乌衣红曲黄酒年份特征挥发性物质指纹图谱分析

苏 昊，李维新*，林晓姿，何志刚，梁璋成，任香芸

（1 福建省农业科学院农产品加工研究所 福州350003 2 农业农村部亚热带特色果蔬菌加工重点实验室 福州350003 3 福建省农产品（食品）加工重点实验室 福州 350003）

黄酒的风味在黄酒质量评价中虽占有重要地位，但其风味的形成受酒中的各种化学成分的影响。同时因黄酒中的化学成分非常复杂，通过感官评定或个别成分的分析来评价其风味及质量品质，易受人为等外界因素的影响[1-2]。虽然个别成分的分析不能反映黄酒的整体品质，但是GC-MS 指纹图谱技术的应用可以解决这些问题[3]，使黄酒的品质评价更加的准确，并可为黄酒基酒的酒龄鉴别提供支撑。酒类指纹图谱是借用中药指纹图谱的发展和应用而来的，最先发展起来的是基于高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）技术的酒类化学成分色谱指纹图谱[4]。朱潘炜等[5]以乙酸乙酯、3-甲基丁醇、β-苯乙醇等5 种特征成分峰为指纹峰，利用平均值法构建1～10 年陈浙江古越龙山绍兴黄酒基酒的标准指纹图谱用于黄酒的品质和酒龄分析，并证实挥发性物质指纹图谱的可靠性。

福建乌衣红曲黄酒是具有地区特色的黄酒品种，是以糯米、籼米、粳米等为原料，以乌衣红曲为糖化发酵剂酿造而成的低酒度、高营养的饮料酒[6]。乌衣红曲黄酒的陈酿时间是其品质的重要指标[7]，其对黄酒品质的影响最终体现在风味上[8]。因酿造用曲和酿造工艺的不同导致乌衣红曲黄酒的挥发性物质差异，进而影响黄酒的风味品质[9]。目前对乌衣红曲黄酒的酒龄和品质的评定尚无统一的标准，也无挥发性指纹图谱的相关研究报道。建立一套科学的产品质量评价方法，是促进红曲黄酒行业健康蓬勃发展的当务之急。乌衣红曲黄酒挥发性物质指纹图谱和感官评价作为检测和反映乌衣黄酒品质的重要手段[10]，是其质量评价体系的重要组成部分。该指纹图谱的建立，有利于全程监控黄酒产品质量，为福建乌衣红曲黄酒基酒产品陈酿质量的评价提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酒样为陈酿时间为2，4，5，6，7，8，9，10，12 年和15 年的乌衣红曲黄酒基酒，每年份各取3 个批次，由福建山里陈酒业有限公司提供。

标准品：2-辛醇，sigma 公司。

1.2 仪器

岛津GCMS-TQ8040 三重四极杆型气相色谱质谱联用仪，日本岛津公司；SPME 手动进样装置，50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头，美国SUPELCO 公司；顶空瓶15 mL，Agilent 公司；恒温水浴锅，上海市实验仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 萃取头老化 将萃取头于270 ℃下老化1 h，至无干扰峰出现。

1.3.2 色谱条件 采用色谱柱HP-INNOWAX（30 m×0.25 μm×0.25 μm）。初始柱温40 ℃保持3 min，后以6 ℃/min 升温至100 ℃，以10 ℃/min 升温至230 ℃，保持7 min。进样口温度均为250 ℃，不分流模式进样。

接口温度280 ℃，EI 电子原，扫描范围（m/z）33～550 u，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，采集方式为全扫描模式。

1.3.3 样品分析 称取1 g 酒样，吸取5 μL 质量浓度为0.5 mg/mL 2-辛醇溶液，加入15 mL 顶空瓶中，加盖后放入恒温水浴锅中50 ℃预热10 min，将老化后的萃取头插入顶空瓶，推出纤维头，使其暴露于样品液面上方，放入恒温水浴锅中50℃吸附50 min。当样品萃取时间结束时，立即将萃取头插入气相色谱仪的进样口，热解吸5 min 后启动气相色谱仪采集数据。

1.4 挥发性物质的定性和定量

采用气相气质色谱仪器配置的NIST14 挥发性物质数据库对化合物进行定性。以2-辛醇为内标，对黄酒中会挥发性化合物含量进行定量。

1.5 挥发性物质指纹图谱的建立与验证

以基酒中已定性的挥发性物质为研究对象，采用正交偏最小二乘判别分析及Spearman 相关性分析方法，筛选出与陈酿时间密切相关的关键挥发性物质，再以这些关键挥发性物质作为特征指纹峰构建年份特征挥发性物质对照指纹图谱，这些挥发性物质检测方法稳定性参照指纹图谱构建的要求进行方法学考察[11]；指纹图谱的可靠性验证，是通过第2 次在原基酒厂取样，以年份特征挥发性物质为指标，比较基酒样品与对照指纹图谱的相似程度，并加以评估。

