产细菌素Enterocin Y3 粪肠球菌对小鼠肠道菌群及代谢功能的影响

杨珍珠，陶乐仁，赵陆恺，王 元，迟 海*

（1 中国水产科学研究院东海水产研究所 上海200090 2 上海理工大学健康科学与工程学院 上海 200093）

近年来，食源性致病菌的污染和繁殖一直是造成食品安全隐患的首要问题之一[1]。特别是抗生素的滥用使细菌的耐药性增强，耐药性致病菌的残存和增殖成为全球公共卫生主要影响问题之一[1]。此外，对于一些特定致病菌的治疗，传统的广谱抗生素会扰乱宿主肠道微生物群，影响其免疫、代谢等正常功能的发挥。因此，寻找更加安全、高效的抗菌药物十分迫切。

粪肠球菌（Enterococcus faecalis）为乳酸菌目肠球菌科肠球菌属的一种兼性厌氧菌，是一种广泛存在于人类或动物肠道的共生菌，具有较强的耐酸性和定植能力，营养要求不高，易培养的特点，可作为益生菌，在调节肠道微环境、机体免疫中发挥着重要作用[2-3]。此外，粪肠球菌具有产核糖体合成抗菌肽（称为细菌素）的能力，粪肠球菌素具有安全性高、热稳定性强、易被蛋白酶水解和对亲缘细菌有高效抑制的特点，对食源性致病菌、耐药性肠球菌和特定腐败菌的残存具有特异性消杀/抑制作用[4]。粪肠球菌素这种靶向抑菌的作用，可避免对肠道其它有益微生物菌群造成伤害[5]。有效开发和利用产细菌素的粪肠球菌对肠道疾病的调控具有重大意义[6]。

实验室工作人员前期从羊奶中分离出1 株在体外具有潜在益生特性的粪肠球菌DH9003，结果发现其抑菌产物细菌素对食源性致病菌【如单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等】及其亲缘较近的耐药性肠球菌有高效益抑制作用[7]。为进一步探讨该粪肠球菌的益生菌特性，本研究通过建立健康小鼠（C57 小鼠）模型，对小鼠灌胃粪肠球菌DH9003，在不同时间内收集小鼠粪便，分析粪肠球菌DH9003 在小鼠体内的定植情况。通过16S rDNA 高通量测序及非靶向代谢组分析，研究粪肠球菌DH9003 对小鼠肠道菌群结构及其代谢能力的影响。结合小鼠肝脏、肠道切片的显微镜观察，综合评估粪肠球菌DH9003 的益生特性，为益生菌的资源开发提供技术支持，也为由食源性致病菌及耐药性肠球菌引起的肠道疾病的治疗提供新的解决思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物与菌株

4 周龄雄性小鼠C57，体质量（15±1）g，购自上海市计划生育科学研究所实验动物经营部。产Enterocin Y3 粪肠球菌DH9003（E.faecalis DH9003）、指示菌单增李斯特菌LFM2813（Lis.monocytogenes LFM2813），保存于中国水产科学研究院东海水产研究所。

1.2 培养基与试剂耗材

鼠用配合饲料，上海新辉动物饲料有限公司；灌胃针（8 号，45 mm），中科恒天科技有限公司；氯化钠、甲醛、无水乙醇、二甲苯、中性树胶，国药集团化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.2）；脑心浸液培养基（Brain heart infusion，BHI），美国BD 公司；HE 染液套装，Servicebio 公司。

1.3 仪器与设备

立式灭菌锅YXQ-LS-50SII，上海博讯实业有限公司医疗器械厂；恒温培养箱HH.B11.500-BS-Ⅱ，上海跃进医疗器械机械厂；高速离心机TG16WS，长沙湘智离心机仪器有限公司；Lecia 倒置光学显微镜、包埋机JB-P、冻台JB-L5，武汉俊杰电子有限公司；病理切片机RM2016，上海徕卡仪器有限公司；脱水机Donatello、染色机Giotto，DIAPATH 公司；组织摊片机KD-P，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司；烤箱GFL-230，天津市莱玻璃仪器设备有限公司；载玻片G6004，Servicebio公司。

