AGPS 在神经胶质瘤细胞中的相互作用蛋白及作用模式

刘颖，马英，朱彧

1 天津市环湖医院检验科，天津 300350；2 天津医科大学药学院；3 天津市第三中心医院检验科

神经胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤［1］。烷基甘油酮磷酸合酶（AGPS）是醚酯合成的关键酶，AGPS 将酰基甘油-3-磷酸转化为烷基甘油-3-磷酸，这是生成所有醚类脂质的必要步骤［2］。肿瘤细胞以不同于正常细胞的方式代谢脂质，肿瘤中醚类脂质的含量高于正常组织，并且在高侵袭性肿瘤中醚脂表达水平增高，对肿瘤细胞的致病性具有至关重要的作用［3］。研究显示，沉默AGPS表达能够降低神经胶质瘤细胞侵袭性，说明AGPS 对于维持肿瘤细胞形态和致病特性具有重要意义［4-5］。但是，AGPS的相互作用蛋白尚未见报道。2020年1月—2022 年12 月，本研究通过免疫共沉淀（Co-IP）技术和质谱技术确认AGPS 的相互作用蛋白，并推测二者结合位点，为今后AGPS机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 神经胶质瘤细胞（U251 细胞）购自中国医学科学院基础医学研究所。慢病毒空载体和AGPS shRNA 慢病毒、AGPS、HNRNPK 抗体、驴抗鼠IgG 二抗、驴抗兔IgG 二抗购自美国Santa Cruz 公司，胎牛血清和DMEM 培养基购自美国Corning公司，放射免疫沉淀法裂解缓冲液、Protein A 琼脂糖珠购自碧云天生物技术有限公司，EASY-nLC 1000 高效液相色谱和Q-Exactive 质谱分析仪购自美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 细胞培养 以含有10%胎牛血清的DMEM 培养基37 ℃、5% CO2孵箱培养细胞，待细胞基本融合成片后，经0.25%胰酶消化后进行传代。

1.3 慢病毒感染及稳定细胞系筛选 慢病毒感染前1 d，将细胞接种于6孔板中（2×105/孔），过夜后更换含20%聚凝胺的DMEM 培养基。将细胞随机分为对照组、shR-AGPS-1组、shR-AGPS-2组，分别加入阴性对照慢病毒和不同沉默水平的AGPS shRNA 慢病毒，24 h 后更换为不含聚凝胺的DMEM 完全培养液，37 ℃继续培养72 h。加嘌呤霉素（1 μg/mL），每3天换1次筛选液继续进行筛选，稀释单细胞悬浮液获得单克隆AGPS沉默细胞系，37 ℃、5% CO2条件下培养72 h，进行后续实验。

1.4 AGPS 蛋白检测 采用Western blotting 法。将细胞裂解后提取总蛋白，将蛋白样品通过8%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，转至PVDF 膜，置于5%脱脂牛奶，室温封闭2 h，分别置于含AGPS 抗体和IgG 的5%脱脂牛奶中，4 ℃摇动，过夜。将膜置于TBST 溶液中，摇动漂洗5 min，共4次，于含HRP-二抗的5%脱脂牛奶中室温孵育1.5 h。将膜置于TBST 溶液中漂洗，将膜置于Western LightningTMChemiluminescence Reagent 显色剂中30 s 后进行成像化处理，通过ImageJ 软件测算AGPS蛋白相对表达量。

1.5 AGPS相互作用蛋白筛选

1.5.1 Co-IP实验 通过Co-IP实验制备抗原-蛋白复合物，特异性富集AGPS 蛋白。将各组细胞刮下，加入预冷的放射免疫沉淀法裂解缓冲液，4 ℃，缓慢晃动15 min，14 000 g 离心15 min（半径15 cm），Protein A 琼脂糖珠（100 μL/mL 总蛋白），4 ℃摇动10 min，14 000 g 离心15 min（半径15 cm），去除Protein A 珠子。将总蛋白稀释至1 μg/μL。分别将兔抗AGPS 抗体和兔抗IgG 各6 μg 加入500 μL 总蛋白中，4 ℃孵育过夜，加入100 μL Protein A 琼脂糖珠，4 ℃孵育过夜，14 000 g 离心15 min（半径15 cm），去上清液，用预冷的放射免疫沉淀法裂解缓冲液洗涤，经缓冲液重悬后煮5 min，保存上清液。

