食源性致病菌快速检测技术及其标准化应用研究进展

吴 鹏，孙雅和，朱旭丽，周树华, ，张成云

（1.浙江省标准化研究院，金砖国家标准化（浙江）研究中心，之江标准化智库，国家市场监管数字化研究与应用技术创新中心，浙江杭州 310007；2.文成县食品药品综合检测中心，浙江温州 325399）

近年来，随着“健康中国2030”国家战略的有效推进以及全民健康意识的提升，食品安全得到了前所未有的重视。然而，调查数据显示，2011～2020 年，全国共上报食源性疾病暴发事件35806 起，累计患病人数266968 人，其中由微生物引起的食源性疾病相关患病人数占比最多，高达35.69%，我国食品微生物安全形势依然严峻[1]。食源性致病菌（foodborne pathogen）是指以食物为载体引起人类发生疾病的一类细菌微生物，主要有大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌等。因不同地域和饮食特征的差异，我国最常见且对公众健康产生的影响也较大的食源性致病菌主要包含金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌和克罗诺杆菌（阪崎肠杆菌）等5 种。因此，开发出快速、灵敏、简便、特异的食源性致病菌检测技术并进行标准化应用推广已成为控制食品安全问题的关键。

食源性致病菌的传统检测方法虽然较为成熟稳定，但一般主要依据致病菌形态学、生理学和生态学等特征经过菌种分离培养、生化鉴定等检测步骤来实现定性定量，存在检测周期长、灵敏度不高、操作繁琐、耗费成本较高和一定概率的假阴性等缺点[2]，很难满足企业生产加工、基层市场监管执法、公共卫生安全和海关进出口检验检疫等方面应对突发食品安全事件的需求。近年来，随着生物技术在食品安全领域的快速应用，食源性致病菌快速检测技术也获得了很大的发展。本文主要对目前常用的生理生化检测技术、免疫学检测技术、分子检测技术等3 种食源性致病菌快速检测技术及其标准化应用进行了研究分析，以期对我国食品微生物安全检测领域的技术发展提供借鉴，同时为该领域的标准制定和实施应用提供理论参考。

1 食源性致病菌快速检测技术的分类

1.1 生理生化检测技术

生理生化检测技术是指通过研究微生物代谢过程中产生的分子和特异物质等生物化学变化特征，从而间接得到微生物量化结果。目前应用较多的主要有以下几种。

1.1.1 ATP 生物发光法 ATP 生物发光法是指通过ATP 与荧光素-荧光素酶结合发生化学反应所形成的荧光信号来测定三磷酸腺苷（ATP）含量的一种快速便捷的生物化学方法。ATP 是细胞内特殊的自由能载体，普遍存在于所有生物活细胞内并在一定条件下保持含量稳定，因此通过ATP 在样品中的浓度可推算活菌数。ATP 生物发光法本质上是将化学能通过生理生化反应转化为光能，利用ATP 浓度与荧光强度呈正相关从而定量其浓度，通过即时反馈和定量有机污染，ATP 生物发光可以成为食品企业使用的有效监测工具[3-4]。该法在食品中微生物尤其是大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等致病菌的测定中应用非常广泛。Tang 等[5]对比大肠菌群纸法（标准方法）和ATP 生物发光法在食堂卫生监督中评价厨具卫生状况的有效性，该研究对河北省6 家食堂的厨具采用整群随机抽样，通过大肠菌纸试验和ATP 生物发光试验对样品进行评估，结果显示大肠菌纸法和ATP 生物发光法检测厨具的阴性检出率分别为64.39%和49.07%，两种方法的Kappa 系数为0.549，表明两种方法得出的结果比较一致，说明ATP检测法有利于餐饮单位卫生监督现场快速检测。Cao 等[6]研究开发了一种便携式ATP 生物发光传感器，该传感器对大肠杆菌O157:H7 菌株具有高特异性，利用噬菌体的高特异性和简单的信号双扩增策略，在菌株水平上实现了对活菌的识别，具有较高的灵敏度，其便携式信号读出器使其适合现场检测，在最佳条件下，该方法的检测范围为102～107CFU/mL，30 min 内的最低检出限为30 CFU/mL，结果表明该方法与平板计数法无差异，但检测时间大大缩短，且该方法为活体大肠杆菌的即时检测（POCT）提供了新的途径，有望推广到其他具有相应噬菌体的毒力菌株的检测中。Jaeho 等[7]利用ATP 生物发光通过空气中颗粒物（PM）来确定细菌种群，设计并构建了圆盘式撞击器，以切断大于1、2.5 和10 μm 的气溶胶，以收集采样拭子上的PM1、PM2.5 和PM10，确定了相对光单位（RLU）与菌落形成单位（CFU）之间的相关性。ATP 生物发光法也存在一定不足，比如检测限较高，易受酶的种类、游离性ATP 和不同盐类等影响，结果稳定性不足，影响其推广应用，目前主要在水体检测和环境监测等领域应用[8]。

