微小RNA-125a-5p对人鼻咽癌细胞增殖的影响及机制

万芳竹，张浩炯，张宗璞

1 上海市质子重离子医院放疗科 复旦大学附属肿瘤医院放疗科，上海 201321；2 上海市放射肿瘤学重点实验室；3 上海质子重离子放射治疗工程技术研究中心；4 复旦大学附属华山医院神经外科

鼻咽癌（NPC）是原发于鼻咽部的一类恶性肿瘤，好发于亚洲东部及南非，我国两广地区高发［1-2］。早期NPC对放疗较为敏感，随着疾病进展，化疗及手术等手段也纳入治疗策略。虽然NPC的治疗手段不断发展，但由于NPC细胞有着较高的增殖能力，仍有部分患者在放疗后出现局部复发［3］，进而导致治疗失败。微小RNA（miR）是一类小的非编码RNA，其在多种恶性肿瘤中发挥关键作用［4-5］。miR-125a 位于11、19、21 号染色体上，并与多种肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移密切相关［6］。研究表明miR-125a 与NPC 化疗敏感性相关［7］。含PDZ 结合基序的转录共激活因子（TAZ）是Hippo通路中的关键分子，可调控组织稳态［8］。TAZ 表达失调与肿瘤发生、发展相关，其过表达可促进肿瘤细胞增殖［9］。miR-125a 可直接调控TAZ 表达，从而影响乳腺癌细胞增殖和存活［10］。而二者在NPC 细胞中的调控关系及其对细胞增殖能力的影响尚不明确。2022 年8 月—2023 年6 月，本研究探讨miR-125a 及其潜在下游靶点TAZ 在NPC细胞中的作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人鼻咽癌细胞系（HK-1细胞）及人胚肾细胞永生化细胞系（293T 细胞）均储存于上海市质子重离子临床技术研发中心实验室。CCK-8 试剂盒、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒均购于碧云天生物技术公司；转染所需质粒均由上海吉玛制药技术有限公司提供；TAZ 抗体、GAPDH 抗体购于英国Abcam 公司。B76707 流式细胞仪购于美国Cytoflex 公司，TOUCH 凝胶电泳成像系统购于美国Bio-Rad 公司，Cytation 3 酶标仪购于美国Cytation 公司，定量PCR仪购于美国QuantaStudio公司。

1.2 细胞培养 HK-1 细胞及293T 细胞均用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基进行培养，培养基中添加100 U/mL 青霉素及100 mg/mL 链霉素。培养箱温度37 ℃，CO2含量5%。待细胞达到可传代密度（80%～90%）时，用0.25%胰蛋白酶液消化细胞，以1∶3比例传代。

1.3 细胞转染及分组 待HK-1 细胞生长状况良好，将细胞接种于六孔板中，取部分细胞并随机分为对照1 组、过表达miR-125a 组（转染miR-125a mimics）、沉默miR-125a 组（转染miR-125a inhibitor）；另取部分细胞随机分为对照2 组、miR-125a 过表达组（转染miR-125a mimics）及回补组（转染miR-125a mimics 同时过表达TAZ）。依据说明书所示步骤用Lipofectamine ™3000 试剂进行转染，48 h 后检测miR-125a表达验证转染效率。

1.4 miR-125a-5p、TAZ mRNA检测 采用RT-qPCR法。用TRIzol 试剂提取细胞总RNA，用分光光度计检测RNA 浓度。用逆转录试剂盒，以总RNA 为模板反转录获得cDNA 后，进行RT-qPCR 检测。反应体系共25 μL：cDNA 模板2 μL，2×SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ 12.4 μL，上下游引物各1 μL，无酶水8.5 μL。反应条件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 40 s、60 ℃ 1 min共35个循环。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。miR-125a-5p 上游引物5'-GGTCATTCCCTGAGACCCTTTAAC-3'，下游引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；TAZ 上游引物5'-ACCCACCCACGATGACCCCA-3'，下游引物5'-GCACCCTAACCCCAGGCCAC-3'；miR-125a-5p的对照U6上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-AACGCTTCACGATTTGCGT-3'；TAZ 的对照GAPDH 上游引物5'-GGAGCCAAAAGGGTCATCAT-3'，下游引物5'-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3'。用2-ΔΔCt法计算目标基因相对表达量。