1.5.2 银染实验 通过银染实验检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。将Co-IP 实验获取的上清液经8% SDS-PAGE 分离蛋白，电泳结束后，将凝胶浸泡在固定液（乙醇∶冰醋酸∶水=30∶10∶60）中12 h 固定蛋白。加入30%的乙醇摇动30 min 后弃乙醇，并重复1次；将凝胶在去离子水摇动10 min，并重复2次。加入0.1%硝酸银溶液摇动30 min，弃硝酸银溶液，用去离子水漂洗凝胶，加入新鲜显影液（2.5%碳酸钠、0.02%甲醛的水溶液），待出现蛋白质的染色条带，用1%乙酸终止反应。胶上出现相对分子质量不同于AGPS 蛋白的其他蛋白，切胶后送质谱检测，筛选可能与AGPS相互作用的蛋白。

1.5.3 质谱实验 将上述银染胶中其他蛋白切成1 mm3小块，200 μL 水洗2 次，每次10 min，加考染脱色液200 μL 超声脱色15 min，重复3 次，至脱色完全。加乙腈100 μL 脱水至胶粒变白，真空抽干10 min，加10 mmol/L 二硫苏糖醇（25 mmol/L 碳酸氢铵溶解）200 μL，37 ℃水浴1 h，冷至室温，吸干，快速加50 mmol/L 吲哚乙酸（25 mmol/L 碳酸氢铵溶解）200 μL，置于暗室45 min，依次用25 mmol/L 碳酸氢铵（2 次）、25 mmol/L 碳酸氢铵+50%乙腈（2次）、乙腈（1 次）洗涤，每次10 min。乙腈脱水后将0.1 μg/μL 胰蛋白酶酶液用25 mmol/L 碳酸氢铵稀释，4 ℃放置30 min，加25 mmol/L碳酸氢铵至总体积600 μL，37 ℃过夜，离心收集酶解上清液，真空超干，进行液相（EASY -nLC 1000 System Thermo）和质谱分析（Q-Exactive，Thermo）。用Proteome Discoverer1.4软件鉴定质谱结果，银染胶中获得蛋白信息。

1.6 同源模建 用同源模建技术构建HNRNPK 蛋白的三维立体结构。按照文献［6］的方法进行同源模建和蛋白间模拟对接。用Discovery studio v3.5中的“Build Homology Models”模块以人源HNRNPK 氨基酸（UniProt ID：P61978）为目标序列作为模板构建HNRNPK 的3D 结构，经MODELER 构建目标序列的3D 结构。应用GROMACS v4.5.5 软件包和GROMOS 43a1 力场对最优HNRNPK 模型进行分子动力学研究，采用PME 法计算长程静电势，进行分子动力学模拟，使用Ramachandran plot 和Profile-3D 对优化后的结构进行评估。

1.7 蛋白间模拟对接 使用Discovery Studio v3.5中“prepare protein”对HNRNPK 和AGPS（UniProt ID：O00116）进行结构优化，用ZDOCK 模块预测HNRNPK 与AGPS 的复合物结构。设置旋转采样的配体方向欧拉角度步长设定为6，“RMSD Cutoff”设定为6.0，“Interface Cutoff”设定为9.0，“Maximum Number of Clusters”为60，结合模式“Top Poses”设定为2 000，进行计算，选出RMSD＜3Å的构象。分别应用“Analyze Protein Interface”“Calculate Electrostatics”模块和“Calculate Interaction Energy”模块计算HNRNPK 蛋白和AGPS 蛋白相互作用的关键氨基酸残基、静电相互作用和相互作用能，预测HNRNPK与AGPS蛋白间的结合位点。

1.8 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，两组比较采用t检验；多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AGPS 的沉默效率 对照组、shR-AGPS-1 组、shR-AGPS-2 组AGPS 相对表达量分别为1.00 ±0.23、0.57 ± 0.05、0.23 ± 0.04。与对照组比较，shR-AGPS-1 组、shR-AGPS-2 组AGPS 表达低（P均＜0.05），且shR-AGPS-1组AGPS表达低于shR-AGPS-2组（P＜0.05）。

