外源AHLs 培养下荧光假单胞菌qPCR 内参基因的筛选

崔方超，王芸婷，王当丰，檀茜倩，李秋莹，励建荣*，李婷婷

（1 渤海大学食品科学与工程学院 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心中国轻工业海水鱼加工重点实验室 辽宁锦州121013 2 大连民族大学生命科学学院 辽宁大连 116600）

实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qPCR）因特异性强、灵敏度高、定量准确、高通量、操作简便等优点，而被广泛应用于基因表达的研究中[1]。qPCR 检测基因表达水平的定量方法分为绝对定量和相对定量。相较于相对定量法，使用绝对定量法需要构建不同梯度稀释的标准品并绘制标准曲线来计算目的基因模板的起始量，操作更为繁琐且增加了试验难度[2]。因此，在使用qPCR 检测基因表达水平时大多采用相对定量法，通常需要引入一个在不同样本内表达稳定的基因作为内参基因，从而校准目的基因的表达量[3]。常用的内参基因有GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、ACT（肌动蛋白）、TUB（微管蛋白）、His（组蛋白）、16S rRNA（16S 核糖体RNA）等。大量研究表明，上述内参基因有可能因物种、生长阶段或发育条件的不同而表达不稳定，因此，需要根据试验条件选择能够稳定表达的内参基因来保证qPCR 结果准确可靠[4-6]。

荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）属于革兰氏阴性需氧杆菌，具有脂解和蛋白水解活性，是奶类[7]、水产品[8]、肉制品[9]等食品在冷藏条件下的优势腐败菌。荧光假单胞菌能产生生物被膜、胞外蛋白酶、嗜铁素等多种致腐因子，导致食品腐败变质，分泌酮类、醛类、醇类等多种挥发性有机化合物，散发令人不快的气味[8，10-11]。作为常见的致病性嗜冷菌，荧光假单胞菌对环境适应力强，其产生的蛋白酶和脂肪酶极其耐热，这不仅缩短了食品的货架期，还有可能危害到人体健康。研究表明，荧光假单胞菌的腐败特性如生物被膜的形成、胞外蛋白酶的分泌等受群体感应（Quorum sensing，QS）系统的调控[12]。QS 系统是一种细菌通讯机制，微生物通过信号分子监测群体密度并激活相关基因表达来调节其生理行为以适应环境变化[13]。近年来以荧光假单胞菌等腐败菌的QS 系统为靶标来调控其腐败特性已成为研究热点[14-16]。通过致腐因子的表征和腐败基因的表达来探索食品腐败机制，其中对腐败基因表达水平的检测大多采用qPCR 技术，大部分都以16S rRNA 作为内参基因。目前内参基因的筛选分析多围绕动物与植物，对微生物内参基因的研究较少，尚未有有关荧光假单胞菌在QS 方面内参基因筛选方面的研究报道。

本文以荧光假单胞菌PF-08 为试验菌株，根据文献查找和前期基因组测序结果，选择8 个候选内参基因（dsbA、carA、rpsL、gyrB、atpD、rpoD、gltA、16S rRNA），通过qPCR 研究不同QS 信号分子培养下候选内参基因的表达水平。利用geNorm[17]、Normfinder[18]、BestKeeper[19]和RefFinder[20]分析这8个候选内参基因的表达稳定性，从而筛选出合适的内参基因，为利用qPCR 技术研究荧光假单胞菌QS 相关的致腐基因表达提供科学依据；也为其它腐败菌在QS 方面的基因定量研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

荧光假单胞菌PF-08（从腐败大菱鲆中分离纯化）保藏于渤海大学食品科学与工程学院。

C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL，美国Sigma 公司；LB 肉汤，青岛高科园海博生物技术有限公司；固相表面RNase 清除剂、EZ-10 总RNA 小量提取试剂盒、RNase-Free DNA 清除试剂盒、Taq PCR 预混液（2X，含红染料）、DNA Marker、4S Green 核酸染色剂、琼脂糖，生工生物工程（上海）股份有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）试剂盒、TBPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 仪器与设备