1.1.2 电阻抗技术 电阻抗技术是指利用培养基中不同微生物代谢活动的差异，通过电阻抗测量来检测微生物的技术。致病微生物通过生理代谢活动使培养基营养底物由电惰性变为电活性，从而增大其电导性、降低电阻抗。因此，利用致病微生物代谢活性的差异所引起的阻抗值改变与培养基中微生物含量在一定时间内呈正比的原理，可以定量表征微生物。近年来，随着生理生化代谢技术的发展，电阻抗技术在食源性微生物的鉴定检测方面获得了较大的进展。Kargupta 等[9]提出了一种通过使用微通道电阻抗谱（m-EIS）来实时检测细胞暴露于杀伤剂后的死亡情况从而快速实现检测致病菌，m-EIS 的原理为当具有非零膜电位的活细胞暴露于高频交流电场时，诱导电荷会在膜界面积聚，细胞死亡伴随着膜电位的丧失，因此电荷存储（电容）也随之丧失。张志伟[10]利用电阻抗技术对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌、活酵母和灭活酵母等细菌进行检测分析，结果表明该方法获得较好的细菌区分效果，相比于传统方法时间更短、操作更简单。利用该技术测定大肠杆菌、沙门氏菌和霉菌等食品安全领域微生物含量已经被美国分析化学家协会（AOAC）正式接收，具备快速、敏感、特异性高和重复性好等优点。

1.1.3 微量生化法 微量生化法主要应用于肠杆菌科等指标性的食源性致病菌种的检测，包括放射测量法、微热量技法等类型。放射测量法是指通过对微生物代谢所需的碳水化合物进行微量放射性标记，从而以生长代谢过程中菌种的二氧化碳浓度来定量分析致病菌含量。而微热量技法则是通过微生物代谢过程中产生的热效应进行微生物定量检测分析的技术[11]。其主要原理为：通过微量热计实时监测微生物生长过程中的热量变化值与时间延迟的关系来制作热曲线图，再与标准曲线进行比对分析来定性致病菌，其核心关键在于建立完善的标准数据库[12]。微量生化法具有效率高、准确性强和可重复性等特点，是一项快速准确且较复杂的微生物检测技术，目前已经有效应用于酵母菌、乳酸菌和大肠菌群等致病菌检测。Molendijk 等[13]研究评估了12 株金黄色葡萄球菌对噬菌体的敏感性，采用斑点试验、电镀效率（EOP）、光密度试验（均在培养基中）和人血清微热量技法4 项试验对10 株临床分离的金黄色葡萄球菌（其中5 株耐甲氧西林）进行比较，结果表明使用微热量技法测定的浓度更低、更灵敏，有助于快速提高检测灵敏性。Zhao 等[14]研究评估了商用微量生化检测试剂盒、MALDI-TOF MS 平台和自动rep-PCR DNA 识别技术在酵母菌检测中的性能，该研究收集了71 株临床重要的酵母菌，结果确定了28S nrDNA和ITS 测序的一致性，得到更高的检测精度。目前，利用微量生化法制备的重复性好、精密度高的标准化试剂盒已相继在市面上商业化应用，有效满足了快速检测技术市场需求，实现检测效率和结果可靠性的有效提升。与此同时，微量生化试剂盒检测技术虽然有效推进了传统检测方法的快速标准化应用，但在具体测试中仍需依赖人工进行加样和结果解读，自动化水平有待进一步提高。未来，该技术的试剂盒开发与应用将朝数字化、智能化方向不断发展。

总体来说，生理生化技术的优点在于灵敏快速，且特异性高、重复性好，多为无损检测，但也存在判定标准不统一、污染菌混淆以及与传统培养方法检测结果不完全一致等缺陷。随着微生物代谢组学的发展，生理生化技术的应用潜力很大，尤其是在全球性的公共食品安全问题上可发挥有效作用。

1.2 免疫学检测技术

免疫学检测技术主要是基于抗原与抗体结合反应的免疫学原理，通过敏感的标记、示踪技术对各种食源性致病菌的免疫学指标进行特异、超微量的分析检测来确定其含量，在食品微生物的快速检测中也应用非常广泛。其优点是灵敏度高、快速、成本较低且特异性高，目前主要瓶颈在于制备抗体前处理较为麻烦。主要有以下几类。

1.2.1 传统免疫学检测方法 传统的免疫学检测方法技术较为成熟，但操作步骤较为繁琐，用时较长。其中具有代表性的主要有乳胶凝集法、酶联免疫法、免疫荧光法以及免疫层析法等。

乳胶凝集法（latex agglutination，LAT）是指利用人工制造的乳胶颗粒对抗体进行标记，使其与待测抗原发生的凝集反应可被肉眼识别，从而实现目标病原微生物检测的方法[15]。Waldemar 等[16]采用乳胶凝集试验方法去筛选检测大肠杆菌血清群O157、O26、O104、O111 和O145，结果表明该方法具有灵敏、快速、易于操作和成本较低的优势，在只配备基本设备的小型流动实验室中即可进行，可用于筛选血清诊断引起溶血性尿毒综合征的肠出血性大肠埃希氏菌（VTEC）感染。Nordin 等[17]研究评价了Prolex Staph extra Latex 乳胶凝集试验方法在检测金黄色葡萄球菌中的效果，该方法采用Prolex 葡萄球菌超胶乳凝集试验、常规试管凝固酶和DNA 酶试验对初阳性外周血培养物进行检测，结果显示Prolex Staph extra Latex 乳胶凝集试验灵敏度为100%，特异度为91.7%。LAT 是一种适合在基层市场推广应用的快速、准确、简便且无需特殊仪器的方法。