2.2 AGPS 相互作用蛋白筛选结果将AGPS 抗体分别与U251 细胞系对照组和shR-AGPS-1/2 组进行免疫共沉淀。将免疫共沉淀复合物进行凝胶电泳和银染后，胶上出现相对分子质量不同于AGPS 蛋白的其他蛋白，55～70 kD 左右应为AGPS 蛋白条带，50、27 kD 处条带明显且比较均匀的条带可能为抗体重链、轻链，不作为选择条带。选择与AGPS 条带有区别并且其趋势与AGPS 沉默后趋势一致的蛋白条带，切胶后送质谱检测，筛选与AGPS 相互作用的蛋白。取免疫共沉淀样品进行质谱测试，180 kD 处筛选出72 个潜在蛋白。将筛选获得的数据进行整理，初步判断HNRNPK 为AGPS的靶蛋白。在AGPS抗体免疫共沉淀的细胞裂解物中可同时检测到AGPS 蛋白、HNRNPK 蛋白，表明AGPS 与HNRNPK可形成复合体，二者均在细胞核中表达。

2.3 同源模建结果 序列比对结果见图1，其序列一致性和相似性分别为35.5%、37.5%。应用Discovery studio v3.5 中的“Build Homology Models”模块，得到2 个HNRNPK 蛋白三维结构分别为Model 1、Model 2。模型的PDF Total Energy、DOPE Score 分数越低，模型质量越可靠，表明该模型在同源约束条件下优化的越好。根据以上原则选取Model 1 为最终模建结果。

图1 HNRPK蛋白序列与2JZX、1b25、1khm模板序列比对

选取100个构象对氨基酸结构的合理性进行Ramachandran plot评估，结果表明该同源模型有90.31%的氨基酸残基落在“最适区”，4.73%的氨基酸残基落在“一般允许区”，4.96%的氨基酸残基落在psi-phi构象不合理区域，说明构象已达到最优模型的标准，这一蛋白模型的骨架结构合理，见图2A。将上述得到HNRNPK蛋白的最优构象使用Profile-3D对氨基酸结构的合理性进行评估。模建结构的Verify Score 为164.8 分，高于Verify Expected Low Score（87.062 3分），并且与Verify Expected High Score（193.472分）接近，见图2B。说明其蛋白模型可信度较高，蛋白中氨基酸结构均合理，可以作为蛋白-蛋白对接的起始构型。

图2 HNRPK蛋白三维立体结构的同源模建

2.4 蛋白间模拟对接结果 应用ZDOCK 和RDOCK 方法得到HNRNPK 与AGPS 的模拟复合物结构。应用superimpose 程序将AGPS 蛋白与晶体库中已有蛋白的构象进行叠合，获取目标对象分析HNRNPK 蛋白与AGPS 蛋白结合界面处关键氨基酸残基的相互作用，预测HNRNPK 蛋白与AGPS 蛋白的结合位点。

HNRNPK-AGPS 复合物相互作用界面处共含有7 个氢键和2 个Pi 键相互作用来维持其三维结构的稳定。HNRNPK：Lys139：NZ 和AGPS：Phe559 的苯环形成Pi-Sigma相互作用；HNRNPK：Phe181的苯环和AGPS：Lys147：NZ 形成Pi-Cation 相互作用。结合界面处有四对氨基酸残基（GLY83：HN-ASN139：OD1，CYS185：HG-LYS147：O，CYS184：SG-ALA148：HN，LYS219：O-SER589：HG）间的氢键键长均小于2.7Å，属于短强氢键，是稳定HNRNPK-AGPS 复合物结构的主要作用力。HNRNPK-AGPS 复合物疏水性氨基酸残基的分布图显示，HNRNPK 蛋白中氨基酸残基表现出了疏水性质，使两蛋白间形成了较强的疏水界面。静电相互作用分析显示，HNRNPK 的氨基酸残基形成的正电势区域和AGPS 的氨基酸残基形成的负电势区域形成静电互补，HNRNPK 的氨基酸残基形成的负电势区域和AGPS 的氨基酸残基形成的正电势区域形成静电互补。

计算结果显示HNRNPK蛋白和AGPS蛋白的总相互作用能为-54.559 3 kCal/mol，其中范德华作用能和静电作用能分别为-17.706 1、-42.047 2 kCal/mol，静电作用能大于范德华作用能，说明静电作用是促使复合物结构形成的主要驱动力，之间的相互作用能对HNRNPK-AGPS复合物活性区域结构的稳定起重要作用。

