基于UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS的胃康灵胶囊化学成分分析

刘润花，谭征，杨畅，杨子烨，关晶，张建民 （首都儿科研究所附属儿童医院制剂室，北京 100020）

胃康灵胶囊是由张仲景的中医名著《伤寒论》中所载的“芍药甘草汤”演变而来，由白芍、甘草、白及、茯苓、三七、延胡索、海螵蛸、颠茄浸膏8味药组成的中药复方制剂，辅料为碳酸氢钠。处方按君、臣、佐的中医传统理论进行的组方，白芍和甘草为君药，白及、茯苓和三七为臣药，延胡索、海螵蛸和颠茄浸膏为佐药，8味药合用可用于肝胃不和、瘀血阻络所致的胃脘疼痛、连及两胁、嗳气、泛酸；急、慢性胃炎，胃、十二指肠溃疡，胃出血见上述证候者。胃康灵胶囊治疗慢性胃肠道疾病已有近40年历史。研究表明胃康灵胶囊具有抗应激性溃疡的作用，可用于修复胃溃疡[1-2]。胃康灵胶囊联合雷贝拉唑可降低机体促炎因子水平，调节胃肠激素改善溃疡患者的临床症状[3-4]。此外，胃康灵胶囊、法莫替丁联合多潘立酮可用于治疗慢性胃炎，临床治疗效果显著，安全性较高，有助于改善患者的生活质量[5]。

胃康灵胶囊现收载于《中国药典》2020年版第一部中，是治疗慢性胃炎的代表性中药复方制剂，临床使用广泛。其研究主要集中在质量标准，如特征性化学成分含量测定[6-7]、微量元素含量测定[8]、指纹图谱建立[9]、薄层色谱研究[10]、单味药的质量标准提高等，此外还包括药效学实验、临床疗效观察和工艺研究[11-12]。胃康灵胶囊含有多味中药，化学成分多且复杂，但有关其化学成分的综合分析鲜有报道，在一定程度上限制了其质量控制及药效物质基础的深入研究。LC-MS联用技术具备UPLC的高分离效能和质谱的高选择性、高灵敏度特点，可以快速分析中药及中药复方中的化学成分。目前鲜有学者采用LC-MS技术对胃康灵胶囊的化学成分进行分析。基于此，本研究采用UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技术对胃康灵胶囊中的成分进行快速鉴定分析，以期为进一步明确其药效物质基础，提高其质量控制水平提供参考。

1 材料

1.1 仪器

CPA225D电子天平（德国 SARTORIUS公司）；HH-S4A电热恒温水浴锅（中国北京科伟永兴仪器有限公司）；超纯水仪（型号：Milli-Q Advantage A10 超纯水系统）；UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS质谱仪[美国 Thermo Scientific公司，配有电喷雾离子源（ESI）及Xcalibur 3.0数据处理系统]；Waters HSS T3 UPLC C18 色谱柱（1.7 µm，2.1 mm×150 mm）（Milford，MA，USA）。

1.2 试药

胃康灵胶囊（黑龙江葵花药业股份有限公司，批号：202206041，每粒装0.4 g）；水为超纯水；甲醇、乙腈和甲酸（质谱纯，美国赛默飞世尔科技有限公司）。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

倾出胃康灵胶囊内容物，精密称取2.50 g于100 mL具塞锥形瓶中，按照1∶10的料液比精密加入水50.0 mL，摇匀，水浴加热回流2 h，取出静置放冷，取上清液经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.2 色谱条件

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Waters UPLC C18（1.7µm，2.1 mm×150 mm）。流动相：0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脱（0～2 min，5%B；2～17 min，5%～98%B；17～20 min，98%B）；20～23 min，98%～5%B；23～25 min，5%B）。流速0.3 mL·min-1；柱温40℃；进样量2 μL。

2.2.2 质谱条件 离子源：ESI；在正、负离子模式下进行扫描，扫描方式为Full scan/ddMS2，扫描范围为m/z100～1500 Da；毛细管温度为350℃；负离子模式下的喷雾电压为3800 V，正离子模式下的喷雾电压为3200 V；鞘气为35 arb；辅助气为15 arb；MS2采用低、中、高三种碰撞能，正离子模式为30 eV、40 eV、50 eV，负离子模式为30 eV、50 eV、70 eV。一级质谱分辨率Full scan 70 000 FWHM，二级质谱分辨率：MS/MS 17 500 FWHM。

3 结果与分析

3.1 胃康灵胶囊化学成分分析

基于UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技术，采集得到胃康灵胶囊化学成分的质荷比及保留时间等质谱信息。使用Xcalibur 3.0软件进行数据处理，分析正负离子模式下的一级质谱准分子离子以及二级质谱特征碎片离子，结合相关文献及化合物裂解规律，结果共鉴定出142个化学成分，包括三萜类58个、生物碱类32个、单萜类17个、黄酮类12个、多酚类10个、有机酸类6个，菲类3个、香豆素类1个、木脂素类1个、苯并吡喃类1个和氮苷类1个（质谱偏差范围δ≤5×10-6）。ESI-和ESI＋模式下胃康灵胶囊水提液的基峰离子流图见图1和图2，鉴定结果见表1。

