基于核酸扩增-侧流层析试纸的食源性致病菌快速检测研究进展

贠紫光，魏 勇，张 建，崔双双，李 灿，孙凤霞,,

（1.农业农村部特色农产品加工与质量安全控制重点实验室（部省共建），石河子大学食品学院，新疆石河子 832000；2.食品营养与安全控制兵团重点实验室，石河子大学食品学院，新疆石河子 832000；3.新疆天润乳业股份有限公司，新疆乌鲁木齐 830063）

根据世界卫生组织统计，全球每年有近十分之一的人因食物受污染而生病，而这些患食源性疾病的患者中70%是由致病性微生物所引起的[1-2]。常见的食源性致病菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌等，对公共卫生安全埋下巨大隐患的同时也对食品产业和社会造成经济损失。全球多个国家都制定了各种食品基质中食源性致病菌限制标准，我国针对预包装食品和散装即食食品，也新发布了两项有关致病菌限量的食品安全国家标准，使得食源性致病菌检测的标准体系更加完善，分类更加细化。更加细致严格的标准维护了消费者食用时的公共卫生安全，而降低食源性致病菌对食品产业和社会造成的经济损失并从源头上解决问题，则需要准确、快速、高效的食源性致病菌检测方法。

目前，我国食源性致病菌检测主要依据GB 4789 系列标准，检测方法以传统培养法为主，具有检测准确性高、结果可靠等优点，是食源性致病菌检测的金标准，但检测耗时长、费时费力，难以应对现代食品安全快速检测的要求。基于核酸扩增的分子生物学方法因其检测效率高、准确性强、特异性高被广泛应用于食源性致病菌检测中，主要包括聚合酶链式反应法（Polymerase chain reaction，PCR）、等温核酸扩增法、基于成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/crispr-associated protein，CRISPR/Cas）的检测技术等，但这些方法大多存在无法实现可视化、便携化检测等弊端。近年来，研究者们将核酸扩增与其他检测方法联用来改进和完善检测性能，其中和侧流层析试纸技术联用的研究最为广泛。侧流层析试纸检测技术具有操作简单、结果可视化、成本低廉等优点，在食源性致病菌现场快速检测中具有巨大的应用潜力。本文综述了多种基于核酸扩增-侧流层析试纸的检测体系及其在食源性致病菌检测中的应用进展，并提出该联用技术在食源性致病菌快速检测领域的发展方向，以期为食源性致病菌的检测和防控提供方法参考。

1 基于PCR-侧流层析试纸检测食源性致病菌

PCR 是基于核酸检测食源性致病菌最常用的技术手段，通过模拟生物机体内DNA 的复制过程，经过变性－退火－延伸的循环，使得DNA 分子在生物体外扩增，基于目标菌的保守基因设计引物使其具有特异性，从而有效鉴定目标菌[3]。PCR 技术灵敏度高、特异性强、快速简便，并因其可以用来检测一些难以培养或人工无法培养的微生物，检测范围和能力都占有优势，在食源性致病菌检测中得到广泛应用，主要包括单重PCR、多重PCR 及荧光定量PCR 等方法。贾方芳等[4]针对兔源性沙门氏菌的invA基因设计两对引物，分别建立单重PCR 检测方法，检出限分别为0.118、1.180 pg/µL，准确率达100%，实验结果表明，合理的引物设计与选择直接影响PCR 检测方法灵敏度，是PCR 检测方法的基石；王仕成[5]建立了同时检测牛乳中金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌、停乳链球菌、的多重PCR 检测方法，检测灵敏度分别为1、1、1 pg/µL 及100 fg/µL，节省了大量检测时间，提高了检测效率，可以有效降低检测成本；陈秀琴等[6]建立了大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的多重荧光定量PCR 检测方法，可有效避免普通多重PCR 产物之间的交叉污染。然而，上述方法检测结果的呈现需要电泳、配套紫外或荧光检测等，存在检测时间较长、不便于现场检测等弊端，如何快速方便的对PCR 检测结果进行判读成为需要解决的实际问题。2022 年10 月1 日，中华人民共和国海关总署颁布了SN/T 5439-2022《出口食品中食源性致病菌快速检测方法 PCR-试纸条法》，首次建立了PCR-试纸条法检测大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等7 种常见食源性致病菌的行业标准[7-13]，食源性致病菌PCR-侧流层析试纸联用检测方法成为研究热点，根据侧流层析试纸中标记物的不同，主要有PCR-金标层析试纸和PCR-荧光层析试纸。