1.5 TAZ 蛋白检测 采用Western blotting 法。将各组细胞培养至对数生长期，用RIPA 试剂将细胞裂解，用BCA 法评估蛋白浓度。加入上样缓冲液并将蛋白于100 ℃下变性10 min。各组蛋白上样于SDS PAGE 凝胶，电泳后，再将凝胶附于PVDF膜上进行转膜。封闭液封闭1 h，将膜置于TAZ 一抗（1∶1 000）4 ℃下过夜。将膜洗涤，置于二抗中室温孵育1.5 h。用增强化学发光法来观察蛋白条带。通过ImageJ 软件分析蛋白条带的强度并加以量化统计。

1.6 细胞增殖能力检测 CCK-8实验：将细胞接种于96孔板中，调整为每孔3×103个细胞，并培养过夜使其贴壁生长。之后每孔加入CCK-8 溶液10 μg/mL，并将96 孔板放入培养箱，37 °C 温度下避光孵育1 h。用酶标仪检测450 nm 波长处的吸光度值（OD450值）。集落形成实验：将每组细胞消化为细胞悬液，接种于六孔板中，每孔细胞调整为1 000 个。将各组细胞培养约14 d，镜下观察细胞状态，确保所形成集落包含50 个以上细胞。PBS 洗涤各孔3 次，用4%多聚甲醛进行固定，用0.1%结晶紫染色细胞，对每个孔中的细胞集落进行拍照并计数。

1.7 miR-125a 与TAZ 的靶向关系分析 通过预测网站TargetScan（http：//www. targetscan. org/）和miRDB（http：//mirdb.org/）预测miR-125a 与TAZ 的结合位点。采用双荧光素酶报告基因实验进一步验证，pGL3-TAZ 和pGL3-mutTAZ 报告基因载体质粒均由Bio-Asia公司（中国）建立。将293T细胞随机分为4 组：WT+miR-ctrl 组共转染TAZ 野生型（TAZWT）和miR-125a 空载对照（miR-ctrl）、Mut+miR-ctrl组共转染TAZ 突变型（TAZ-MUT）和miR-ctrl、WT+miR-125a 组共转染TAZ-WT 和miR-125a 模仿物（miR-125a）、Mut+miR-125a 组共转染TAZ-MUT 和miR-125a，转染48 h 后，用细胞裂解液将细胞分解，用荧光素酶检测试剂盒检测报告蛋白的活性。

1.8 统计学方法 采用GraphPad Prism7.00 软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析或双因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染效率 对照1组、过表达miR-125a组、沉默miR-125a 组miR-125a 的相对表达量分别为1.00 ±0.15、1.61 ± 0.11、0.68 ± 0.16，各组比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。

2.2 miR-125a对细胞增殖能力的影响 各组转染后第2、3、4、5、6天细胞增殖活力比较差异均有统计学意义（P均＜0.05），见表1。对照1 组、过表达miR-125a组、沉默miR-125a 组集落形成数分别为（108.00 ±11.14）、（73.33 ± 12.34）、（266.67 ± 36.50）个，各组比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。

表1 各组不同时间的增殖活力（± s）

表1 各组不同时间的增殖活力（± s）

组别对照1组过表达miR-125a组沉默miR-125a组OD450值转染后第1天0.19 ± 0.02 0.19 ± 0.02 0.19 ± 0.03转染后第2天0.33 ± 0.02 0.31 ± 0.03 0.40 ± 0.03转染后第3天0.54 ± 0.06 0.41 ± 0.06 0.78 ± 0.11转染后第4天0.87 ± 0.05 0.63 ± 0.06 0.99 ± 0.07转染后第5天1.11 ± 0.02 0.80 ± 0.08 1.25 ± 0.10转染后第6天1.28 ± 0.04 1.03 ± 0.07 1.44 ± 0.05

2.3 miR-125a 下游靶点预测结果用靶点预测网站预测miR-125a的下游靶点之一为TAZ。对照1组、过表达miR-125a组、沉默miR-125a组TAZ蛋白相对表达量分别为0.80 ± 0.05、0.48 ± 0.07、1.23 ±0.11，各组比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。

通过预测网站预测miR-125a 与TAZ 的结合位点，并设计突变型序列（TAZ-3'UTR MT），miR-125a与TAZ 的非编码区结合，miR-125a 的直接下游靶点为TAZ。见图1。双荧光素酶报告基因检测结果显示，WT+miR-ctrl 组、Mut+miR-ctrl 组、WT+miR-125a 组、Mut+miR-125a 组的相对荧光强度分别为1.00 ± 0.03、0.98 ± 0.03、0.56 ± 0.09、0.88 ±0.06。WT+miR-125a 组相对荧光强度低于WT+miR-ctrl 组、Mut+miR-ctrl 组（P均＜0.05），Mut+miR-125a 组相对荧光强度与WT+miR-ctrl 组、Mut+miRctrl 组比较差异无统计学意义（P均＞0.05）。