3 讨论

神经胶质瘤细胞浸润到正常脑组织，可破坏正常脑组织功能，早期可表现为局限性癫痫等刺激症状，后期则表现为瘫痪等神经功能缺失症状，是神经胶质瘤恶化的标志以及治疗失败和死亡的主要原因。异常表达的脂质可通过参与肿瘤细胞构成以及信号转导过程，调控一系列功能基因异常开启和（或）关闭，使得肿瘤细胞获得不同于正常细胞的多种特性，诱导细胞癌变以及肿瘤恶性增殖、侵袭和凋亡抵抗等［7-8］。

AGPS 失活可降低肿瘤细胞中醚脂、前列腺素和酰基磷脂等对肿瘤细胞生长和扩散至关重要的多种脂质表达，同时降低癌症致病性，而AGPS 过表达则可增加多种肿瘤细胞（乳腺癌231MFP 细胞、黑素瘤C8161 细胞、前列腺癌PC3 细胞及原发性乳腺癌细胞等）的生存和运动能力，促进肿瘤的生长和侵袭［9-11］。因此，AGPS 可能是潜在的神经胶质瘤诊断和治疗靶点。本课题组之前研究也表明，沉默AGPS 表达可抑制神经胶质瘤细胞体外增殖和侵袭，因此在此研究中继续深入研究AGPS的靶蛋白。

本研究选取神经胶质瘤U251 细胞，通过Co-IP和质谱技术确定了AGPS 可直接作用于HNRNPK。HNRNPK 是一种癌基因，在多种肿瘤中异常表达。其与肿瘤增殖和脂质代谢密切相关，沉默其表达可降低肿瘤的恶性程度［12-14］。

分析HNRNPK 蛋白与AGPS 蛋白的结合方式及相互作用的氨基酸残基，可为后续研究HNRNPK 蛋白与AGPS 的相互作用奠定了基础。本实验采用同源建模技术构建了HNRNPK 蛋白的三维结构，得到了模型1 和模型2 的两种构象。其中模型1 的PDF总能量和DOPE 得分较低，说明模型质量可靠，可以作为最终的建模结构。由于得到的模型结构在空间上可能不合理，本文采用分子动力学方法对其进行了优化，提取了100个构象，用Ramachandran图对氨基酸结构的合理性进行了评价。得到了HNRNPK蛋白的最佳构象，90.31%的氨基酸残基落在“最佳区”。进一步利用Profile-3D 对氨基酸结构的合理性进行评价，结果表明蛋白质模型可信度高，蛋白质中氨基酸结构合理，可以作为蛋白质-蛋白质对接的起始构型。ZDOCK 和RDOCK 方法被用来模拟两种蛋白质之间的相互作用。根据Eèu DOCK 得分排名，Pose1 得分最低，可能是最接近真实构象的对接构象。将Pose1 中AGPS 蛋白的构象与晶体库中蛋白质的构象叠加后，RMSD 值小于1Å，表明其构象接近真实结构的构象。通过分析氢键相互作用、共轭相互作用、疏水相互作用、静电相互作用和相互作用能，发现静电相互作用能明显大于范德华相互作用能。HNRNPK-AGPS 复合物的结合模式和相互作用的氨基酸残基预计位于HNRPK 的结合界面（Gly83、Lys139、Thr177、Phe181、Cys184、Cys185、Lys219）以及AGPS 的结合界面（ASN139、LYS147、ALA148、SER149、PHE559、SER589）。其中，4 对氨基酸残基（GLY83：HN-ASN139：OD1、CYS185：HG-LYS147：O、CYS184：SG-ALA148：HN、LYS219：O-SER589：HG）氢键长度均小于2.7Å，为短而强的氢键，对维持蛋白质三维结构的稳定性非常重要。HNRNPK苯环上的Lys139和AGPS的Phe559形成了西格玛π 键，HNRNPK 苯环上的Phe181 和AGPS：Lys147形成阳离子π键，维持了HNRPK和AGPS相互作用的稳定性。HNRPK蛋白与AGPS蛋白的疏水比为45.53%，表明两者之间形成了一个强疏水界面。

以上分析揭示了HNRPK蛋白和AGPS蛋白的结合方式和相互作用的氨基酸残基，HNRNPK-AGPS复合物具有明显的正负互补电位。可见这些氨基酸之间的相互作用主要是氢键和共轭作用。