1.1 PCR-金标层析试纸检测方法

以胶体金为标记物的胶体金试纸条在PCR-侧流层析试纸中应用最为广泛，PCR 产物在试纸条上结果呈现常依据双抗夹心法原理进行设计[14-15]，如图1 所示，首先在上下游PCR 引物两端分别修饰生物素和地高辛，金纳米粒子作为标记物标记抗地高辛抗体制备金标抗体，并预先喷涂在结合垫上。检测线（T 线）上固定链霉亲和素，质控线（C 线）上固定羊抗鼠二抗。当待测样本中有目标菌时，PCR 扩增产物为一端标记生物素，另一端标记地高辛的双螺旋DNA，待测物流经结合垫时通过地高辛抗原抗体识别作用形成金标-PCR 扩增产物复合物，到达T 线时通过生物素-链霉亲和素特异结合作用形成红色条带，剩余的金标-PCR 扩增产物复合物继续层析到达C 线被羊抗鼠二抗结合，此时T 线和C 线均显示出红色条带，即为阳性结果；当待测样本中没有目标菌时，则PCR 扩增产物不存在，T 线因无法捕捉胶体金而不显色，C 线通过羊抗鼠二抗结合抗地高辛抗体来捕捉金粒子得以显色，即为阴性结果；通过试纸条上T 线的有无可实现食源性致病菌的定性检测。

图1 PCR-试纸条法检测食源性致病菌原理图Fig.1 Principle diagram of PCR-test strip method for detection of foodborne pathogens

基于此原理制备的PCR-金标层析试纸条，可以用于对食源性致病菌的早期检测和流行病学筛查[16]，避免染料及紫外光对实验员造成的危害并可实现现场检测[17]。Singh 等[18]利用5’-荧光素氨基磷酸酯（Fluorescein aminophosphate，FAM）和生物素对耶尔森菌的特异性上下游引物进行标记，建立的PCR-金标层析试纸可用于检测人血样本中的耶尔森菌，灵敏度可达104CFU/mL。陈诗胜等[19]利用异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate isomer I，FITC）和地高辛对上下游引物的5’端进行标记，以抗FITC 抗体标记胶体金颗粒，在T 线和C 线上分别固定抗地高辛抗体和羊抗鼠二抗，分别研制出无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和停乳链球菌的PCR-金标层析试纸条，除大肠杆菌外，其他3 种菌的试纸条均比凝胶电泳法的检测灵敏度提高了10 倍，表明PCR-金标试纸法可适用于食源性致病菌的筛查和检测，并能显著提高检测灵敏度。

为应对多种食源性致病菌的同时检测，Nor等[20]针对井水样中三种不同类型的沙门氏菌建立了多重PCR-金标层析试纸法，利用内标排除假阴性的可能，结果表明，580 份水样利用多重PCR-金标层析试纸法共检测出15 份样本呈伤寒沙门氏菌阳性，而传统培养法和PCR-凝胶电泳法只检测出1 份阳性样本，多重PCR-金标层析试纸法的致病菌检出率和检测效率更高。侯巧华[21]首先建立了大肠杆菌和沙门氏菌双重PCR 检测体系，根据PCR 扩增产物分别设计两对特异性DNA 探针，一条探针5’标记生物素，另一条探针的3’分别标记FAM 和地高辛，将双重PCR 扩增产物和两组探针混合均匀95 ℃处理5 min，56 ℃处理3 min 互补结合，进行试纸条双重检测（如图2），若检测线1 显色，表明样品中含有大肠杆菌；若检测线2 显色，表明样品中含有沙门氏菌；若检测线1、2 均显色，则同时含有大肠杆菌和沙门氏菌，该方法检测灵敏度可达10 CFU/mL，证明了PCR-金标层析试纸在食源性致病菌多重检测中的应用潜力。另外，为消除死菌DNA 对PCR 检测结果的干扰，避免死菌引起假阳性，Kim 等[22]针对大肠杆菌O157:H7 的stx2基因和鼠伤寒沙门氏菌的his操纵子基因分别设计特异性引物，上游引物5’分别标记地高辛和FAM，下游引物3’标记生物素，结合单氮化丙啶（Propidine mononitride，PMA）抑制PCR 中死细菌DNA 扩增的特点，建立了同步检测活的大肠杆菌O157:H7 和鼠伤寒沙门氏菌的mPCR-双重层析试纸检测方法，对大肠杆菌O157:H7 和鼠伤寒沙门氏菌的检测限分别为102、101CFU/25 g，且不需要培养富集即可直接检测致病菌。PCR-金标层析试纸条操作简单、应用范围广，可实现可视化检测，对食源性致病菌现场检测的普及具有重要意义。