1.4 试验方法

1.4.1 菌株培养 将2%接种量的粪肠球菌DH9003 接种于BHI 液体培养基中，30 ℃有氧条件下培养14 h 后4 ℃离心2 min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2～3 次，将菌体重悬到无菌生理盐水中，采用平板计数法[8]调整其浓度为109CFU/mL，即灌胃液，4 ℃保存备用。

1.4.2 小鼠的饲养及灌胃 取雄性C57 小鼠15只，在动物房【温度（23±2）℃，相对湿度50%～60%，12 h 明暗交替照明】中适应性喂养7 d，期间进食和饮水自由。

适应性喂养1 周后，将小鼠随机分成空白对照组（HD 组，n=7）和粪肠球菌处理组（YD 组，n=8），其中粪肠球菌处理组每天按0.2 mL/10 g 体质量灌胃，空白对照组每天灌胃相应剂量的无菌生理盐水，每天1 次。实验共干预4 周，定期收集小鼠粪便并移至-80 ℃冻存，避免反复冻融。

1.4.3 小鼠粪便中细菌抑菌活性的测定及菌种鉴定 无菌条件下，分别取0，7，28 d 的小鼠粪便0.1 g 至灭菌的离心管中，加入0.9 mL 无菌生理盐水溶解，梯度稀释至10-4，10-5，10-6，10-7，10-8。分别将每个梯度样品涂布于BHI 固体培养基中，30 ℃过夜培养后，以单增李斯特菌（Lis.monocytogenes LFM2813）为指示菌，将指示菌以2%的接种量接种于5 mL BHI 软琼脂中，充分混匀，均匀倾倒于BHI 固体培养基中，待其凝固后，30 ℃条件下过夜培养，观察结果。

随机挑取每个梯度中有抑菌活性的单菌落，接种于BHI 液体培养基中，30 ℃过夜培养。参考杨珍珠等[7]的方法对有抑菌活性的细菌进行DNA提取、PCR 扩增及菌种鉴定。

1.4.4 组织切片分析 饲养实验结束后，对小鼠进行颈椎脱臼处死（所有小鼠处死前一晚禁食12 h）。解剖后获取小鼠的肝脏和肠道，剪取适宜大小的新鲜肝脏和小肠组织，用无菌生理盐水清洗后置于甲醛固定液（V甲醛∶VPBS=1∶9）中固定，参考Sadeghipour 等[9]的方法进行修剪、脱水、包埋、切片，采用苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin staining，HE）染色并封片，于光学显微镜下观察肝脏和肠道组织结构。

1.4.5 小鼠粪便肠道菌群的测定 分别收集实验开始的第0，7 天和28 天的空白对照和粪肠球菌DH9003 处理组的小鼠粪便，将其贮存于-80 ℃冰箱，在干冰保存条件下送至上海派森诺生物科技有限公司进行16S rDNA 基因组高通量测序。具体方法：采用DNA 提取试剂盒提取样本基因组DNA，使用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA 纯度和浓度。待样本DNA 质量满足建库测序要求后，取适量样品用超纯水稀释至20 ng/μL 进行扩增。以提取的细菌基因组DNA 为模板，使用高保真DNA 聚合酶和带标签序列的特殊引物F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3' 和R：5'-GGAC TACHVGGGTWTCTAAT-3' 对细菌DNA 的16S V3-V4 区域进行PCR 扩增。采用2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的准确性，回收并纯化PCR扩增产物。采用Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒定量分析，构建Miseq 文库。采用Illumina NovaseqPE250 平台测序。

1.4.6 生物信息学分析 根据序列质量对高通量测序的原始下机数据进行初筛，对问题样本进行重测和补测。通过质量初筛的原始序列按照标签序列信息进行文库和样本划分，并去除标签序列。按照Caporaso 等[10]的方法用QIIME2 dada2 平台分析数据。

1.4.7 小鼠代谢能力的测定 小鼠代谢能力采用Kinross 等[11]的方法测定。实验结果中差异性代谢物分析采用具有监督的正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）模型从数据集中筛选出与分组相关的差异脂类物质，以变量权重值（Variable importance for the projection，VIP）＞1 和P ＜0.05为差异代谢物筛选标准，采用KEGG 数据库对代谢通路进行注释，获得差异代谢物参与的代谢通路。

