多频复合超声真空煮制对卤牛肉肌纤维结构及保水性的影响

蔡华珍，戴泓宇，陈建功，陆楷懿，冯腾迅，周 頔，陈 杨

（滁州学院生物与食品工程学院，安徽 滁州 239000）

卤牛肉是大众喜爱的传统肉制品，目前普遍采用传统常压热加工制作，卤煮环节多采用夹层锅中温（99～100 ℃）卤制，但卤制后肉质容易发柴，卤制中蒸汽等排放对环境不友好、能耗增加[1]。超声波处理作为一种绿色非热加工技术，具有工艺简单、效率高、绿色节能环保等优点，广泛应用于食品加工、食品改性、食品分析等方面[2-3]。在肉制品加工中，功率超声波能够破坏肌纤维蛋白结构，改善其功能特性[2]，在肉类嫩化、腌制、烹饪等方面发挥作用[4]。功率超声波与其他技术联合具有良好的协同增效作用，超声波（40 kHz）与氯化钙联合处理牛肉，超声作用可促进肌纤维中钙离子向肌纤维内部运动，使得钙激活酶亚基发生更大程度的降解，导致肌纤维骨架蛋白结构降解，从而使牛肉显著嫩化[5]；研究表明，超声（28 kHz）协同真空卤煮牛肉可降低蛋白质二级结构中α-螺旋含量，增加β-折叠含量，并出现了19.84%的无规卷曲，而单独超声卤煮组、真空卤煮组则未见无规卷曲结构[6]。此外，超声处理能够改变肉中水分分布，有利于提高产品品质和产品得率[7]。

单频超声易形成驻波，存在声场分布不均等问题，多频复合超声具有多频率、多层次、多方向等特点，可消除驻波，使辐射能量更加均匀，产生的空化效应、剪切效应、微扰作用等显著强于单频超声，因此其化学产额高于甚至远高于单频超声[8-9]。早在20世纪90年代，冯若等[8]研究发现，28 kHz与0.87 MHz的双频正交辐照系统的空化产额远大于两个单频超声辐照产额之和，多频复合超声在食品加工等领域应用具有显著优势，这种优势在后来的研究中均得到证实[10-12]。真空低温热加工具有改善食品品质、减少营养素损失、安全环保等优势[13-15]，多频超声协同真空煮制牛肉技术鲜见报道，本研究基于多频超声波及真空的特点，探讨其对卤牛肉肌纤维结构及保水性的影响，以期为酱卤肉制品的工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷冻牛腱子肉购自安徽徽食食品有限公司；食盐、味精、冰糖、料酒、酱油等调味料，八角、桂皮等香辛料均购自当地农贸市场。

氯化钾、氯化镁、盐酸、氯化钠 国药集团化学试剂有限公司；磷酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠天津市科密欧化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt-2Na，EDTA-2Na）西陇化工股份有限公司；偏磷酸、戊二醛 上海麦克林生化科技股份有限公司；氢氧化钠、硫酸铜 南京化学试剂股份有限公司。所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

智能超声真空煮制锅 滁州学院动物性食品绿色加工团队自行设计开发；ME55/02分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TA.XT-plus物性仪 英国Stable Micro Systems公司；Chirascan圆二色光谱仪英国Applied Photophysics公司；UV-27001紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；JSM-6510LV扫描电子显微镜日本电子株式会社；NMI20-015V低场核磁共振仪上海纽迈电子科技有限公司；H3-20KR台式高速冷冻离心机 湖南可成仪器设备有限公司；MIX-2500迷你混合仪 杭州佑宁仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制作

工艺流程：牛腱子肉→解冻→清洗→切块→超声真空低温卤制→卤牛肉样品。

选取冷冻牛腱子肉于密封袋中，自来水浸泡解冻至－5～－3 ℃，将牛肉切成约20 mm×20 mm×20 mm块状，用流水清洗表面血水，取组织结构相似的肉块作为原料，每块质量约40 g，将处理好的牛肉块与含盐量为2.5%、温度约18 ℃的卤汤按肉液比1∶5（m/m）先后加入智能超声真空煮制锅中制备卤牛肉。