酶联免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是通过加入酶标记抗体对表面吸附抗原的固相化载体进行免疫酶染色，发生显色反应后进行定量分析确定待测致病菌含量的方法。ELISA 在超低浓度分析物的定量分析中表现出了优异的性能和广泛的实用性，常用的有双抗体夹心法、竞争法和间接法。其中双抗体夹心法应用于食源性致病菌检测领域一般较多，其灵敏度较高[18]。Wu 等[19]针对鼠伤寒沙门氏菌研究开发了一种新型双抗体夹心检测法，其夹心结构为酶联抗体-适配体，应用于牛奶中该致病菌的检测，检测限值达到103CFU/mL。ELISA在金黄色葡萄球、产气荚膜梭菌以及大肠杆菌等致病菌检测中也应用较广泛。Zhao 等[20]通过制备单克隆抗体，采用双抗体夹心法检测金黄色葡萄球菌肠毒素B，其检测限值达到0.01 ng/mL，并且未产生交叉反应。目前市场上利用单克隆抗体和多克隆抗体检测食源性致病菌毒素的ELISA 检测试剂盒的商品化程度已经非常高，开发的试剂盒种类也非常多[21]。然而，传统的ELISA 需要较长的检测时间、检测步骤繁琐、效率较低且劳动强度大。Wang 等[22]提出了采用磁性纳米机器人（MNRs）作为可操作的免疫分析探针，促进自动化和高效的ELISA 分析的策略，称为纳米机器人启用ELISA（nR-ELISA）。测试结果表明，MNR-Ab1s 可以在微尺度上增强与目标分析物的结合效果，集成的nR-ELISA 系统可以显著缩短检测时间、减少人力投入，且通过对亥姆霍兹线圈磁场分布的模拟，验证了该方法的可扩展性，证明了利用现有策略构建高通量nR-ELISA 检测仪器的可行性。将磁性微/纳米机器人作为主动免疫分析探针，用于自动高效的酶联免疫吸附试验（ELISA），不仅在未来的即时检测（POCT）中具有巨大的潜力，而且将自推进微/纳米机器人的实际应用扩展到分析检测领域。ELISA 法具有标准化水平高、稳定性好、成本较低、特异性强和可批量检测等优点。但也存在试剂要求高、无法同时鉴定多种成分、可能发生一定交叉反应和假阴性等缺点。随着商品化和自动化仪器的普及和标准化应用，ELISA 将有很广阔的应用潜力和市场空间。

荧光免疫法（immunofluorescence technique，IFT）是指基于生物化学和免疫学原理，利用示踪荧光物质标记致病菌抗原抗体，通过显微镜观测其呈现的特异性荧光反应，从而实现目标致病菌检测的目的。IFT 可分为直接法和间接法，能够对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌以及单增李斯特菌等致病菌实现快速检测。Ozeh 等[23]利用该技术充分结合光电动力学定量分析大肠杆菌，结果表明检测限在4 h 内即达到104CFU/mL。该法需要的仪器设备简单，具有特异性强、时间短、限值低等优点，但也存在操作步骤较为复杂、非特异性染色和结果判定有一定主观性等问题[24]。

免疫层析法（immunochromatography assay，ICA）是基于横向流动免疫分析的一种免疫技术，在食源性的病原体、霉菌毒素和疾病检测领域得到了广泛的应用。该方法将待测液通过毛细管层析分离后，与预先标记过的抗原（抗体）着色试剂进行有效结合，产生的不同组分的特异性可视化显色反应（一般层析后2～10 min 内），从而实现对目标微生物的定性检测[25-26]。Li 等[27]研究了一种基于靶向在大肠杆菌K12 载体表面生长的信号策略，并成功地将其自组装在具有双测试线图案的增强ICA 上，用于黄曲霉毒素A（OTA）和黄曲霉毒素B1（AFB1）的检测，结果表明，两种真菌毒素的定量检出限均为0.01 ng/mL（提高了10 倍），OTA 和AFB1 的检出限分别为0.01～0.5 和0.01～0.2 ng/mL，与液相色谱-串联质谱（LCMS/MS）具有良好的相关性，证实了ICA 的高可靠性和适用性，该方法具有灵敏度提高、效率高、成本低等优点。该项研究可为多组分污染物的灵敏、同步、快速、现场监测提供重要的参考方法。免疫层析法对致病微生物实现快速简便检测，应用前景较佳。

1.2.2 现代免疫学检测方法 现代免疫学检测方法一般是指利用免疫反应的特异性充分结合现代传感技术的高灵敏性，从而实现对抗原、抗体反应有效监测的一类生物免疫传感器检测技术。其免疫传感器主要是通过将抗原与抗体反应所产生的参数变化转换为电子信号，从而实现目标菌的检测[28]。该技术与传统方法和ELISA 相比最大的优点是能够实时快速检测，具有高灵敏度、低成本和强特异性等优点，目前已被开发并应用于包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等在内的食源性微生物分析，其应用已涉及到食品工业、临床医学、环境监测与处理等各领域。主要包含电化学式免疫传感器和压电晶体免疫传感器等。