1.4.8 数据处理 利用SPSS 25 软件进行单因素方差分析并通过Duncan 法进行差异显著性分析（P＜0.05 表示差异显著）。每个处理组进行6 次生物学重复，结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 小鼠粪便的抑菌活性及菌株鉴定结果

采用平板计数法统计各组小鼠粪便中对单增李斯特菌有抑菌活性的细菌菌落总数。由图1 可见，空白对照（HD）组小鼠在灌胃0，7 d 和28 d 时的粪便中有抑菌活性的菌落总数保持稳定，菌落总数范围3.0×106～5.0×106CFU/g，而粪肠球菌DH9003 处理（YD）组的小鼠粪便中有抑菌活性的细菌菌落总数在0～7 d 大幅增长，在7～28 d 增长缓慢并趋近稳定，表明小鼠在灌胃粪肠球菌DH9003 后，该细菌在小鼠肠道中大量定植，然后随着灌胃时间的延长，肠道中DH9003 的数量缓慢增加并逐渐趋于稳定。

图1 灌胃不同时间的小鼠粪便中有抑菌活性的细菌菌落总数Fig. 1 TVC of faces isolates with antimicrobial activity during intragastric administration period

从不同梯度涂布的平板中随机挑取10 株细菌，发现它们对单增李斯特菌均有抑菌活性。对照组小鼠粪便中未发现有抑制单增李斯特菌的菌株。经鉴定所有细菌均为粪肠球菌。这间接说明粪肠球菌DH9003 已大量定植在小鼠肠道，且属于优势菌株。

2.2 小鼠肝脏、肠道切片观察结果

肠道是生物体吸收营养物质和阻挡有害组织的主要器官，同时也是机体最大的免疫器官，约70%的免疫细胞和免疫球蛋白都集中于此[12]。肠道是否正常是评价机体健康状况的标准之一[13]。图2a 和2b 分别为空白对照组和粪肠球菌处理组的小鼠肠道切片的显微镜图，结果显示两组小鼠的肠道上皮细胞均排列紧密，结构较为完整，肠腺上皮细胞与基底膜紧密结合，肠绒毛完整，未见明显异常。值得注意的是，粪肠球菌DH9003 处理组的小鼠肠绒毛相对于空白对照组排列更为密集且肠绒毛的长度增加，这表明粪肠球菌DH9003 对小鼠的肠道未产生负面影响，同时会对小鼠肠黏膜屏障有一定的改善作用。

图2 小鼠组织切片观察结果Fig. 2 Observation results of mice tissue sections

肝脏健康是机体其它脏器健康的基础，具有分解潜在有害物质，调节稳定的内部环境的重要作用[14]。评估小鼠肝脏的组织病理学变化能有效判定粪肠球菌DH9003 是否会对机体产生不利影响。图2c 和2d 分别为空白对照组和处理组小鼠的肝脏切片显微镜观察图，结果发现空白对照组和粪肠球菌处理组的小鼠肝组织均结构均匀，未产生病变，说明DH9003 未对小鼠肝脏产生有害影响。

2.3 粪肠球菌DH9003 对小鼠肠道菌群物种多样性的影响

2.3.1 Alpha 多样性分析 稀疏曲线是Alpha 多样性中一个重要指数，不仅用于评估微生物组测序量或样本量的饱和情况，而且可用来比较不同数量样本的物种丰富度[15]。图3 为空白对照组（HD）和粪肠球菌处理组（YD）测序的稀疏曲线。当样本测序深度增加到一定量时，曲线斜率平滑，变化较小，说明该样本量设置合理。随着测序深度的增加，YD 的物种丰富度整体低于HD 的物种丰富度，这可能是因为短时间内高剂量粪肠球菌DH9003 持续进入肠道中，在肠道中定植并成为相对优势菌群，对其它菌种产生抑制，从而导致其物种丰富度降低。这与刘石等[16]报道的添加复合益生菌导致物种丰富度低于对照组的结果一致。

2.3.2 Beta 多样性分析 由NMDS 分析可观察到生物学组内相似性及组间的差异性是否明显[17]。如图4 所示，每个点代表1 个样本，不同颜色代表不同分组。两个样品间距离越近，说明样品中微生物群落差异越小，反之说明样品间微生物群落组成结构差异越大。本研究中空白对照组和DH9003处理组的样本距离近，而灌胃后的样本距离远，说明实验有效。同时，随着灌胃时间的延长，样本的距离变远，说明灌胃粪肠球菌DH9003 对小鼠肠道菌群分布有一定影响，需进一步分析。

