103.1（C-3），186.4（C-4），157.6（C-5），98.7（C-6），166.3（C-7），92.7（C-8），161.3（C-9），105.8（C-10），123.1（C-1'），128.6（C-2'，6'），116.4（C-3'，5'），159.8（C-4'），56.8（7-OCH3）。以上数据与文献报道[15]的芫花素数据一致，故确定化合物8为芫花素。

化合物9：黄色粉末（甲醇），C15H12O6；ESIMSm/z：289.1 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：7.16（1H，s，H-2'），6.91（1H，d，J＝8.1 Hz，H-6'），6.72（1H，d，J＝8.1 Hz，H-5'），5.79（1H，d，J＝2.1 Hz，H-8），5.77（1H，d，J＝2.1 Hz，H-6），5.15（1H，dd，J＝12.6，3.2 Hz，H-2），3.12（1H，dd，J＝12.6，16.9 Hz，H-3α），2.71（1H，dd，J＝16.9，3.2 Hz，H-3β）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：79.2（C-2），43.0（C-3），196.3（C-4），163.5（C-5），95.8（C-6），166.9（C-7），95.4（C-8），162.7（C-9），102.3（C-10），129.6（C-1'），113.9（C-2'），145.6（C-3'），145.9（C-4'），115.8（C-5'），118.2（C-6'），。以上数据与文献报道的圣草酚[15]数据一致，故确定化合物9为圣草酚。

化合物10：淡黄色粉末（甲醇），C16H14O5；ESI-MSm/z：287.1 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：12.38（1H，s，5-OH），11.23（1H，s，7-OH），7.35（2H，dd，J＝8.4，2.3 Hz，H-2'，6'），6.91（2H，dd，J＝8.6，2.3 Hz，H-3'，5'），6.12（1H，d，J＝2.2 Hz，H-8），6.14（1H，d，J＝2.2 Hz，H-6），5.24（1H，dd，J＝13.1，2.8 Hz，H-2），3.04（1H，dd，J＝17.0，13.1 Hz，H-3β），2.62（1H，dd，J＝17.0，2.8 Hz，H-3α），3.81（3H，s，4'-OCH3）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：79.6（C-2），43.3（C-3），196.8（C-4），164.2（C-5），96.4（C-6），166.6（C-7），95.9（C-8），163.4（C-9），103.1（C-10），131.2（C-1'），128.4（C-2'，6'），114.8（C-3'，5'），159.6（C-4'），55.9（4'-OCH3）。以上数据与文献报道[16]的angophorol数据一致，故确定化合物10为angophorol。

化合物11：无色针晶（甲醇），C21H22O10；ESI-MSm/z：435.1 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δH：7.48（2H，d，J＝8.6 Hz，H-2'，6'），7.12（2H，d，J＝8.6 Hz，H-3'，5'），6.05（2H，s，H-6，8），5.42（1H，dd，J＝13.9，2.9 Hz，H-2），4.92（1H，d，J＝5.6 Hz，H-1''），4.67（1H，d，J＝5.3 Hz，H-1'''），3.15（1H，dd，J＝16.5，13.9 Hz，H-3β），2.78（1H，dd，J＝16.5，2.9 Hz，H-3α）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δC：78.2（C-2），43.5（C-3），187.4（C-4），163.8（C-5），92.9（C-6），164.6（C-7），94.3（C-8），162.1（C-9），105.3（C-10），129.8（C-1'），128.2（C-2'，6'），117.2（C-3'，5'），156.9（C-4'），101.1（C-1''），73.1（C-2''），77.2（C-3''），70.3（C-4''），76.9（C-5''），60.8（C-6''）。以上数据与文献报道[17]的南酸枣苷数据一致，故确定化合物11为南酸枣苷。

化合物12：淡黄色粉末（甲醇），C16H16O6；ESI-MSm/z：305.1 [M＋H]＋；1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δH：7.16（1H，s，H-3），6.75（1H，d，J＝2.1 Hz，H-8），6.58（1H，d，J＝2.1 Hz，H-6），3.81（3H，s，7-OCH3）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δC：178.2（C-2），103.8（C-3），186.7（C-4），162.8（C-5），99.8（C-6），167.8（C-7），92.1（C-8），159.2（C-9），102.6（C-10），71.8（C-1'），37.8（C-2'，6'），35.9（C-3'，5'），209.6（C-4'），56.0（7-OCH3）。以上数据与文献报道[18-19]的tetrahydroprotogenkwanone数据一致，故确定化合物12为tetrahydroprotogenkwanone。