图1 miR-125a与TAZ结合位点及突变型序列

各组细胞转染后第2、3、4、5、6 天细胞增殖活力比较差异均有统计学意义（P均＜0.05），见表2。对照2 组、miR-125a mimics 组、miR-125a mimics+TAZ组集落形成数分别为（140.33 ± 19.13）、（72.33 ±10.01）、（140.33 ± 19.13）个，各组比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。

表2 各组不同时间的增殖活力（± s）

表2 各组不同时间的增殖活力（± s）

组别对照2组miR-125a mimics组miR-125a mimics+TAZ组OD450值转染后第1天0.20 ± 0.02 0.21 ± 0.02 0.20 ± 0.03转染后第2天0.33 ± 0.05 0.32 ± 0.03 0.33 ± 0.02转染后第3天0.58 ± 0.02 0.43 ± 0.02 0.57 ± 0.05转染后第4天0.88 ± 0.04 0.55 ± 0.03 0.80 ± 0.03转染后第5天1.05 ± 0.07 0.77 ± 0.02 0.89 ± 0.03转染后第6天1.25 ± 0.06 0.97 ± 0.06 1.16 ± 0.04

3 讨论

探究导致NPC 增殖的分子机制，对制定新的治疗策略、延长患者生存时间有重要意义。研究表明，miR 参与调控多种肿瘤的发生、发展［11-12］。LIRUSSI等［13］发现，在雌激素受体阳性的乳腺癌中，微小RNA let-7b-5p 和促癌分子单链选择性单功能尿嘧啶DNA 糖基化酶1（SMUG1）形成抑制性调节环路，降低SMUG1的表达水平，从而发挥抑制乳腺癌发展的作用。LI 等［14］发现，miR-34c 与NPC 患者预后相关，其可通过抑制受体酪氨酸激酶，减弱NPC 细胞的增殖、侵袭、迁移能力。

miR-125a 在头颈鳞癌等肿瘤中被证实为抑癌基因［15］。在肝细胞癌中，miR-125a 抑制肿瘤坏死因子受体相关因子6 的表达，发挥抑制肿瘤生长的作用；而长链非编码RNA PDIA3P1 通过竞争性结合miR-125a 从而减弱了miR-125a 对肝细胞癌的抑制作用，进而导致肿瘤的化疗耐药［16］。本研究发现，miR-125a 低表达后，NPC 细胞增殖能力有了较为显著的提升。这说明在NPC 中miR-125a 发挥抑癌作用。

本研究结果显示，过表达miR-125a 后Hippo 信号通路关键分子TAZ 表达降低，敲低miR-125a 则促进TAZ 高表达，符合二者结合的表达趋势，因此预测miR-125a 的潜在下游靶点为TAZ；双荧光素酶报告基因实验发现，miR-125a 可与TAZ 序列的3'UTR区域结合，证明TAZ 是miR-125a 的靶基因。Hippo通路是一条进化上保守的信号通路，参与调节细胞的形态、增殖和迁移，一旦该通路的表达失衡，便会引起细胞增殖能力改变，导致肿瘤的发生、发展［17］。TAZ 通常在肿瘤中表达较高，参与肿瘤细胞的增殖和抗凋亡过程［18］。在NPC 中，爱泼斯坦-巴尔病毒可使TAZ 异常活化，并促进肿瘤细胞的生长和迁移［19］，但尚未有文献证明miR-125a 可负调控TAZ 从而抑制NPC 细胞增殖。本研究通过体外实验证明，miR-125a 可抑制TAZ 的表达，从而减弱TAZ 对NPC增殖的促进作用。同时过表达miR-125a 及TAZ 时，miR-125a 的抑癌作用有较大程度的减弱，说明TAZ是miR-125a 有效的下游靶点，miR-125a 对细胞生长的抑制作用很大程度是通过降低TAZ 的表达实现的。这验证了miR-125a-TAZ 通路的存在，该通路对NPC细胞的增殖能力有调控作用。miR-125a对TAZ乃至Hippo 通路的调控对NPC 的治疗有重要临床意义，可通过小分子药物等手段恢复NPC 中miR-125a的表达或抑制TAZ 过度活化，从而达到抑制肿瘤生长的目的。然而目前仍有部分问题亟待解答，如miR-125a 对Hippo 信号通路中的其他分子是否有调控作用等，对于这些问题可以后续进一步探究。

综上所述，miR-125a 可通过下游靶点TAZ 抑制NPC细胞的增殖，其具体作用机制还需进一步挖掘，以期对NPC的诊断和治疗提供依据。