表1 部分差异代谢物统计表Table 1 Partial different metabolite statistics

图4 Beta 多样性分析Fig. 4 Analysis on Beta diversity

2.3.3 物种组成分析 图5 是不同处理组不同时间的小鼠粪便中微生物群落门水平的相对丰度。拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）为小鼠粪便中的优势菌门，2 个细菌门的相对丰度总量达在93%以上，说明外源益生菌的补充对小鼠肠道的菌群结构有一定的调节作用，然而不能改变主要的优势菌群，这与陆文伟等[18]的研究结果一致。同时，DH9003 处理组在门水平上的差异主要表现在拟杆菌门和厚壁菌门的变化，这与Vemuri 等[19]研究结果相似。空白对照组中，0，7 d和28 d 厚壁菌门的相对丰度分别为37.13%，51.67%和41.86%。DH9003 处理组中，0，7 d 和28 d 厚壁菌门的相对丰度分别为40.17%，47.43%和63.58%。由此可见，空白对照组中，厚壁菌门的相对丰度随饲养时间的延长先增加后减少，说明新的环境可能会影响小鼠肠道菌群中厚壁菌门相对丰度的变化，当适应一段时间后，肠道菌群中厚壁菌门的相对丰度又减少并恢复到稳定水平。粪肠球菌DH9003 处理组中，厚壁菌门的相对丰度随着粪肠球菌灌胃时间的延长而不断增加，说明摄入DH9003 后其在小鼠肠道中定植，并随灌胃时间的延长逐步成为肠道的优势菌群。

图5 门水平上不同处理组不同时间的小鼠粪便中微生物菌群相对丰度Fig. 5 Relative abundance of microbial communities in feces of mice at different time points in different treatment groups at the phylum level

2.3.4 物种差异分析与标志物种 LefSe（LDA Effect Size）分析是一种差异分析方法，可以直接对所有分类水平同时进行差异分析，寻找分组之间稳健的差异物种，在微生物宏基因组分析领域获得广泛的应用[20]。图6 为粪肠球菌DH9003 处理组小鼠的物种分类学分支图。在粪肠球菌DH9003处理组中，肠球菌属（Enterococcus spp.）是主要的差异物种。综合小鼠粪便中活性菌株的鉴定结果，推断摄入粪肠球菌DH9003 对小鼠肠道菌群的丰度和多样性有潜在的影响。

图6 粪肠球菌DH9003（YD）处理组的物种分类学分支Fig. 6 The branch of taxonomy of species of E.faecalis DH9003（YD）treatment group

2.4 粪肠球菌DH9003 对小鼠代谢的影响

2.4.1 代谢组学数据质控 图7 为质控样本（QC）的总离子流图重叠谱图（TIC）。QC 样本总离子流图的基线稳定，各色谱峰的相应强度和保留时间基本重叠，说明试验过程中由仪器引起的变异较小，重复性好，所采集的样品数据可进行差异分析。

图7 QC 样本总离子流图重叠谱图Fig. 7 Total ion current overlapped chromatograms of quality control samples

2.4.2 正交偏最小二乘判别分析 为判别处理组0 d 和28 d 之间是否有差异，采用OPLA-DA 分析方法对两组进行分析。图8 为处理组0 d 和28 d的OPLS-DA 得分图和置换检验图。结果表明：每组的样品能较好地聚成一类，两组间有明显的区分，说明试验重复性较好。同时，在正离子模式下，R2X=0.601，R2Y=1，Q2=0.99，负离子模式下，R2X=0.761，R2Y=0.999，Q2=0.996，这表明模型稳定可靠。为避免监督模型在建模过程中发生过拟合，本试验采用置换检验对模型进行逆行检验以保证模型的有效性。随着置换保留度逐渐降低，随机模型的R2和Q2逐渐下降，说明原模型不存在过拟合现象，模型稳健性良好。

图8 YD_0 VS YD_28 OPLS-DA 得分图和置换检验图Fig. 8 OPLS-DA score and permutation test chart of YD_0 VS YD_28