图2 多重PCR-层析试纸条检测原理图[21]Fig.2 Principle diagram of multiplex PCR-chromatographic test strip detection[21]

1.2 PCR-荧光层析试纸法

荧光微球（Fluorescentmicrosphere，FMs）是一种发射光谱类的新型标记物，形态结构相对稳定，分散性好、偶联效率高，常通过在微球内部螯合稀土元素等微小颗粒或利用物理、化学方法在微球表面标记荧光物质制备，受外界能量刺激激发荧光，根据荧光强度的变化定量检测待测物[23]。以荧光微球为标记物制备的荧光层析试纸，检测原理同金标层析试纸条类似，且可以消除背景干扰，进一步提高检测灵敏度。滕军[24]针对大肠杆菌O157:H7 的毒力基因rfb设计特异性引物，在上下游引物分别修饰FITC 和生物素，FMs 标记抗FITC 抗体，T 线上固定链霉亲和素，C 线上固定羊抗鼠二抗，建立PCR-荧光层析试纸检测方法，其灵敏度达到3 CFU/mL，比传统的PCR凝胶电泳方法检测限降低100 倍，比PCR-金标层析试纸条的检测限降低10 倍，检测时间由30 min 缩减为10～15 min。

荧光微球在实际检测中往往会受到食品基质的干扰，时间分辨荧光微球是一种特殊功能的荧光微球，其内部包埋了稀土镧系元素，在紫外光下发射特殊的荧光，比普通荧光斯托克斯位移大且荧光寿命延长5～6 个数量级，通过时间延迟和波长的分辨，可以有效消除样品中本底荧光、激发光等非特异性荧光的干扰，进一步提高灵敏度。冯瑶[25]制备了胶体金试纸条和时间分辨荧光层析试纸条用于B 族链球菌的检测，检测灵敏度分别为105、103CFU/mL，表明时间分辨荧光层析试纸条灵敏度较胶体金试纸条更高。Wang 等[26]利用镧系荧光微球标记抗大肠杆菌O157:H7 单克隆抗体，制备了大肠杆菌O157:H7 时间分辨荧光层析试纸条，降低了肉制品中本底荧光对检测结果的影响，灵敏度高、抗干扰能力强，视觉检测限为104CFU/mL，结合试纸条阅读器其检测限低至102CFU/mL。然而目前报道的食源性致病菌时间分辨荧光层析试纸均为基于抗原抗体免疫分析，利用时间分辨荧光微球制备PCR-时间分辨荧光层析试纸条或将成为提高食源性致病菌检测灵敏度的新方向。