超声真空煮制锅结构：圆柱形锅体（10 L），在圆柱形侧面上区域排布频率为40/52/68 kHz振子，各频率振子分别占120°弧面区域，相同频率振子竖向并联排布在一起；各频率超声波最大功率1200 W，大小可调，设备超声波总功率3600 W；采用底部加热；锅盖上安装有温度探头，抽真空装置，以及冷凝液回流装置。锅盖开关、超声波频率与功率、温度、真空度等控制采用PLC自动控制。

真空煮制时，自动开盖，加入待煮制牛肉和卤汤，设置好各参数，自动关闭锅盖启动运行，至煮制结束。

1.3.2 卤煮实验设计

卤煮参数设置：真空度－0.043 MPa，卤煮温度85 ℃，升温速率4.75 ℃/min，超声波总功率900 W，其中三频、二频的功率比分别为1∶1∶1和1∶1，超声频率分组：三频复合超声组（40/52/68 kHz）、双频复合超声组（40/52、40/68、52/68 kHz），以单频超声组（40、52、68 kHz）和未超声真空组（0 kHz）为对照，复合超声是指2 种或2 种以上频率同时工作的模式（复合超声组合的个数，简称复合超声频数或复合频数）。超声真空卤煮为3 个连续阶段：室温真空超声10 min；85 ℃真空煮制90 min；85 ℃超声真空10 min，获得卤牛肉样品，冷却至室温，取样测定卤牛肉的肌原纤维小片化指数（myofibril fragmentation index，MFI）、蛋白质二级结构、微观结构、质构、水分分布以及蒸煮损失率与出品率，研究多频复合超声辅助真空煮制对卤牛肉肌纤维结构及保水性的影响。

1.3.3 MFI测定

采用文献[16]方法略作修改。取1 g处理后的牛肉加入20 mL 4 ℃的预冷缓冲液（0.1 mol KCl、0.02 mol/L K3PO4、0.001 mol/L MgCl2、0.001 mol/L EDTA，pH 7.1），匀浆2 次，每次15 s，中间间隔10 s。然后以1000 r/min离心15 min，去上清液，重悬，离心4 次。之后再将沉淀重悬，用双缩脲法测定蛋白质量浓度，稀释至0.5 mg/mL，在540 nm波长处测定吸光度。MFI为该吸光度乘以200。

1.3.4 蛋白质二级结构测定

参考申辉[17]方法并略作修改，采用圆二色光谱分析卤牛肉肌原纤维蛋白二级结构。提取肌原纤维蛋白后，用溶剂将提取的蛋白质溶液稀释至0.1 mg/mL，取200 μL稀释后的蛋白溶液加入石英比色皿（1 mm）中，使用圆二色光谱仪在（24±1）℃条件下扫描，扫描波长范围190～240 nm，扫描速率为5 nm/min。每个样品扫描3 次，结果为3 次扫描的平均值并扣除相应溶剂背景。在获得圆二色光谱后，利用二级结构分析软件CNDD对数据进行分析，计算各条件下肌原纤维蛋白二级结构的相对含量。

1.3.5 微观结构观察

采用文献[1]方法并略作修改。在距卤牛肉表面2～3 mm处切取约8 mm×4 mm×2 mm大小的肉块，在4 ℃用体积分数2.5%戊二醛溶液浸泡24 h。然后用0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 7.3）清洗3 次，每次10 min，在27 ℃环境中放置2 h后用蒸馏水冲洗，再分别使用体积分数25%、50%、70%、96%的乙醇溶液及无水乙醇梯度脱水2 次（乙醇溶液每次15 min、无水乙醇每次1 h），再冷冻干燥备用。

电镜扫描：将冻干卤牛肉块用导电胶带粘到样品处理台上，抽真空、喷金后，于扫描电子显微镜上进行扫描。扫描条件：工作电压20 kV，工作距离13 mm，放大200 倍。

1.3.6 质构特性测定

参考文献[18]方法并略作修改，将加工后的卤牛肉，切成10 mm×10 mm×10 mm的正方体小块，采用探头P/36R、测前速率1.00 mm/s、测中速率4.00 mm/s、测试后速率4.00 mm/s、测试间隔时间5 s、压缩比30%进行测定。