电化学式免疫传感器技术（electrochemical immunosensor）是指基于电化学的检测方法，将待测物在电极介质面上反应产生的化学信号转导为电信号从而实现检测目的的一种免疫传感器检测方法，已被用于识别和定量微生物[29]。电化学式免疫传感器是利用电化学转导技术实现高通量、实时在线检测致病菌的一种设备，分为电流型、电势型和电阻型等类型，其中电阻型主要用于细菌检测，另外两类则应用于病毒领域。电阻抗免疫传感器主要是基于测量样品与电极相关联时电特性的变化来检测食源性致病菌。Pérez-Fernández 等[30]针对黄曲霉致病菌研发了一种在丝网印刷碳电极上的电化学式免疫传感器，以检测黄曲霉致病菌毒素在开心果中的含量，该传感器经过优化后在0.01～2 μg/L 的线性范围内，重现性好（RSD：2%），在PBS 缓冲液和开心果基质中的检出限分别为0.017 μg/L 和0.066 μg/kg，具备简单、便宜、快速且具有与ELISA 和LC-MS/MS 相当的灵敏度，使该方法成为进行黄曲霉致病菌感染筛选的有效途径。Izadi 等[31]研发了一种DNA 纳米改性的电化学免疫传感器检测方法，其原理主要是通过增加电荷转移阻力利用传感器实时监测靶向DNA 序列，可在乳制品中特异地检测蜡状芽孢杆菌。

压电晶体免疫传感器（piezoelectric immunosensor）是根据压电效应产生的沉积质量与其频率响应之间的线性关系将化学信号或生物信号转化为电信号的一种传感器，可以无需标记物、灵敏高效地检测微量致病菌。压电晶体免疫传感器对微生物所产生的特定挥发性化合物气味感应较为灵敏，已成为确定食品污染较为成功的方法之一。压电晶体免疫传感器与其他传感器相比，具有快速便携、反应灵敏、无需标记样品且自动化程度高等优点。Ruchika等[32]利用自组装单层己二硫醇（HDT）、半胱胺和3D 纳米金（AuNPs）制备了无标记电化学石英晶体微天平（EQCM）免疫传感器，并将其用于花生中黄曲霉毒素B1（AFB1，食品霉菌毒素）的检测，检测AFB1的灵敏度为126 μA·ng-1～1 mL·cm-2，检出限为8 pg·mL-1。该项目新兴技术已在其他领域得到了广泛应用，在食源性致病菌检测领域也具备较好应用前景[33]。

1.3 分子检测技术

近年来，分子生物学的快速发展给食源性致病菌快速检测技术带来了重大变革，推动了过去局限于对致病菌形态学、生理学和生态学等常规的特征检验转变为从分子生物学水平开展研究，从而开发建立了众多的新型检测技术，取得了快速的应用进展。主要方法类型如下。

1.3.1 聚合酶链式反应 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术主要是基于DNA变性和复性原理，充分发挥DNA 聚合酶活性，结合相关引物和脱氧核糖核酸等共同作用，使模板DNA短时间内实现大量扩增从而达到检测目的的技术手段。在食源性致病菌快速检测中的应用比较广泛的主要为常规PCR 技术、多重PCR 技术、实时荧光PCR 技术和数字PCR 技术等。

常规PCR 技术是指通过一对特异性引物的应用并结合热稳定性较高的DNA 聚合酶对少量核酸样品进行循环温度作用实现扩增目的的一种体外扩增技术，其原理是针对特定致病菌的特定基因片段设计引物并扩增，从而检测扩增基因片段实现目的。该技术的循环反应过程包括高温变性、低温退火和适温延伸等步骤。Perdoncini 等[34]通过常规PCR、数字PCR 和实时PCR 技术定量检测家禽屠宰过程中不同阶段的耐热弯曲杆菌，结果表明3 种检测方法的群检阳性率基本一致。该技术主要特点表现为特异性强，灵敏度高，快速便携，标本纯度要求不高。

多重PCR 技术是指通过两对以上特异性引物同时进行核酸扩增的PCR 反应，其反应过程和基本原理均与常规PCR 相同，主要区别在于引物数量的不同。该技术可同时实现多种致病微生物的鉴定及某些致病微生物的分型鉴定，具备高效性、低成本和系统性等特点[35]。Lee 等[36]使用多重PCR 技术同时分析评估人工接种的沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌以及金黄色葡萄球菌等致病菌的检测效果时，检测限值在12 h 内能达到1 CFU/mL。Park 等[37]将基于薄膜的PCR 模块、电极模块和基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的手指驱动微流控模块集成在一起，建立了一个简单的集成无泵微流控芯片的单片机病原体分析系统，用于同时分析多个样品中的病原体，在膜室中采用热循环聚合酶链反应（PCR）法扩增食源性致病菌靶基因，并采用方波伏安法对扩增基因进行电化学定量，该研究中选择大肠杆菌O157:H7 作为靶菌，结果表明对该致病菌的检出限（LOD）达到了102CFU/mL。鉴于集成微流控芯片的显著特点，该传感平台可用于病原体筛选，在即时检测领域具有广阔的应用前景。