PCR-侧流层析试纸条通常只能实现对目标物的定性或半定量分析，结合读数装置如智能手机上的分析软件可实现定量分析（图3）。智能手机成像能力强，体积小便于携带，通过智能手机拍照，结合读数装置的视觉识别技术，将光学信号转化为数字信号，借助智能手机软件的计算能力定量分析数据，可以有效避免因光照强度、肉眼偏差等客观与主观因素对检测结果的误判。Jung 等[27]开发了一个智能手机内部应用程序，采用灰度化模式处理图像，有效提取试纸条上的显色信息，成功检测出牛肉中104CFU/mL 和菠菜中105CFU/mL 的大肠杆菌O157:H7，表明借助智能手机可实现侧流层析试纸条定量检测，为试纸条检测结果的判定提供了一种更加客观准确的方法。王月[28]基于PCR 核酸修饰技术结合核酸试纸条，建立了鼠伤寒沙门氏菌PCR-侧流层析试纸检测方法，利用智能手机对试纸条进行拍照后使用Image J 和Origin 软件进行统计分析，通过T 线和C 线峰面积的比值即可确定出不同浓度菌液在试纸条上颜色信号的变化，检测结果与琼脂糖检测结果一致，检测限可达233 CFU/mL，有效解决了肉眼难以判别试纸条显色浅、条带模糊的难题，保障实验精确性。

图3 基于智能手机的免疫层析定量分析[27]Fig.3 Smartphone-based immune chromatography quantitative analysis[27]

PCR 法作为分子检测的黄金标准，重复性好、灵敏度高、适用性广，但需要电泳、显色等步骤，对仪器依赖性强，难以进行现场检测。将PCR 和侧流层析试纸技术相结合并进一步改进和优化，可以较好解决此类问题。PCR-金标层析试纸法、PCR-荧光层析试纸法都可用于快速高效地检测食源性致病菌，金标层析试纸法易受基质干扰，不稳定因素多，灵敏度受限。相对而言，荧光层析试纸法更为稳定，因发射光谱的多样性可以实现多指标的同时检测，灵敏度也比金标层析试纸要高。但若只是需要简单的定性，金标层析试纸不需要仪器设备，成本低，用肉眼即可判别，且胶体金几乎可以标记所有蛋白分子，更加便于推广普及。

2 基于等温核酸扩增-侧流层析试纸检测食源性致病菌

等温核酸扩增技术是一种在恒定温度下扩增核酸的分子学检测技术，相比于PCR，等温核酸扩增技术反应时间短，对精密仪器及实验室场所的依赖少，仅需凭借简单的热源或水浴锅辅助即可实现核酸扩增，在降低成本上有显著优势。主要包括环介导扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification，RPA）、交叉引物扩增（Crossing priming amplification，CPA）、滚环扩增（Rolling circle amplification，RCA）以及解旋酶依赖性扩增（Helicase-dependent amplification，HDA）等技术，5 种技术的区别如表1所示，RCA 及HDA 反应时间相对较长，LAMP 及CPA 对引物的需求更大，RPA 在反应时间、反应温度及所需引物上都有很大优势，在食源性致病菌检测方面具有很好的发展潜力。

表1 5 种等温核酸扩增技术的对比Table 1 Comparison of 5 isothermal nucleic acid amplification techniques

2.1 LAMP-层析试纸法

LAMP 是目前研究最多的一种等温核酸扩增技术，通过针对靶基因的6 个区域设计4 种特异性引物扩增核酸，已被广泛应用于食源性致病菌的检测。近年来，研究者常将其与可视化层析试纸条结合应用来提升检测灵敏度[34]。Zhang 等[35]直接将LAMP微反应管连接到侧流层析试纸条上，简化设备操作，避免气溶胶产生，成功检测出样品中低至10 fg 的沙门氏菌基因组DNA。Jiang 等[36]利用多重LAMP结合层析试纸法，在57 min 内实现了婴幼儿配方奶粉中3 种食源性致病菌的同时检测，检出限小于10 CFU/mL。Wen 等[37]采用免疫磁珠对目标菌进行富集，利用PMA 鉴别死菌活菌，建立LAMP-金标层析试纸法实现了对生菜中的E.coliO157:H7 活菌进行检测。