Imark 酶标仪、GelDoc XR+全自动凝胶成像系统，美国Bio-Rad 公司；Legend Micro21R 台式微量离心机、NanoDrop One 超微量紫外-可见分光光度计、Applied Biosyetems StepOne Plus 荧光定量PCR 仪，美国Thermo 公司；Eppendorf 5331梯度PCR 仪，德国Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种培养及外源AHLs 处理 将过夜活化后的荧光假单胞菌PF-08 按照体积比1∶100 的比例接种于10 mL 含有2 μg/mL 不同类型（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL）外源信号分子的LB 肉汤中，以未添加外源AHLs 的LB 肉汤作为对照，28 ℃、160 r/min 摇床培养至OD595nm为1左右。

1.3.2 总RNA 提取与cDNA 合成取1.3.1 节的7 个菌液样本，使用EZ-10 总RNA 小量提取试剂盒及RNase-Free DNA 清除试剂盒提取总RNA；为了防止RNA 降解，需在低温环境下快速操作，还需要用固相表面RNase 清除剂来清洁工作环境。提取的总RNA 经过超微量分光光度计和1.0%琼脂糖凝胶电泳联合检测，分析其纯度和浓度是否达标。以检测合格的总RNA 为模板，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time）试剂盒合成cDNA。

1.3.3 候选内参基因选择和引物设计及特异性检测根据文献选取8 个常见的管家基因作为候选内参基因（表1）：dsbA、carA、rpsL、gyrB、atpD、rpoD、gltA、16S rRNA。它们要么在碳水化合物代谢中起关键作用，要么曾被用作系统发育标记。

根据前期基因组测序结果（GenBank 登录号：CP032618）[27]获得候选内参基因的序列，基于qPCR 反应对引物特异性的要求设计这8 个内参基因的上下游引物（表2），由上海生工生物合成。

以1.3.2 节获得的cDNA 为模板，引物见表2，对这8 个候选内参基因进行PCR 扩增，检测其特异性，反应体系和程序参照Taq PCR 预混液（2X，含红染料）的使用说明。通过2.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增后的产物，观察各基因在这7 个样本的条带大小是否与预期一致，以及是否有杂带产生。

1.4 数据分析

StepOneTMSoftware v2.3 软件自动得出各样本的Ct 值，利用geNorm、Normfinder、BestKeeper 3 个程序和 RefFinder 网站（http：//blooge.cn/RefFinder/）对数据进行分析，评估8 个候选内参基因的表达稳定性。geNorm 是Vandesompele 等[17]基于Microsoft Excel 编写的一个Visual Basic 应用程序（VBA），可以识别给定组织中表达最稳定的内参基因，并确定计算可靠归一化因子所需的最少基因数即内参基因最佳数量。NormFinder 程序植根于基因表达的数学模型，该模型不仅能估计候选基因的总体变化，而且能估计样本组之间的变化[18]。与上述两个程序不同，除了比较内参基因间的稳定性，BestKeeper 程序还可以同时比较目的基因的表达水平，一次最多能分析100 个样本中10 个内参基因和10 个目的基因的表达水平[19]。RefFinder 网站集成了以上3 个软件的算法和比较delta-Ct 方法[28]来对候选内参基因的表达稳定性进行排序[20]。

2 结果与分析

2.1 总RNA 质量检测

7 个样本总RNA 的浓度和纯度（A260nm/A280nm与A260nm/A230nm）通过超微量分光光度计检测，结果见表3。根据cDNA 的反应体系，RNA 的质量浓度不能低于77.0 ng/μL。表3 中所有样本总RNA的质量浓度都较高，最低值为462.3 ng/μL，最高值为1 240.2 ng/μL。RNA 纯度指示值中的A260nm、A280nm、A230nm分别代表了核酸、蛋白质、碳水化合物的吸收峰。所有样本总RNA 的A260nm/A280nm比值均在2.1～2.2 之间，没有低于2.0，表示RNA 没有受蛋白质或酚类物质污染；虽然略高于纯RNA 的比值2.0，但没有超过2.2，表示RNA 虽存在降解但程度不深。所有总RNA 的A260nm/A230nm均大于2.0，说明样本没受碳水化合物、胍盐等污染，RNA的纯度良好。从图1 可以看到，1～7 泳道均有两条明亮清晰的条带分别代表28S rRNA 和18S rRNA，且没有明显的弥散现象，说明提取的总RNA 完整性较好，浓度较高且降解程度较低。总之，提取的总RNA 均质量良好，可用于合成cDNA。