实时荧光PCR 技术是指在反应中添加荧光基团从而实现通过荧光信号实时监测PCR 反应进程，以达到定量分析的目的。该技术因其在DNA 初始模板评价和荧光信号检测等方面的定量分析能力优异而成为一个活跃的领域，与常规PCR 技术相比可对样品实现实时定性、定量分析，有效缩短检测时间[38-39]。周敏琪[40]针对奶粉中的克罗诺杆菌属利用实时荧光定量PCR 进行检测分析，检测限达到4.7×103CFU/mL。

此外，以数字PCR 技术（digital PCR，dPCR）等为代表的第三代PCR 技术随着科学技术的发展应用越来越广泛。dPCR 作为一种新兴的目标核酸绝对定量技术，在食源性致病菌快速检测中应用越来越广泛[41]。dPCR 与荧光PCR 相比可直接定量DNA 分子数量，实现对起始样品的精准分析。dPCR 无需依赖标准曲线和扩增阈值，具有高精确度、高灵敏度和绝对定量等特点[42-43]。

总之，PCR 技术在食源性致病菌检测方面已成为非常实用的技术。目前主要存在的瓶颈问题：一是检测靶点的特异性不高导致的假阳性；二是抑制剂或干扰因素的存在导致的假阴性；三是现有的增菌方法难以快速有效地富集目标菌体所导致的样品前处理与菌体富集的有效性差。随着PCR 研究的不断深入和拓宽，荧光定量PCR、数字PCR 等先进技术的持续迭代升级，必将推动该技术标准化应用向更高层次发展，为食品安全事业作出更大贡献。

1.3.2 等温扩增检测技术 等温扩增检测技术（isothermal amplification technology，IAT）是近年来发展起来的基于特定温度下实现核酸扩增的新型技术，主要包括环介导等温扩增和依赖核酸序列的扩增等类型。其优势主要为对仪器的要求相对简单，检测周期短，适合现代分子生物学快速检测技术的发展需求，发展前景广阔。

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）主要是指通过特异性引物与DNA 聚合酶在等温条件（60～65 ℃）下共同作用实现目标序列扩增的一种新型扩增技术，其避免了传统PCR 需要变温扩增而对仪器性能的依赖，同时兼具快速简便、特异性强的特点[44]。LAMP 由于其等温特性和高灵敏度，越来越多地应用于病原微生物监测的核酸检测中。Hu 等[45]研究构建了LAMP 反应与CRISPR/Cas12a 相结合的检测副溶血性弧菌的方法，该方法具有良好的特异性和敏感性，40 株被试菌株的定性准确度达到100%，纯培养物和DNA 的检出限分别达到2.5 CFU/mL 和5 fg/μL。富集培养2 h 后，对初始接种5 CFU/mL 副溶血性弧菌的人工污染样品进行检测，整个反应时间小于30 min，提高了检测限，并提供了多种端点检测方法，不受仪器的限制，在卫生医疗条件有限的地方具有很高的应用价值。王瑾[46]利用LAMP 方法检测沙门氏菌，检测限达到6 CFU/mL，时间仅45 min。LAMP 广泛应用于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌等致病菌的检测[47]。Young等[48]采用了LAMP 方法从69 份美国国家抗菌素耐药性监测系统（NARMS）零售肉类和家禽样品中快速筛选沙门氏菌。结果表明LAMP 对培养物的灵敏度为100%，证明了快速、稳健、高灵敏度的分子筛选方法在简化实验室工作流程中的好处。截至2022 年7 月，绝大多数NARMS 肉类零售站点已采用沙门氏菌LAMP 测定法对所有样品进行快速筛选。LAMP 的主要优势：一是效率高，其效率是常规PCR 的10～100 倍；二是特异性强、周期短，且设备要求不高[49]。缺陷：一是产物仅用于结果判断分析，不可克隆；二是引物特异性要求较高；三是易因形成气溶性胶而造成假阳性[50]。

依赖核酸序列的扩增技术（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）是指一种在RNA聚合酶作用下通过一对引物连续作用实现体外核酸序列等温扩增的技术。该反应主要通过T7 RNA 聚合酶、AMV（avian myeloblastosis virus）逆转录酶、RNA 酶H 以及一对引物在42 ℃左右来完成，主要步骤为：第一步，RNA 链与含T7 启动子序列的正向引物结合后在AMV 酶催化下形成DNA-RNA 双链，再通过RNA 酶H 消除其中的RNA 链后剩下DNA 单链；第二步，DNA 单链在AMV 酶和反向引物共同作用下形成含T7 启动子序列的DNA 双链；第三步，通过T7 RNA 聚合酶的作用进一步完成转录过程，短时间内实现模板RNA 大量高倍扩增。NASBA 针对目标RNA 或DNA 序列具有较强的特异性，具有高灵敏度、操作简便、不易污染等优势，已广泛应用于食品安全快速检测。在动物疫病预防方面，NASBA 已被国家标准列为检测禽流感病毒的推荐方法之一[51]；在植物病毒检测等方面应用也较为广泛[52]。Nai 等[53]提出了一种改进的T4 基因32 蛋白介导的NASBA 方法，用于三种单链结合蛋白RecA、Extreme Thermostable 单链结合蛋白（ET SSB）和T4 基因gp32 蛋白（gp32）的检测，在41 ℃下进行一步NASBA。与两步法相比，所有SSBs 的扩增率都有显著提高，研究发现gp32 可将HIV-1 RNA 检测的阳性时间（ttp）平均提高到13.6%的一步NASBA和6.7%的常规NASBA，显示其简化工作流程的潜力，适合于NASBA 的应用。NASBA 技术因需要通过RNA 酶抑制剂来防止RNA 降解，导致检测成本较高，目前仍处于研究阶段，但国外发达国家已将该项技术列入重点发展的检测手段，并通过研究项目资助开始制备检测试剂盒进行推广应用。