上述LAMP-层析试纸研究中主要以胶体金为标记物，往往存在稳定性不高、灵敏度低、易受外界干扰等缺点。纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能又有催化功能的模拟酶[38]。目前纳米酶可模拟的催化活性主要包括类过氧化物酶活性、类过氧化氢酶活性、类超氧化物歧化酶活性、类氧化酶活性、类核酸酶活性及类蛋白酶活性等，且一种纳米酶可以同时拥有多种天然酶的活性，如氧化铁纳米酶同时兼具过氧化物酶和过氧化氢酶两种活性。随着纳米材料的兴起，纳米酶材料的种类也越来越多，应用于层析试纸条的有金属氧化物、贵金属、碳材料及金属有机框架材料等。纳米酶利用生物效应催化天然酶底物显色，可以增强试纸条检测信号，有效解决了传统胶体金免疫试纸条检测灵敏度低的问题，具有催化效率高、稳定、低成本和可规模化制备的特点[39]，以纳米酶为标记物制备层析试纸条，分散性更好、灵敏度更高，发展潜力广阔。

Zhang 等[40]利用贵金属纳米酶与3,3'-二氨基联苯胺/过氧化氢（DAB/H2O2）酶促底物之间的酶促反应来放大检测信号，以Fe3O4纳米酶代替胶体金作为标记物对侧流层析试纸进行酶修饰，针对阪崎克罗诺杆菌的ompA基因设计LAMP 引物，其中内引物FIP 的5’端修饰生物素，BIP 的5’端修饰FITC，试纸条的T 线和C 线分别包被1 mg/mL 抗FITC 抗体和抗小鼠IgG，结合PMA 区别死菌活菌特点，建立了一种基于PMA、LAMP-纳米酶层析试纸的连续级联纳米酶生物传感器，可在1 h 内实现10 CFU/mL阪崎克罗诺杆菌活菌的检测，有效提高了免疫层析试纸的灵敏度。此外，在食品生产、加工、流通过程中，常常有一些食源性致病菌附着于器物表面形成生物被膜，腐蚀仪器设备，对环境抵抗力强不易去除，引发二次污染，对食品安全造成潜在危害。对此，Shi 等[41]针对单增李斯特菌hlyA基因设计LAMP 引物，其中FIP 引物的5’端修饰FITC，BIP 引物的5’端修饰生物素，利用Fe3O4做为标记物偶联抗生物素抗体制备纳米酶探针，结合PMA 抑制死菌DNA 扩增的特点，研制出PMA-LAMP-纳米酶层析试纸（图4），用于检测不锈钢器具及生菜中的单增李斯特菌生物被膜，检测限分别为1.164×101、1.021×101CFU/mL，对大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、志贺氏菌等无交叉反应，所研制的纳米酶层析试纸具有灵敏度高、特异性强等特点。

图4 检测单增李斯特菌的LAMP-纳米酶层析试纸原理示意图[41]Fig.4 Principle diagram of LAMP-nanozyme chromatography test paper for detecting Listeria monocytogenes[41]

2.2 RPA-层析试纸法

RPA 技术以T4 噬菌体核酸复制机制为原理，在三种关键蛋白与DNA 聚合酶、聚集剂及盐类分子等物质的共同作用下实现对DNA 特定区域的指数扩增[42]，该技术对设备要求低，不需DNA 解链过程，是继LAMP 后应用最为广泛的等温核酸扩增技术。与LAMP 相比，RPA 更适合多路复用，实现多核酸扩增，结合侧流层析试纸条进一步实现对扩增产物的可视化判别。

葛志毅等[43]根据布鲁氏菌特异基因的保守序列设计引物和RPA 探针，用生物素修饰下游引物，FAM 修饰RPA 探针，38 ℃反应10 min 后进行试纸条检测，检测布鲁氏菌敏感性能达到10-5（8 拷贝），与实时荧光定量PCR 检测结果符合率高，特异性良好，操作简单快速，可实现布鲁氏菌的野外现场检测。Fu 等[44]分别利用地高辛和生物素修饰肠炎沙门氏菌的特异性上下游引物，在金纳米表面包被链霉亲和素制备金标复合物并喷涂在结合垫，在试纸条的T 线固定抗地高辛抗体，C 线固定抗链霉亲和素抗体，借助RPA 扩增目标核酸片段后，利用试纸条呈现等温扩增结果（图5），该方法检出限为91.4 CFU/mL，具有定量快、成本低、可快速保存每个样品数据等优点。厉佳丽[45]针对金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌分别设计了三种特异性RPA 引物，上游引物分别使用生物素、羧基荧光素、Cy5 进行标记，下游引物均标记地高辛，以抗地高辛单克隆抗体标记胶体金，优化多重RPA 反应体系，结合胶体金读数仪实现金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的同时快速检测，检测限可达10 CFU/mL，实现了实际样本中食源性致病菌多靶标同步快速定性定量检测，极大提升检测效率。