1.6 数据分析

基酒相似度计算采用夹角余弦法[5]，使用EXCEL 2019 软件完成；图谱绘制采用Origin 2018软件；主成分分析采用SIMCA14 软件；Spearman相关性分析采用R 语言。

2 结果与分析

2.1 福建乌衣红曲黄酒基酒挥发性物质解析

挥发性成分是影响黄酒风味的重要因素，它的组成、气味阈值和相互作用对酒体整体的风味感知具有重要影响。随着陈酿时间的延长，红曲黄酒的挥发性成分也相应发生变化，某些具有特征意义的挥发性成分，与陈酿年份具有一定的相关性。采用HS-SPME-GC-MS 技术，对收集到的不同年份乌衣红曲黄酒样品分别进行检测，对其中的122 种挥发性成分进行了定性和定量，其中包含酯类49 种、醇类17 种、酸类11 种、醛类8 种、烷烃类6 种、苯环芳香烃类10 种（表1）。

表1 乌衣红曲黄酒基酒中挥发性成分Table 1 Volatile components in red koji yellow rice wine base wine

2.2 乌衣红曲黄酒基酒年份特征挥发性风味物质的确定

基于不同年份乌衣红曲黄酒挥发性风味物质的分析结果，对其中检测到的122 种挥发性风味物质，采用OPLS-DA 分析，不同陈酿时间不同批次的分析归类结果（P＜0.05）见图1。根据聚类分析，将不同年份的乌衣红曲黄酒基酒划分为3 类：2～4 年陈，5～9 年陈，10～15 年陈，表明乌衣红曲黄酒基酒陈陈酿可以分为3 个较为稳定的阶段，在某一阶段内，其挥发性物质种类和含量变化虽较小，但不同阶段则变化较大。

图1 OPLS-DA 主成分分析Fig. 1 Principal component analysis of OPLS-DA

对上述检测的挥发性风味物质，继续采用OPLS-DA 分析进行变量投影重要性预测VIP 值解析（图2），初筛出对风味起较大贡献的风味物质（VIP 值＞1）共45 种。进一步采用Spearman 相关性分析法解析乌衣红曲黄酒基酒年份特征挥发性风味物质（P＜0.05 且相关性|r|＞0.5）共20 种，结果见图3，其中与陈酿时间呈正相关关系的成分有8种：N-苯甲酰甘氨酸乙酯、6-庚烯酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、3-（2-呋喃基）-2-丙烯醛、苯乙酸乙酯、2-十五烷基-1，3-二氧杂环庚烷、苯甲醛、苯并噻唑；与陈酿时间呈负相关关系的成分有12 种：庚酸乙酯、辛酸、2-呋喃甲醇、辛酸乙酯、1-辛烯-3-醇、1-辛醇、α-亚乙基-苯乙醛、2-乙氧基四氢-2H-吡喃、二氢-5-甲基-2（3H）-呋喃酮、丙酸-2-甲基-3-羟基-2，2，4-三甲基戊酯、十九酸乙酯、2，4-二叔丁基苯酚。

图2 OPLS-DA 分析变量投影重要性预测值（VIP 值）Fig. 2 Predicted value of projection importance of OPLS DA analysis variables（VIP value）

2.3 乌衣红曲黄酒年份基酒相似度分析

以筛选出的与年份基酒年份紧密相关的20种挥发性物质为对象，计算不同年份基酒之间的相似度（表2）。结果表明，2，4 年陈乌衣红曲黄酒与2，4 年陈乌衣红曲黄酒间的相似度在1.000～0.9720 之间，与5，6，7，8，9 年陈黄酒间的相似度在0.9622～0.9420 之间，与10，12，15 年陈黄酒间的相似度在0.9369～0.9342 之间。同样，结合前面分析的结果，同一陈酿区间的相似度较高，不同陈酿区间相似度则较低，因而根据年份特征性挥发性成分的相似度，也可将乌衣红曲黄酒基酒划分为2～4，5～9 年和10～15 年3 个不同陈酿阶段，分别命名为：青陈酒、中陈酒和老陈酒。

2.4 乌衣红曲黄酒年份基酒挥发性物质特征指纹图谱构建

以年份相关性|r|＞0.5 成分为特征峰，保留时间为X 轴，吸收峰强度为Y 轴，绘制青、中、老不同陈酿区间的红曲黄酒年份特征挥发性物质对照指纹图谱（图4），图谱中特征峰吸收强度分别为2～4，5～9，10～15 年特征峰强度的平均值，其余非特征挥发性物质峰未在图谱中显示。其中，在青陈酒中，N-苯甲酰甘氨酸乙酯未发现，随着陈酿时间的延长，在5～15 年陈酿阶段含量逐渐增加，其指纹图谱应由除N-苯甲酰甘氨酸乙酯外的19 种特征挥发性物质组成；在老陈酒中，2-呋喃甲醇、α-亚乙基-苯乙醛和2，4-二叔丁基苯酚在2～4 年陈酿阶段含量最高，随着陈酿时间的延长逐渐减少，在10～15 年基酒中未检测到，因而其指纹图谱由除以上3 种成分外的17 种特征挥发性物质构成；中陈酒特征挥发性物质组成介于青、老陈酒之间，其指纹图谱由对照图谱中标示的20 种挥发性物质作为特征峰构建而成。