1.3.7 水分分布的测定

采用文献[19]方法，样品横向弛豫时间（T2）测定：剔除样品表面筋腱，使其结构尽量一致，称取20 g样品放入直径25 mm的核磁管中进行检测，测试条件：共振频率23.315 MHz，磁体温度32 ℃，90°脉冲时间22 μs，180°脉冲时间40 μs，采样点数149494，重复扫描次数32，回波数5000，回波时间0.31 ms，使用核磁共振分析软件及CPMG序列采集牛肉样品T2信号，反演后，对所有数据进行归一化处理。T2分布曲线纵坐标信号强度除以相应样品质量得到归一化T2分布曲线。

1.3.8 蒸煮损失率测定

采用文献[6]方法并略作修改，初始牛肉块质量记为m1/g，卤煮过程中的质量变化记为Δm，卤煮后的卤牛肉质量记为m2/g，通过下式计算质量变化率：

1.4 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 多频复合超声辅助真空煮制对牛肉MFI的影响

MFI是表征肌原纤维断裂程度的参数，是衡量肉类嫩度的重要指标之一[20]。如图1所示，各处理组MFI大小为三频＞双频＞单频＞未超声组，不同复合频数间的MFI差异显著（P＜0.05）。在双频超声处理组中，双频之和较低的MFI（40/68 kHz）显著高于双频之和较高的MFI（52/68 kHz）（P＜0.05）；在单频超声处理组中，随着频率增加，MFI呈下降趋势，其中40 kHz与68 kHz之间差异显著（P＜0.05）。结果表明，超声处理能显著破坏牛肉肌纤维结构，随着复合频数的增加，频率复合效应愈加显著，其破坏程度亦愈大。随着复合频数的增加，超声声场分布更加均匀、无空化死角，频率复合的叠加效应增强了空化效应和机械作用，更能引起牛肉蛋白质结构的变化[21-22]，因而三频复合超声的MFI最大；这与Feng Ruo等[23]的研究结果一致。李倩[24]比较不同频率超声波对淀粉结构的影响发现，随着复合频数的增加，超声产生的空化事件越来越多；单频超声时，随着超声波频率的增大，空化阈值随频率的增大而增大，空化事件减少[25-26]，因而随着超声频率的增加对肌纤维的破坏减小，MFI相应减小。

图1 多频复合超声辅助真空煮制卤牛肉的MFIFig.1 Effect of multifrequency ultrasound-assisted vacuum cooking on MFI of stewed marinated beef

2.2 多频复合超声辅助真空煮制对牛肉蛋白质二级结构的影响

蛋白质二级结构是多肽链通过氢键沿一定方向盘旋、折叠而形成有规则的重复构象，包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲结构[27]。由图2可知，各处理组牛肉肌原纤维蛋白质在波长208 nm和222 nm附近有两个强负吸收峰，这是α-螺旋结构的特征吸收峰[28-29]，该特征吸收峰峰形随着超声波频数的增加渐趋平缓。

图2 多频复合超声辅助真空煮制卤牛肉的蛋白质二级结构Fig.2 Effect of multifrequency ultrasound-assisted vacuum cooking on secondary structures of protein in stewed marinated beef

利用软件进一步定量分析，由表1可知，随着复合超声频数的增加，α-螺旋、β-折叠含量均呈下降趋势，其含量排序为未超声组＞单频＞双频＞三频，而β-转角、无规卷曲含量的趋势则相反，其中，三频组与双频组比较，除了β-转角含量差异不显著外，其他二级结构含量均差异显著（P＜0.05）；在三频组与单频组间，除了β-转角含量差异显著外（P＜0.05），其他二级结构含量的差异均达极显著水平（P＜0.01）；三频组与未超声对照组相比差异尤其凸显，三频组的α-螺旋含量只有未超声对照组的39.3%，β-折叠含量约是未超声对照组的38.7%，同时，三频组的β-转角、无规卷曲含量大幅上升，分别是未超声对照组的1.76、3.28 倍。结果表明，超声处理能减弱/破坏维持α-螺旋、β-折叠结构稳定的氢键，并转变为β-转角和无规卷曲，使肌原纤维蛋白结构从有序逐渐转向无序[30-31]，多频率复合加剧了空化效应、机械振动，产生了大量气泡，真空下静压力下降，降低了空化阈值，加剧气泡内爆，从而增加了空化效应和机械作用的强度，加强了对肌纤维蛋白结构的破坏[25]，因此，多频复合超声处理组的α-螺旋、β-折叠结构含量远低于真空未超声对照组，而无规卷曲和β-转角含量则大大增加。