图5 沙门氏菌RPA-层析试纸检测示意图[44]Fig.5 RPA-chromatographic test strip process diagram for detecting Salmonella[44]

2.3 CPA-层析试纸法

LAMP 在反应中会产生未知大小扩增子的长结构，使检测过程复杂化，易发生假阳性和背景扩增反应。CPA 技术是一种新型的等温扩增技术，受到研究者们的广泛关注，具有高度特异性及敏感性，能够快速靶扩增[46]。如图6A 所示[47]，其原理是通过4/5 条引物双交叉扩增/单交叉扩增核苷酸序列，反应依赖于甜菜碱、交叉引物和Bst DNA 聚合酶。

图6 CPA-层析试纸检测示意图[47-48]Fig.6 Schematic diagram of the CPA-chromatographic test trip detection[47-48]

目前CPA 技术的发展仍受限于结果的高效判读和可视化显示，如图6B 所示[48]，将核酸层析试纸引入CPA 法中可以打破这种限制。向勇[49]针对铜绿假单胞菌的特异性基因oprI设计1 组5’端标记FAM 和生物素的CPA 交叉扩增引物，在62 ℃恒温扩增45 min 后，使用核酸检测试纸条进行可视化检测，其灵敏度是常规PCR 检测方法的100 倍，同时CPA 的密闭管设计能有效避免气溶胶污染，保证结果直观客观，特别适用于户外和基层医疗单位，是检测铜绿假单胞菌的理想系统。Wang 等[50]基于印第安纳肠炎沙门氏菌设计了6 条引物，包括2 条置换引物、2 条交叉引物和2 条检测引物，2 条检测引物的5’端分别用生物素和6-FAM 标记，63 ℃水浴扩增1 h 后，将CPA 扩增产物滴加于一次性核酸试纸，检测灵敏度为8.997 fg/µL，比实时荧光PCR 高10 倍，比常规PCR 高100 倍，在预防印第安肠炎沙门氏菌中表现出巨大潜力；刘敏[51]以蜡样芽孢杆菌基因组为模板，用1 对外引物、1 对交叉引物及2 条分别用FITC 和生物素标记的探针，在63 ℃恒温扩增60 min，结合核酸试纸条判定检测结果，建立的CPA-层析试纸检测蜡样芽孢杆菌的方法特异性强，可用于进出境口岸现场蜡样芽胞杆菌的快速筛查。

2.4 RCA-层析试纸法

RCA 是一种简单高效的体外核酸扩增技术，是借鉴自然界中环状病原生物体DNA 分子滚环式复制方式发展出的一种恒温扩增技术[52]，和LAMP 和CPA 相比，在引物设计上相对简单。Qin 等[53]针对海洋卡顿藻建立了双探针滚环扩增体系，结合试纸条实现检测结果的可视化，其对海洋卡顿藻DNA 的检出限为8.3×10-3ng/µL，为其他藻类可视化快速检测提供方法借鉴，如Liu 等[54]利用相同原理成功建立了双探针滚环扩增-层析试纸法并应用于剧毒卡尔藻的快速检测。在食源性致病菌检测方面，RCA-层析试纸法的研究还较少。黄梦琪等[55]建立了基于RCA的纸基显色传感器的单增李斯特菌hly AmRNA 可视化检测平台，如图7 所示，设计的锁式探针5’和3’分别和基因组目标序列RNA 完全互补配对，当存在待检测的RNA 时，连接酶就会特异性连接5’和3’，使开环的探针闭合成为一个封闭的环状结构，以此结构为模板，通过RCA 对单增李斯特菌的hly AmRNA进行特异性扩增，将扩增后的单链产物进一步利用Hhal 核酸内切酶特异性切割该单链核酸，形成与锁式探针长度相同的核酸单链片段，不经过预变性杂交即可直接借助试纸条检测，最优实验条件下检测限低至100 pg/μL 总RNA，该方法检测时间短，检测成本低，不依赖大型仪器，整个反应过程在恒温下即可完成，显示出RCA-层析试纸法在食源性致病菌检测中的优势。