1.3.3 基因芯片技术 基因芯片技术（DNA chip）是一项融合分子生物学、化学和电子激光等各领域先进技术，通过一次微排列实验可对上千种基因的突变形态和表达水平等进行准确快速检测的新型技术。该技术主要是通过原位合成寡核苷酸或者以显微打印的方式直接固化DNA 探针于固相支持物表面，再通过计算机对标记样品杂交信号进行鉴定分析，从而实现样品的遗传信息测定，其高通量特点弥补了PCR 技术的检测缺陷。根据不同芯片制备原理可分为原位合成芯片（synthetic gene chip）和DNA 微列阵（DNA microarray）两类。其中原位合成芯片主要利用光引导聚合技术（light-directed synthesis）原理，一般用于寡聚核苷酸和寡肽分子的合成；DNA 微列阵则是采用PCR、DNA 核酸合成和克隆等分子生物学技术以显微打印等方式固化DNA 探针于支持物表面而制作而成。左秀华[54]利用基因芯片技术结合多重PCR 技术检测大肠杆菌，结果表明灵敏度可达104CFU/mL，可有效鉴别产肠毒素大肠杆菌和大肠杆菌O157 等。Guo 等[55]开发了一种可用于多目标检测的便携式分区DNA 水凝胶芯片，将目标识别荧光适体发夹纳入多个滚圈扩增产物中，通过交联扩增形成分割表面固定化的DNA 水凝胶芯片，可实现对多个目标的便携、同时检测，该方法拓展了半干化学策略的应用，可实现不同靶点的高通量和护理点检测（POCT），为食源性致病菌检测提供了新的潜在解决方案。

基因芯片技术优势在于效率高、高通量、可定量检测，但在样品前处理、检测限与灵敏度、标准统一性、基因芯片特异性等方面还有待改进。随着科技的进步，未来的趋势将朝着微型化、信息化、可视化的方向发展。

1.3.4 基因组测序技术 基因组测序技术是指对未知基因组序列的样品进行氨基酸或核酸等生物小分子序列测定的技术。从1977 年至今，基因测序技术经历了Sanger 测序、高通量测序（NGS）和单分子/纳米孔测序总共三代技术的发展，已取得了相当大的进步。近年来，第三代单分子/纳米孔测序技术在食源性致病菌检测领域应用越来越多。

单分子/纳米孔测序技术是指通过纳米材料、高分子、光学等先进技术手段相结合来分析碱基信号差异，从而实现读取基因序列信息的目的。该技术在食源性致病菌检测中的应用主要体现在解析长片段的可移动基因组，具有超长解读的特点。用于公共卫生监测和食源性病原体流行病学调查的全基因组测序（WGS）主要依赖于产生短读取的测序平台，长读取纳米孔测序的持续改进，如牛津纳米孔技术（ONT），在公共卫生和食品工业环境中展示了利用该技术的多重优势的潜力，包括快速周转和现场适用性，以及优越的读取长度。Xian 等[56]利用已建立的肠炎沙门氏菌分离物队列进行分型评估用于主要食源性病原体单核苷酸多态性（SNP）分析的纳米孔长读测序和核心基因组多位点序列分型（cgMLST）的技术成熟度。该项研究为不断发展的纳米孔技术建立了一个基线，作为高质量沙门氏菌亚型的可行解决方案，无论单独使用还是与短读平台一起使用，都能提供相当的亚型表现，为评估和优化在特定环境中实施食源性病原体监测的ONT 方法的辅助工作提供了基础支撑。Sarahl 等[57]将MiIO 纳米孔测序技术应用于国际空间站的微生物现场快速鉴定和检测，结果表明大规模的微生物鉴定效果良好。Ji 等[58]利用PacBio 测序技术研究污水处理厂细菌菌群，结果显示可鉴定细菌菌属水平总序列的68%。

单分子/纳米孔测序技术具有高通量、精准可靠、安全、便于组装且具有发现unique reads 的潜在优势，但其用于食源性致病菌检测的瓶颈在于生物信息学软件与数据库的大量需求，且成本较高，限制了其在商业市场的应用推广，未来随着科技的发展将更为稳定和成熟[59]。

2 食源性致病菌快速检测技术的标准化应用

标准化是保障食品安全和人民生命健康的重要手段和基础性支撑，也是推动先进技术应用实施并发挥成效的关键前提。随着经济全球化的发展，食品安全已跨越国界，世界各国对于贸易往来中的食品安全问题都非常重视，全球食品安全检测技术越来越统一化、标准化[60]。近年来，我国在食源性致病菌快速检测技术研究方面取得了一定的进展，但标准化水平仍相对偏低，在此形势下，加快先进快速检测技术标准化建设和应用，推动与国际技术标准接轨，对于提高我国食品安全水平意义重大，同时也有利于我国打破食品农产品出口的技术性贸易壁垒，推动食品贸易高质量发展[61-62]。