表1 胃康灵胶囊化学成分信息Tab 1 Information of chemical compounds of Weikangling capsule

续表1

图1 ESI-模式下胃康灵胶囊的基峰离子流图Fig 1 Base peak ion flow diagram of Weikangling capsules under negative ion by UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS

图2 ESI＋模式下胃康灵胶囊的基峰离子流图Fig 2 Base peak ion flow diagram of Weikangling capsules under positive ion by UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS

3.2 胃康灵胶囊中各类化学成分的质谱裂解规律

3.2.1 三萜类化合物 三萜类成分是一类基本母核由30个碳原子所组成的萜类化合物，以游离苷元形式或以与糖结合成苷或酯的形式存在于植物体内，其质谱裂解主要为糖苷键的断裂和苷元的开裂。从胃康灵胶囊水提液正负离子模式的质谱图中共鉴定得到58个三萜类化合物，主要来源于甘草、三七和茯苓。以化合物94为例，其保留时间为10.48 min，可观察到准分子离子峰m/z823.4106 [M＋H]＋，推断其分子式为C42H62O16。二级质谱图中母离子依次脱去两个葡糖醛酸分子得到m/z647.3755 [M-C6H9O6＋H]＋和m/z471.3465 [M-2C6H9O6＋H]＋两个特征碎片离子。m/z471.3465为甘草酸苷元，丢失一分子H2O得到m/z453.3361的碎片离子，再失去两个CH2自由基得到m/z425.3415的离子。同时，苷元分子内CO键含有γH可通过麦氏重排得到m/z303.1953的碎片离子，苷元也可经过RDA裂解生成m/z262.1569的碎片离子。结合负离子模式下的准分子离子以及特征碎片离子信息，比对相关文献[16-17]可确定该化合物为三萜类化合物甘草酸，图3为其可能的裂解规律。

图3 甘草酸可能的裂解规律Fig 3 Proposed fragmentation pathways of glycyrrhizic acid

3.2.2 生物碱类化合物 生物碱多具有较复杂的氮杂环结构，根据结构分为有机胺类、异喹啉衍生物、莨菪烷（颠茄烷类）衍生物等。从胃康灵胶囊水提液正负离子模式的质谱图中共鉴定出32个生物碱类化合物，主要来源于延胡索和颠茄浸膏。以化合物62为例，其保留时间为8.48 min，可观察到准分子离子峰m/z340.1540 [M＋H]＋，推断其分子式为C20H21NO4；二级质谱图中母离子丢失中性分子CO得到m/z310.0998的离子碎片。母离子的B环断裂得到m/z165.0545和m/z176.0703的离子碎片。B环和C环发生RDA裂解得到m/z192.0615和m/z149.0596的离子碎片。m/z192.0615碎片A环的两个甲氧基发生断裂失去两个中性分子CH2得到m/z164.0667的离子碎片。此外，母离子的A环失去一个OCH2和一个CH2，D环侧链失去中性分子O-CH2得到m/z263.1071的离子碎片，D环进一步裂解失去C10H5NO2的侧链分子得到m/z107.0494的二级碎片。结合负离子模式下的准分子离子以及特征碎片离子信息，比对相关文献[18-19]可确定该化合物为异喹啉型生物碱氢化小檗碱，图4为其可能的裂解规律。

图4 氢化小檗碱可能的裂解规律Fig 4 Proposed fragmentation pathways of canadine

莨菪烷类生物碱是由莨菪烷衍生的氨基醇与不同有机酸缩合成酯类生物碱，其质谱裂解主要分为三个部分：莨菪醇、莨菪酸及含氮杂环的开裂。以化合物16为例，其保留时间为5.69 min，可观察到准分子离子峰m/z306.1703 [M＋H]＋，推断其分子式为C17H23NO4。二级质谱图中母离子酯键开裂失去莨菪酸得到m/z156.9908 [M-C9H9O]＋及m/z156.9908 [M-C9H9O]＋的多环碎片离子。含氮杂环脱去-CH2CHOH的自由基得到m/z262.1443的离子碎片，再脱去一分子H2O和一分子CH2自由基得到m/z230.9465的离子碎片。m/z262.1443的离子丢失含氮杂环得到m/z165.0517 [M-CH2CHOHC6H11N]＋的碎片离子。此外，从二级质谱图上还能观察到m/z121.1015 [M-C19H26O11]＋和m/z103.1434[M-C19H26O11-H2O]＋的碎片离子。结合正离子模式下的准分子离子以及特征碎片离子信息，比对相关文献[18，20]可确定该化合物为莨菪烷类生物碱山莨菪碱，图5为其可能的裂解规律。