图1 外源AHLs 培养下荧光假单胞菌的总RNA琼脂糖凝胶电泳图Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA of Pseudomonas fluorescens under the culture of exogenous AHLs

表3 外源AHLs 培养下荧光假单胞菌的总RNA 质量检测Table 3 Quality detection of total RNA of Pseudomonas fluorescens under the culture of exogenous AHLs

2.2 引物特异性检测

以cDNA 为模板，通过PCR 反应和2.0%琼脂糖凝胶电泳检测这8 个内参基因的qPCR 引物是否具有特异性。从图2 中可以看到这8 个候选内参基因的PCR 产物大小与预期一致，且条带清晰单一，并无引物二聚体产生。这8 个内参基因的引物均具有良好的特异性，满足qPCR 试验对引物的要求。

图2 候选内参基因PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of PCR products of candidate reference genes

2.3 qPCR 结果分析

由图3 可知，8 个候选内参基因的溶解曲线均呈现特异的单一信号峰，没有产生非特异性杂峰，不存在引物二聚体，进一步验证这8 个候选内参基因的引物均特异性良好。qPCR 试验结果准确可靠，Ct 值可以用于后续分析。

图3 候选内参基因qPCR 溶解曲线Fig. 3 The qPCR melting curves of candidate reference genes

Ct 值是指反应管内的荧光信号在qPCR 扩增过程中达到阈值（软件自动设定在从基线到指数增长的拐点）时的扩增循环数。qPCR 国际化标准（MIQE 指南）[29]指出，Ct 值与该基因的起始模板浓度负相关，Ct 值越小则该基因在样本中的表达丰度越高。内参基因的Ct 值应在10～25 之间，表达丰度过高或过低都不利于定量目的基因的表达水平。因此，由图4 可知，16S rRNA 的Ct 值偏低，其它基因的Ct 值均在16.02～21.58 之间。比较同一内参基因在7 个样本间的Ct 值变化程度，由小到大依次为：gltA、rpoD、atpD、rpsL、carA、16S rRNA、dsbA、gyrB。结果表明，gltA 的Ct 值变化程度最小，表达稳定性最高，其次是rpoD。根据Ct 值直接判断出最适内参基因还不够准确，仍需要通过geNorm、Normfinder、BestKeeper 和RefFinder 进一步分析并综合评估。

图4 候选内参基因qPCR 的Ct 值分布图Fig. 4 The qPCR Ct value distribution of candidate reference genes

2.4 候选内参基因稳定性分析

评估内参基因表达稳定性的几个程序各有不同的使用要点和分析侧重点，最常用的程序是geNorm、NormFinder 和BestKeeper[30]。

内参基因的表达稳定性在geNorm 程序中表示为M 值，M 值是某一内参基因与其它内参基因表达水平的两两比值经对数变换后的平均标准差。以1.5 为阈值，M 值超过1.5 就表示该基因表达不稳定，不适合作内参基因。从图5a 中可知较稳定的内参基因为atpD 和rpoD，且8 个基因的M 值均低于1.5，可被列为候选内参基因。geNorm还可以确定内参基因的最适数目，通过对标准化因子进行差异分析计算配对变异V 值，选择出2个及以上的内参基因。以0.15 为阈值，当Vn/n+1低于0.15，就表示用n 个基因同时作为内参基因，取均值后定量目的基因，可以得到更可靠的试验结果。图5b 中的Vn/n+1值均低于0.15，则最少可选用2 个内参基因。结合图5a，atpD 和rpoD 作为内参基因联合使用，可以减少试验误差，更准确地分析基因表达量。

图5 geNorm 分析候选内参基因的表达稳定性（a）和最适内参基因数目（b）Fig. 5 geNorm analyzes the expression stability of candidate reference genes（a）and the optimal number of reference genes（b）

NormFinder 直接比较内参基因在样本组内和组间的表达差异，结果用稳定性值（SV）表示，根据SV 值大小对内参基因进行排序，SV 值最小的基因即为最适内参基因。从图6 可知，基因表达最稳定的为gltA，其次是rpsL，最不稳定的为16S rRNA。

图6 NormFinder 分析候选内参基因的表达稳定性Fig. 6 NormFinder analyzes the expression stability of candidate reference genes