表1 多频复合超声真空煮制卤牛肉的二级结构含量Table 1 Effect of multifrequency ultrasound-assisted vacuum cooking on contents of protein secondary structures in stewed marinated beef

2.3 多频复合超声辅助真空煮制对牛肉微观结构的影响

由图3可见，未超声对照组肌纤维排列紧密而规整，而所有超声组的肌纤维均出现裂缝，并且随着复合频数的增加，肌纤维表面结缔组织附属物逐渐减少甚至消失、光洁度增加，肌纤维出现分离、断裂现象，尤其是三频超声组，肌纤维断裂明显。这种现象的出现是超声作用的结果，且频率效应显著，由于肌纤维被结缔组织包围成肌束聚集在一起[32]，超声真空煮制过程中，超声的空化效应、机械效应、微扰效应、湍动效应等[9,33]均会加快传热、传质[1]，加快结缔组织分解[34]，这与邹云鹤[35]的研究结果一致，复合超声频数的增加加速了这种进程。

图3 多频复合超声真空煮制卤牛肉的微观结构Fig.3 Effect of multifrequency ultrasound-assisted vacuum cooking on microstructure of stewed marinated beef

2.4 多频复合超声辅助真空煮制对牛肉质构特性的影响

如表2所示，超声波处理对卤牛肉质构特性有很大影响，随着复合超声频数的增加，其硬度、咀嚼性、内聚性随之降低，不同复合频数的硬度、咀嚼性、内聚性大小排序均为三频＜双频＜单频＜未超声组，其中多频组的硬度、咀嚼性大幅下降，三频组的硬度、咀嚼性降幅最大，分别降为双频组的87%、65.8%，单频组的61.7%、52%，只有未超声对照组的40.7%、40.3%；内聚性虽然也呈降低趋势，但总体降幅不明显，各组间仅多频组的降幅与未超声对照组间差异显著（P＜0.05），这些结果说明，多频超声比单频超声产生的机械作用更强烈，对蛋白质的影响更大[22-24]，使其刚性结构减弱，因而卤牛肉硬度大幅度降低，MFI以及二级结构的研究结果也证实了这点，但是由于多频复合超声引起蛋白质与水结合力的增强，抵消了部分机械作用引起的蛋白纤维结合力减弱，因而其内聚性虽然降低，但降幅不大。弹性随复合频数的增加有增大趋势，总体增幅不大，但三频组（40/52/68 kHz）、双频（40/52 kHz）组与未超声对照组间均有显著差异（P＜0.05），其他各组间差异不显著（P＞0.05）。超声对蛋白质结构的破坏，使更多的亲水基团暴露到蛋白质表面，增加了蛋白质与水的相互作用[36]，此外，肌纤维的破坏增加了肉与水的结合几率，因而弹性增加[20,35]。

2.5 多频复合超声辅助真空煮制对牛肉保水性的影响

2.5.1 水分分布

肉中水分的存在状态与产品品质、出品率有关。肉中水分以自由水、不易流动水（准结合水）、结合水3 种状态存在[32]，水分子的不同存在状态可以通过低场核磁的弛豫时间T2反映。一般肉中与T2对应水分3 种存在状态为结合水（T210～1 ms）、不易流动水（T221～100 ms）、自由水（T23＞100 ms），P21、P22、P23是与T2对应3 种不同状态水分含量的峰面积[19]。图4为多频复合超声与对照组的弛豫时间。由表3可见，超声处理对卤牛肉的T2影响显著，与未超声对照相比，各超声处理组的T2均比未超声处理组短，且均向左迁移。其中，三频超声处理组向左迁移幅度最大，双频超声处理组次之，单频超声处理组左迁最少，结果表明，超声处理增加了肉与水的结合力，这与高飞[6]研究结果一致，这种变化存在显著的频率效应，复合超声频数越多效应越显著，肉与水的结合越紧密。

图4 多频复合超声真空煮制卤牛肉水分的T2分布Fig.4 Effect of multifrequency ultrasound-assisted vacuum cooking on distribution of T2 of water in stewed marinated beef