图4 青、中、老陈红曲黄酒对照指纹图谱Fig. 4 Comparison fingerprints of youth age，middle age and old age Hongqu Huangjiu

2.5 挥发性物质特征指纹图谱验证

为验证建立的指纹图谱的可靠性，距第1 次取样间隔约2 年后从基酒原厂再次取样，样品陈酿时间分别为6 年和11 年。基于黄酒基酒年份特征成分的OPLS-DA 分析（图5）及基酒与对照图谱相似度比较（表3）的结果显示，6 年基酒与中陈酒（5～9 年）更接近，11 年基酒与老陈酒（10～15年）更接近，结果得到了互相验证，表明所构建的挥发性物质特征指纹图谱能够较好地区分不同陈酿时期的乌衣红曲黄酒基酒。

图5 基于基酒年份特征成分的OPLS-DA 分析Fig. 5 OPLS-DA analysis based on the age characteristics of base liquor

表3 6 年和11 年陈基酒与对照图谱的相似度Table 3 Similarity between 6-year and 11-year old base liquor with comparison fingerprints

3 讨论与结论

黄酒在其生命期内，品质也会随着贮藏时间的延长在不断地发生变化。新酿制出来的基酒通过“陈化”可以有效促进酒精分子之间以及酒精分子与水分子之间的缔合，促进醇与酸之间的酯化，使酒香味馥郁，口味甘顺、柔和[12]。黄酒的挥发性物质成分是决定黄酒质量的重要因素之一，影响黄酒的感官评价质量与风格确定。黄酒的风味主要来源于原料、发酵过程中的微生物活动与陈化等[18-19]。酒类香气成分分析技术日益成熟且研究较多，常见的预处理技术有液液萃取、蒸馏萃取、动态或静态顶空法、固相萃取和固相微萃取等[20-21]。其中固相微萃取结合顶空分析建立起来的样品预处理技术集采样、萃取、浓缩于一体，绿色环保、方便快捷、成本低、重现性好，已成为酒类挥发性成分分析主流的技术之一[22-23]。

在本研究中乌衣红曲黄酒基酒中挥发性物质以酯类为主，其含量达到约一半，其次是醇类，其中筛选出的年份特征成分中除了1-辛烯-3-醇、苯甲醛等在黄酒风味物质的报道中已有报道[13-15]，还有一些少有报道6-庚烯酸乙酯、乙酸-2-乙基苯酯、3-（2-呋喃基）-2-丙烯醛等成分，可见不同产地、酿造工艺生产的黄酒[16-17]，对黄酒成分尤其微量成分的组成影响较大，而这些成分随着陈酿时间的变迁而消长，其成为陈酿品质的重要标志之一。N-苯甲酰甘氨酸乙酯在2～4 年陈酒中未发现，5～9 年酒中开始出现，10～15 年酒中显著增加，而2-呋喃甲醇、α-亚乙基-苯乙醛和2，4-二叔丁基苯酚则随着陈酿时间的延长逐渐减少，在10 年及以上基酒中未检出，因而成为乌衣红曲黄酒基酒陈酿时间的重要特征成分。

指纹图谱能从整体反映出酒类产品的质量，故近年来对酒类指纹图谱技术研究越来越广泛，因酿造用曲和工艺的不同导致红曲黄酒的挥发性物质差异，从而使不同的红曲黄酒的指纹图谱不同。本研究中构建的乌衣红曲黄酒基酒特征挥发性物质指纹图谱，将2～15 年陈黄酒区分为3 个陈酿阶段，这可能是由于乌衣红曲黄酒基酒的陈酿是一个循序渐进的过程，陈酿间隔期短，其中的挥发性物质变化并不显著，导致区间内基酒间相似度高，不足以将各年份严格地区分开来，并准确的判定基酒的陈酿时间。因此，将乌衣红曲黄酒基酒根据陈酿的不同阶段加以区分，而不是某一年，更为贴近黄酒生产中的实际情况。

本研究基于筛选年份特征挥发性物质，构建乌衣红曲黄酒基酒年份基酒指纹图谱，可用于山里陈红曲黄酒陈酿期判别，该结果为乌衣红曲黄酒基酒的质量控制以及年份鉴别提供了技术参考。