4 抗骨质疏松活性筛选

小鼠成骨细胞MC3T3-E1经复苏后加至α-MEM培养基（10%胎牛血清）中，在37℃，5% CO2环境下培养直至细胞铺满80%的培养瓶底，中途更换培养基1～2次。使用胰蛋白酶消化细胞，用于后续实验。实验分为空白对照组、阳性对照组、各化合物组，每组平行6份。收集处于对数生长期的MC3T3-E1细胞，调整细胞密度，以5×103个细胞/孔接种于96孔板内，每孔200 μL，转移至培养箱中培养过夜至细胞贴壁。空白对照组加入等量培养基，阳性对照组加入雌二醇使浓度为10 μmol·L-1，各化合物组加入对应化合物使浓度为10 μmol·L-1，转移至培养箱中培养48 h后加入10 μL CCK-8试剂，在室温下孵育1 h，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD）值并计算细胞增殖率。增殖率（%）＝待测组OD值/空白对照组OD值×100%。采用SPSS 17.0进行统计分析，与空白对照组相比，雌二醇及化合物1～4、6～9、12对小鼠成骨细胞MC3T3-E1具有明显的促进增殖的作用（P＜0.01），结果见表1。

表1 川枳壳中各黄酮类化合物对MC3T3-E1细胞增殖的影响(n ＝6，±s)Tab 1 Effect of flavonoids in Citrus Aurantium from Sichuan on the proliferation of MC3T3-E1 cells (n＝6，±s)

表1 川枳壳中各黄酮类化合物对MC3T3-E1细胞增殖的影响(n ＝6，±s)Tab 1 Effect of flavonoids in Citrus Aurantium from Sichuan on the proliferation of MC3T3-E1 cells (n＝6，±s)

注：与空白对照组比较，*P＜0.01；与雌二醇组比较，#P＜0.01。Note：Compared with the blank control group，*P＜0.01；compared with the estradiol group，#P＜0.01.

组别增殖率/%组别增殖率/%空白对照组100.0±3.3雌二醇178.5±5.0*化合物1147.0±7.5*化合物2136.5±9.2*化合物3126.2±9.7*化合物4154.3±3.1*化合物5 99.3±7.1化合物6125.5±9.2*化合物7134.7±5.6*化合物8126.2±4.2*化合物9137.5±4.5*化合物10103.9±5.3化合物11 95.4±4.5化合物12196.3±6.2*#

5 讨论

骨质疏松是一种全身性骨代谢疾病，以骨量降低，骨组织微管结构破坏为特征，造成骨强度降低，骨脆性增加，易引起骨折。我国骨质疏松发病率约为7%，其中绝经后的女性患病率高达50%，人们普遍认为更年期雌激素丢失是导致骨质疏松症的首要原因[20-21]，临床上广泛使用雌激素治疗绝经后骨质疏松症，但雌激素会增加绝经后妇女中风、血栓、腿部痉挛和血管运动症状的发生率[22]。近年来，国内外研究者们发现植物来源黄酮类成分具有抗骨质疏松活性，且不良反应少，价格低廉，作用机制广泛，是理想的天然抗骨质疏松药物，研究较多的有骨碎补总黄酮、淫羊藿总黄酮、大豆异黄酮等[23]。

本研究以中药川枳壳为原料，共分离鉴定出12个黄酮类成分，包括10个二氢黄酮及其苷类、1个黄酮类和1个类黄酮类成分。其中化合物5、8、10、11、12为首次从该种植物中分离得到，化合物5、10、12为首次从该属植物中分离得到。考察了分离所得化合物对小鼠成骨细胞MC3T3-E1的增殖作用，结果显示从川枳壳中分离所得的10个二氢黄酮及其苷类成分中有7个成分（化合物1～4、6、7、9）对MC3T3-E1细胞具有明显增殖作用，证实川枳壳确有潜在的抗骨质疏松作用，且物质基础与其主要成分二氢黄酮及其苷类密不可分。此研究结果与文献报道的柚皮苷（1）[24]、新橙皮苷（2）[25]、柚皮素（7）[26]具有抗骨质疏松作用的研究结果相一致。另外，化合物12为类黄酮成分表现出较强的MC3T3-E1细胞增殖作用，优于阳性药雌二醇，可作为抗骨质疏松的潜在药物进行深入研究。