当前，传统常见的食源性致病菌检测方法主要依据为食品安全国家标准中关于散装即食食品[63]和预包装食品[64]的致病菌限量及相应的食品微生物学检验方法，主要以传统培养检测方法为主，具体信息见表1。传统的培养计数法目前仍是食源性致病菌检测的金标准方法，对于指标性验证具有较强的准确性，其标准化应用也相对较为成熟，但是检测流程繁琐、耗时长，一般需要2～4 d 才能得到检测结果，限制了其大范围推广应用，且难以满足目前行业内快速检测的市场需求。随着科技的发展，新型快速检测技术发展迅速，而标准化则是这些快速检测技术能否成功推广的核心和关键，因此有必要讨论目前食源性致病菌快速检测技术的国内外标准化现状，从而更好地推动该领域技术应用推广。

表1 常见食源性致病菌对应标准化检测方法Table 1 Standardized detection methods for common foodborne pathogens

2.1 国内快速检测技术标准化现状

目前国内针对食源性致病菌快速检测技术的相关标准制定已经取得了一定的进展。国内相关标准初步梳理已有48 项以上。其中针对PCR 和ELISA相关快速检测方法制定了推荐性国家标准，具有时间短、灵敏度高的优点，一般仅需2～4 h，检测限可达102CFU/mL，但一般企业生产或监管部门市场抽检的食品样本中致病菌浓度都较低，所以需要进行0.5～1 d 的前增菌处理，该过程大大延长了检测周期，导致难以有效开展食品安全风险的前期预警。除了国家标准外，其他相关标准基本属于海关进出口检验检疫领域行业标准，主要包含PCR 试纸条、荧光PCR、数字PCR、基因芯片、分型MLST、环介导等温扩增以及基因测序等先进快速检测技术，有力支撑了进出口检验检疫事业的发展。但在其他行业领域，尤其是卫生、农业、商务、市场监管等行业领域的标准供给仍明显不足，亟需制定符合行业发展需求的先进快速检测方法标准。对于一些较为先进的目前尚不具备制定国家/行业标准条件的快速检测方法，可以根据市场实际优先选择制定团体标准或企业标准，满足市场发展需求，待条件具备后可按程序制定为国家/行业标准进行推广使用。具体标准信息见表2。

表2 国内食源性致病菌快速检测技术相关标准Table 2 Domestic standards for rapid detection technology of foodborne pathogens

2.2 国外快速检测技术标准化现状

国外先进标准（含国际标准）初步梳理了17 项，主要有ISO、俄罗斯、印度、英国和德国等相关标准，大部分是关于PCR 技术的检测应用，涉及检测方法的一般要求和定义、检测和定量分析等方面，其中俄罗斯在食源性致病菌领域标准制定进展较快，欧盟和国际标准化组织（ISO）也制定了一系列先进检测方法标准。欧盟法规（EC）No 2073/2005《食品微生物标准》[65]中包含安全标准、过程卫生标准、采样标准等，针对致病菌安全限量也提供了PCR、ELISA 及等温扩增技术等快速检测技术标准。这些国外标准都具备较好的参考学习价值，可以根据国内实际借鉴或进行采标转化，以推动我国食品安全快速检测技术的标准化发展。具体标准信息见表3。

表3 国外食源性致病菌快速检测技术相关标准Table 3 Foreign standards for rapid detection technology of foodborne pathogens

2.3 国内外标准化应用实践

2.3.1 国内标准化应用实践 食源性致病菌快速检测技术在国内的标准化应用主要涉及企业生产加工、基层市场监管执法、公共卫生安全和海关进出口检验检疫等领域。具体如下。

在企业生产加工领域，针对企业生产加工过程中的食品微生物致病菌的安全检测，主要包括生产环境的微生物监控和过程产品的微生物监控[66]。具体的生产加工过程中微生物的监控检测要点包括：监控指标、采样点位、频率、采样和检测方法、评判原则和整改措施等，通过对各环节的标准化监控检测可有效反映企业工业化生产过程的食品安全管理水平。这其中最为关键的即是致病菌的快速检测方法标准化应用，因为检测涉及生产—加工—消费等全产业链，目前国内相关企业已经在结合自身生产工艺、产品特点以及环境条件制定了一系列的企业检测标准，主要有PCR 技术、ELISA 技术等，同时相关团体协会也在逐步开展分子检测技术、生物传感器技术等先进检测方法的团体标准制定。

在基层市场监管执法领域，食源性致病菌快速检测方法具有操作便捷、灵敏度高、时间短、成本低、特异性强以及对环境和仪器要求低等优点，适合基层市场监管部门对大量样品的快速筛查抽检，其标准化应用推广是将食品安全问题遏制在进入消费者餐桌前端的关键和前提，是保障食品安全和防控食源性致病菌感染的重要基础支撑。市场监管部门[67-68]在婴幼儿配方乳粉及企业乳制品生产许可规定中也明确推荐企业使用快速检测方法和设备，但应保障结果可靠性，同时要求企业应定期将自身的快速检测方法、设备与国家标准方法进行对标验证，阳性结果应通过国标方法确认。