与以上两个程序不同，BestKeeper 直接分析各内参基因的Ct 值，通过Ct 值计算表达水平的标准差（SD）来评估内参基因的稳定性，SD 值越小则基因表达越稳定。因此，表4 中基因表达稳定性由高到低依次为gltA>rpoD>rpsL>atpD>carA>16S rRNA>dsbA>gyrB。另外，为了评估所有候选内参基因间的关系，BestKeeper 还进行了成对的相关分析，皮尔逊相关系数r 和P 值见表4。rpsL 与其它基因的相关性最高，其次是carA 和16S rRNA，这3 个基因也达到显著水平（P<0.05），gltA 的相关性最低。

表4 BestKeeper 分析候选内参基因的表达稳定性Table 4 BestKeeper analyzes the expression stability of candidate reference genes

RefFinder 网站通过以上3 个软件的算法和比较delta-Ct 方法对候选内参基因的表达稳定性进行比较和排名，同时根据各程序的结果采用几何平均值法进行综合排名。网站的操作很简便，用户只需要在窗口输入各候选内参基因的Ct 值，即可得出候选内参基因的表达稳定性排名。结果见表5，geNorm、Normfinder、BestKeeper 在网站中的排名和上面单独使用程序得出的稳定性排名，其结果相一致。从综合排名来看，这8 个候选内参基因中表达稳定性较高的是rpoD 和gltA，稳定性最低的是16S rRNA。因此，rpoD 和gltA 适宜选为荧光假单胞菌在外源AHLs 培养下基因表达的内参基因。

表5 候选内参基因表达稳定性排名Table 5 Expression stability ranking of candidate reference genes

3 讨论与结论

荧光假单胞菌是冷藏食品的优势腐败菌，其致腐因子如生物被膜、蛋白酶和脂肪酶的合成都受到QS 信号分子的调控[12，31]。在探索QS 对食品腐败调控机制的过程中，需要用到能够稳定表达的内参基因来准确定量致腐基因的表达。因此，本文通过qPCR 技术研究了8 个常见的候选内参基因（dsbA、carA、rpsL、gyrB、atpD、rpoD、gltA、16SrRNA）在荧光假单胞菌经不同类型QS 信号分子培养后的表达情况，为确保表达稳定性评价准确使用了geNorm、Normfinder、BestKeeper 和RefFinder 4 个程序，综合评估后从8 个候选内参基因中筛选出最适内参基因。结果表明，在外源AHLs 刺激下，荧光假单胞菌中rpoD 和gltA 的基因表达最稳定，可用于后续荧光假单胞菌QS 调控机制的研究中。

目前，通过qPCR 技术研究细菌功能基因在不同生长阶段或者不同生长条件下的表达水平，多以16S rRNA 作为内参基因。在大部分细菌中16S rRNA 都高度保守且具有特异性[32]，常被用作内参基因，然而在本文中，16S rRNA 的Ct 值在8.27～9.37，表达丰度过高且稳定性最差，不是荧光假单胞菌内参基因的最佳选择，最适内参基因为rpoD 和gltA。rpoD 编码RNA 聚合酶sigma70 因子，序列保守性超过50%，常用于菌株的分类鉴定和进化分析[33]。gltA 编码柠檬酸合酶（三羧酸循环的关键酶），最近也被用于多位点序列分析和系统发育分析[34]。Gomes 等[35]从11 个基因中筛选出recA、rho、rpoD 和proC 作为肺炎克雷伯菌在不同生长阶段或环境胁迫下基因表达的最适内参基因。郑永钦等[36]发现rpoD 在柑橘黄龙病菌中表达稳定性较差，进一步证明不同物种的最适内参基因不一定相同。此外，geNorm、Normfinder、Best-Keeper 这3 款程序的统计方法皆不相同，评估候选内参基因的表达稳定性时可能会出现结果不一致的情况，这就需要进一步使用RefFinder 对这3款程序的结果进行综合评估，确保筛选结果更为可靠。

综上所述，本研究通过对候选内参基因层层筛选与全面评估后，获得了荧光假单胞菌在外源QS 信号分子培养下表达稳定的2 个内参基因rpoD 和gltA，为后续探究荧光假单胞菌致腐基因表达提供理论支持；也为其它腐败菌提供内参基因的参考，从而在研究QS 基因表达时获得更可靠的相对定量结果。