图5 山莨菪碱可能的裂解规律Fig 5 Proposed fragmentation pathways of anisodamine

3.2.3 黄酮类化合物 黄酮类化合物泛指两个苯环通过中央三个碳原子互相连接而成的C6-C3-C6基本骨架的化合物，在其A环和B环上常有甲基或者甲氧基等官能团，并且常与糖结合成苷。黄酮类化合物的主要裂解方式以糖苷键断裂、RDA裂解、CO2、CO等中性离子丢失为主。鉴定出12个黄酮类化合物，主要来源于甘草和白芍。以化合物36为例，其保留时间为7.09 min，可观察到准分子离子峰m/z417.1188 [M-H]-，推断其分子式为C21H22O9；二级质谱图中母离子从胃康灵胶囊水提液正负离子模式的质谱图中共糖苷键断裂得到m/z225.0658苷元离子碎片，苷元发生RDA裂解生成m/z135.8935和m/z119.0484的离子碎片。苷元丢失B环得到m/z161.0445的离子碎片。C环开环失去中性碎片C6H4O2得到m/z161.0445的离子碎片。结合正离子模式下的准分子离子以及特征碎片离子信息，比对相关文献[14，21]可确定该化合物为黄酮类化合物甘草苷，图6为其可能的裂解规律。

图6 甘草苷可能的裂解规律Fig 6 Proposed fragmentation pathways of liquiritin

3.2.4 多酚及酯类化合物 从胃康灵胶囊水提液正负离子模式的质谱图中共鉴定出10个多酚类化合物，主要为白芍和白及中所含化学成分。以化合物61为例，其保留时间为8.42 min，一级质谱图上可观察到m/z771.2714 [M＋HCOO]-的准分子离子峰，二级质谱图上观察到m/z725.2658 [M-H]-1的离子碎片，推断其分子式为C34H45O17；二级质谱图中母离子脱酯键依次得到m/z457.1712[M-C13H16O6-H]-、m/z439.1606 [MC13H16O6-H2O-H]-、m/z285.0968 [M-C13H16O6-H2O-C8H10O3-H]-、m/z189.0757 [M-2C13H16O6-H]-、m/z171.0649 [M-2C13H16O6-H2O-H]-的离子碎片。母离子糖苷键断裂、有机酸酯键断裂得到m/z295.1176 [M-C19H26O116-H]-的离子碎片，再脱去一分子H2O和两分子的H得到m/z259.0970，紧接着失去中性分子C7H6O得到m/z153.0543的碎片离子。结合正离子模式下的准分子离子以及特征碎片离子信息，比对相关文献[22-23]可确定该化合物为多酚及酯类化合物militarine，图7为其可能的裂解规律。

图7 Militarine可能的裂解规律Fig 7 Proposed fragmentation pathways of militarine

4 讨论

参照胃康灵胶囊的制备工艺确定供试品溶液的提取方法[24]。胃康灵胶囊中白及、三七和海螵蛸为原粉入药，甘草、白芍、茯苓和延胡索为水煎液浓缩干燥后入药，颠茄以浸膏的形式入药。其次，中药制剂大多数以口服的形式给药，故本试验以水为溶剂通过加热回流对胃康灵胶囊中的化学成分进行提取。通过分析裂解碎片信息，结合相关文献，共鉴定出胃康灵胶囊中142个化学成分，同时对各类化学成分进行归属，其中有24个来源于白芍，33个来源于甘草，13个来源于白及，20个来源于茯苓，19个来源于三七，14个来源于延胡索，21个来源于颠茄。

白芍含有挥发油类、单萜类及黄酮类等化合物，其中，白芍单萜类化合物芍药苷和芍药内酯苷均具有较好的镇痛作用，芍药苷可通过抑制炎症因子释放缓解疼痛[25]。甘草含有三萜皂苷类、黄酮类、甘草多糖类等[16]。现代药理研究证实，芍药甘草汤具有解除肠道平滑肌痉挛、调节胃肠蠕动节律、保护胃黏膜等多种药理作用[26]。

白及含有大量淀粉、葡萄糖和蒽醌类等化合物，此外还含有联苄类、二氢菲类和联菲类化合物，其中，1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯（militarine）含量较高，为白及的主要活性成分，具有抗炎、舒张血管的作用[27]。茯苓含有三萜类、多糖类、甾体类等化合物，具促进水液代谢、调节胃肠功能等药理作用[28]。三七主要含有三萜皂苷、黄酮类等活性成分[29]，其中三萜皂苷类如人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1为其主要活性成分。

延胡索主要化学成分为生物碱，如小檗碱、延胡索乙素、延胡索甲素等，具有活血、行气、止痛的功效[30]。海螵蛸含有碳酸钙和壳角质，具有中和胃酸、止痛的作用。颠茄浸膏含有山莨菪碱、氢化小檗碱等生物碱，具有消解平滑肌痉挛与止痛的作用[31]。

本文采用UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技术建立了一种高效、快速的定性分析方法，对胃康灵胶囊中的化学成分进行了鉴别分析。在鉴定得到的化合物中militarin、芍药苷、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1、三七皂苷R1、人参皂苷Re、甘草苷、甘草次酸、甘草酸和阿托品已被研究者选作指标性成分进行含量测定研究，用于控制胃康灵胶囊的质量[6-7]。本文鉴定得到的化学成分可为进一步明确胃康灵胶囊的药效物质基础及选择合理的质控指标提供参考依据。