由表4可知，多频复合超声处理使卤牛肉水分重新分布，随着超声复合频数的增加，结合水峰面积P21以及自由水峰面积P23逐渐增大，其峰面积大小为三频＞双频＞单频＞未超声组；对结合水来说，各超声处理组与未超声组间峰面积均有显著差异（P＜0.05）。其中，三频复合超声组与双频组间差异显著（P＜0.05），与单频组及未超声组间差异极显著（P＜0.01），三频复合超声组的P21是未超声组的2.41 倍；对自由水来说，多频组与未超声对照组间均有显著差异，尤其是三频复合超声组，其峰面积是未超声对照组的4.1 倍。准结合水峰面积P22的趋势则相反，随着超声复合频数的增加，峰面积呈下降趋势；多频组峰面积最小，与单频组间差异显著（P＜0.05），与未超声组间差异极显著（P＜0.01），多频组中三频P22最小。高飞[6]在研究超声真空煮制时也发现，超声真空卤煮增加了峰面积P23，P22相应减小。分析认为，可能两次间隔多频复合超声处理产生了强烈的空化效应与机械效应，导致肌原纤维小片化以及二级结构的改变较大，增加了蛋白质分子与水分子间相互作用的几率[21,23,25]，使得准结合水向结合水迁移，这种迁移具有明显的频率效应，结合水含量随着复合超声频数的增加而增加，不易流动水含量则随之减少。又因为在一定真空条件下，两次间隔超声处理导致肌纤维间隙进一步增大，且频率效应显著，肌纤维间隙随着复合频数的增加而增大、小片化增多，因而被纵横交织的小片化肌纤维包围的自由水随复合频数的增加而增加。另外，卤煮好后破真空的反向压力在一定程度上对肉中水分的保持起稳定或巩固作用；由于低温卤制，未超声组肌纤维结构完整，因而滞留的自由水相对较少，这与卤牛肉微观结构的扫描电镜分析结果一致。

表4 多频复合超声真空煮制卤牛肉不同状态水分的峰面积Table 4 Effect of multifrequency ultrasound-assisted vacuum cooking on peak area of water at different states in stewed marinated beef

2.5.2 蒸煮损失率与出品率

蒸煮损失率反映肌肉的保水性，蒸煮损失率越低，保水性越好。表5结果显示，多频超声蒸煮损失率最小，损失由大到小顺序为未超声组＞单频＞双频＞三频，其中三频组蒸煮损失率显著低于双频组和单频组（P＜0.05），极显著低于未超声组（P＜0.01）；多频组出品率均显著高于未超声对照组（P＜0.05），三频复合超声组的出品率最高，显著高于双频组和单频组（P＜0.05），极显著高于未超声对照组（P＜0.01）。这种变化与肌原纤维小片化的结果相对应，此外，多频复合超声水分分布的结果也从侧面证实了保水性的频率效应。

表5 多频复合超声处理对卤牛肉出品率和蒸煮损失率的影响Table 5 Effect of multifrequency ultrasound-assisted treatment on yield and cooking loss of stewed marinated beef

3 结论

多频复合超声处理对卤牛肉肌纤维结构和保水性影响显著。具体表现为随着复合超声频数的增加，MFI、β-转角与无规卷曲结构含量均升高，α-螺旋、β-折叠结构含量则降低；复合频数越多，肌纤维表面结缔组织附属物溶解越多，肌纤维分离、断裂越明显，三频超声组纤维断裂最显著。卤牛肉的硬度、咀嚼性、内聚性随着复合频数的增加而降低，多频组的硬度、咀嚼性大幅下降，三频组的降幅最大，而弹性随复合频数的增加而增大。在保水性上，各超声处理组的T2均比未超声处理组缩短，且均向左迁移，其中，三频处理组向左迁移幅度最大，双频次之，单频左迁最少；此外，多频超声处理使得准结合水向结合水迁移，复合频数越多准结合水迁移越多，结合水和自由水含量越多。相应地，在蒸煮损失率和出品率方面，三频组蒸煮损失率显著低于双频组和单频组，出品率的趋势则相反，三频复合超声组的出品率最高。因此，多频超声处理能显著破坏卤牛肉肌纤维结构，增加肉与水的结合力，降低卤牛肉的硬度、咀嚼性、内聚性，增加弹性，提高肉制品的保水性和出品率，这种变化具有明显的频率效应，复合频数越多，频率效应越显著。