2.4.3 差异代谢物的筛选 采用OPLS-DA VIP>1 和P<0.05 为显著性差异代谢物筛选标准，初步筛选处理组0 d 和28 d 的差异代谢物，共检出差异代谢物254 种，其中124 种显著上调，130 种显著下调。表1 为粪肠球菌DH9003 处理后小鼠粪便种的部分的差异代谢物。

2.4.4 差异代谢KEGG 通路分析 KEGG 富集分析是以KEGG 通路为单位，以该物种或亲缘关系较近的物种所参与的代谢通路为背景，通过Fisher精确检验（Fisher's exact test）分析计算各通路代谢物富集的显著性水平，从而确定受到显著影响的代谢和信号转导途径[21]。图9 为显著性最高的前20 条的差异表达代谢物KEGG 富集通路图。显著性水平较高的代谢通路有ABC 转运蛋白和蛋白消化吸收通路，包含的差异代谢物数量分别是31 个和12 个。

图9 差异表达代谢物KEGG 富集通路图Fig. 9 KEGG enriched pathway of differentially expressed metabolites

图10 为ABC 运输通路的代谢物热图和蛋白消化吸收通路的代谢物热图。通过颜色变化反映每种代谢物的变化程度，红色表示显著上调，蓝色表示显著下调，颜色深浅反应上、下调程度。综合图10 结果发现，D-谷氨酰胺、L-亮氨酸、天冬氨酸、苯酚、谷氨酸、L-天冬氨酸在两组代谢变化中都呈现显著上调的结果。相应的，两组结果中丙酸、丙氨酸、丁酸、脯氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸呈显著下调现象。

图10 ABC 运输通路（a）和蛋白消化吸收通路（b）的代谢物热图Fig. 10 Metabolite thermograms of ABC transport pathway（a）and protein digestive absorption pathway（b）

3 结论

用产细菌素Enterocin Y3 粪肠球菌灌胃健康C57 小鼠28 d，研究该菌株在小鼠体内的定植、病理学以及对小鼠肠道菌群和代谢能力的影响。小鼠粪便中细菌抑菌活性测定结果表明灌胃后0～7 d，DH9003 在小鼠体内大量定植，在7～28 d，粪肠球菌DH9003 数量缓慢增加并趋于稳定。肠道、肝脏组织切片观察表明：摄入粪肠球菌DH9003 使小鼠的肠黏膜更为密集且长度增加，对小鼠肠黏膜有一定的改善作用，且未对肝脏产生有害影响和损伤。微生物多样性分析结果说明补充粪肠球菌DH9003 能在一定程度上调节小鼠的肠道菌群结构，在门水平上的差异变化主要是拟杆菌门和厚壁菌门的改变。物种组成分析结果表明，空白对照组中，0，7 d 和28 d 厚壁菌门的相对丰度分别为37.13%，51.67%和41.86%，厚壁菌门的相对丰度随饲养时间的延长先增加后减少，说明新环境可能刺激小鼠肠道菌群中厚壁菌门相对丰度的变化，而当适应一段时间后，肠道菌群中厚壁菌门的相对丰度减少并恢复到稳定水平。粪肠球菌DH9003 处理组中，0，7 d 和28 d 厚壁菌门的相对丰度分别为40.17%，47.43%和63.58%，厚壁菌门的相对丰度随粪肠球菌灌胃时间的延长而不断增加，说明摄入粪肠球菌DH9003 后其在小鼠肠道中定植，并随灌胃时间的延长逐步成为肠道的优势菌群。LEfSe 分析结果表明肠球菌属（Enterococcus sp.）是主要的差异物种，说明粪肠球菌DH9003 的摄入对小鼠肠道菌群的丰度和多样性有潜在影响。代谢组学结果表明，灌胃粪肠球菌DH9003 前和灌胃28 d 后，共检出254 种差异代谢物，其中124 种显著上调，130 种显著下调。基于KEGG 通路富集分析发现显著性水平较高的代谢通路有ABC 转运蛋白和蛋白消化吸收通路。上述结果说明该菌株安全无害且对宿主的肠道菌群结构和代谢能力有一定的调节作用，研究结果为益生菌资源的利用提供了技术支持。