在公共卫生安全领域，快速、准确地鉴别食源性致病菌是及时应对突发性食品安全事件、有效预防和控制公共卫生安全的前提和关键。中共中央国务院2019 年5 月印发的《关于深化改革强食品安全工作的意见》中强调要加快食品安全标准制定，确保人民群众“舌尖上的安全”。国家卫生健康委在关于航空食品卫生规范中[69]也明确建议可采用微生物快速检测方法进行筛查检测，再以国际方法进行验证确认。

在海关进出口检验检疫领域，全国各地海关技术检测机构相继主导制定了《GB/T 4789.9-2008 食品卫生微生物学检验 空肠弯曲杆菌检验》等多项致病菌快速检验领域的国家/行业标准。上海海关技术团队针对空肠弯曲菌开发的实时荧光PCR 快速检测方法已获美国分析化学家协会（AOAC）PTM 认证，该技术是我国第一个自主研发的通过AOAC 国际认证的食品微生物快速检测方法[70]。通过自主研发标准化试剂盒和国际认证，一方面可有效提升国产试剂盒的质量水平和国际认可度，降低食品安全快速检测领域的技术性贸易壁垒，推动进出口贸易发展；另一方面也填补国内食品安全先进检测技术国际认证领域的空白，为下一步AOAC 等其他先进国际标准的研制积累技术经验，有助于增强我国技术和标准话语权。

2.3.2 国外标准化应用实践 由美国科学院、美国工程院、美国医学科学院共同制定的“2030 美国食品和农业科技发展战略”的具体目标中提到“开发食源性致病菌早期快速检测方法并进行标准化应用”，其中重点突破领域为“交叉学科研究和系统研究方法、传感技术”[71]。国际食品法典委员会（CAC）对于即食食品中的大肠杆菌、肠杆菌科、菌落总数等微生物致病菌主要强调过程控制，仅在标准法规中明确了单核细胞增生李斯特氏菌在即食食品中的限量，并对检测方法作了相应说明[72-73]。CAC 于2013 年修订了《制定和应用食品微生物标准的原则和指南》（CAC/GL 21-1997），其中规定了微生物标准制定的目的、考虑因素、采样方案和检验方法等内容，用于指导各国微生物标准管理工作[74]。CAC 在2009 年修订的《婴幼儿粉状配方食品卫生操作规范》（CAC/RCP 66-2008）中提出了婴幼儿粉状配方食品相关产品中的沙门氏菌和克罗诺杆菌等的限量标准及对应检测方法。国际食品微生物标准委员会（ICMSF）早在2002 年出版的《食品微生物检验与食品安全控制-食品中的微生物（第七卷）》中就对微生物标准的选择、制定和应用，以及分级采样方案原理、类型和应用等内容进行了详细介绍。提出的分级采样方案是食品微生物标准化领域的重要组成部分，已被CAC 及世界各国广泛采纳和引用。ICMSF 在《食品加工过程的微生物控制原理与实践-食品中的微生物（第八卷）》（2011 年版）中系统分析了18 大类不同食品中的微生物危害和潜在风险，并提出应控制的主要致病菌种类、限量要求、关键控制点及相应的检测方法等。近年来，诸多国家或地区，如欧盟、日本、澳大利亚、美国等，均逐步制定或修订了与CAC 法典等国际先进标准相协调一致的食源性致病菌检测技术标准。

3 结论

近年来，食源性致病菌快速检测技术及其标准化应用取得了快速发展，对于食品安全事业的支撑作用也愈加凸显。随着全球对食品安全的愈加重视以及科技的发展，新型检测技术在时间、灵敏度以及特异性上都有了较大提升，但标准化仍是目前快速技术推广和应用的关键和短板。一方面，新型快速检测技术在灵敏、快速、特异性强的同时，大部分仍然属于非法定方法，且几乎都存在一定的缺陷，例如免疫检测技术存在抗体前处理较为麻烦，生理生化检测技术存在污染菌混淆问题，缺乏统一的判定标准。另一方面，先进的纳米技术、基因技术、传感器技术等前沿科学不断与食源性致病菌的快速检测融合发展，利用多学科交叉结合，实现优势互补，从而推进快速检测技术的标准化应用，将成为未来发展的必然趋势。此外，国内外针对食源性致病菌快速检测技术的相关标准体系仍不完善，制约了快速检测技术的标准化推广应用。国内现行标准主要为海关进出口检验检疫领域的行业标准，难以满足行业发展的需求，因此亟需制定一系列快速检测技术的国家/行业标准、地方标准和团体标准等，补齐标准短板，推动食品安全检测事业发展。

未来，食源性致病菌检测技术应符合检测速度足够快、检测限值足够低、检测特异性足够好等特点，朝着简便化、标准化和数字化的方向发展。对其未来发展提出建议如下：一是加快新型检测技术的标准化研究开发。找准当前的技术缺陷和不足，以标准化视角持续研究和迭代升级。二是完善食品安全快速检测技术标准体系。加快建立健全覆盖企业生产、市场监管、公共卫生和海关进出口等不同行业领域的技术标准体系来支撑我国食品安全事业发展。三是提高检测技术应用推广的质量和水平。适应新时代发展要求，着力推动食品安全快速检测技术标准化应用全产业链覆盖，加快先进技术在基层的推广和普及，从而提高食品安全质量。