图7 RCA-层析试纸检测示意图[55]Fig.7 Schematic diagram of the RCA-chromatographic test trip detection[55]

2.5 HDA-层析试纸

HDA 利用解旋酶、单链DNA 结合蛋白等组分模拟体内DNA 复制过程，替代PCR 过程中变性-退火-延伸的热循环过程[56]，从而实现DNA 体外恒温扩增的技术（如图8）[57]，和其他恒温扩增技术相比，扩增过程简单，检测流程简单，通常利用电泳、荧光、电化学等方法对HAD 扩增产物进行检测[58]。目前，利用HDA 检测食源性致病菌的研究鲜有报道，而将HDA 和层析试纸联用的研究更为少见。王赞等[59]以沙门氏菌invA基因为目的基因设计特异性引物，优化建立HDA 反应体系，扩增产物进行电泳检测，可直接快速检测发酵乳中沙门氏菌污染，检出限为2.6×102CFU/g，该方法灵敏度高、特异性良好，但在简单性和高通量检测方面仍有不足；Du 等[60]首次将依赖嗜热解旋酶恒温扩增（Thermophilic helicase-dependent amplification，tHDA）和免疫层析试纸相结合用于沙门氏菌检测，正向引物5’端用地高辛修饰，反向引物5’端用生物素修饰，在引物浓度85 nmol/L，反应温度64 ℃，MgSO4浓度3.5 mmol/L，dNTP 浓度0.5 mmol/L 的最优条件下进行tHDA 扩增，扩增产物利用胶体金层析试纸条可以实现可视化检测，检测限可达到3.1×101CFU/mL，和常规PCR法相比有效简化了检测步骤。

图8 HDA 反应原理[57]Fig.8 HDA reaction principle[57]

综上，将等温核酸扩增技术和侧流层析试纸条技术相结合，已成功应用于各种食源性致病菌的快速检测中，具有检测成本低、精密度高、定量快、可实现现场快速检测等优点，推广应用潜力大。相比于PCR 法，等温核酸扩增技术对温度的要求及检测成本都有所降低，不同的等温核酸扩增技术结合免疫层析试纸条的效果也有所不同。LAMP-层析试纸在食源性致病菌中的应用最广泛，但与普通胶体金层析试纸条结合应用时，存在标记物稳定性差、易受外界干扰等缺点，将其与纳米酶为标记物的层析试纸结合，可提高其检测稳定性，还可以通过催化作用增强显色信号，进一步提高灵敏度，具有很大发展潜力。在食源性致病菌多重LAMP 检测体系中，多对引物存在容易导致引物之间的交叉反应，多重LAMP-层析试纸检测特异性有待提升；RPA-层析试纸则更适合进行多核酸扩增，常用作多种菌的同时检测，检测效率高；CPA-层析试纸能够实现快速靶扩增，检测特异性高；RCA-层析试纸及HDA-层析试纸在引物设计方面相对简单，但目前应用于食源性致病菌的研究还较少，在未来可以为食源性致病菌的检测提供更加准确、高通量检测平台。

3 基于CRISPR/Cas-侧流层析试纸法

CRISPR-Cas 是细菌体内基于RNA 介导的核酸酶切割清除外源核酸的适应性免疫防御系统，CRISPR 阵列由一串重复DNA 序列和一个间隔序列组成，主要包括适应、表达、干扰3 个阶段，在表达过程中会产生多种Cas 蛋白，通过Cas 核酸酶实现对外源核酸的切割，从而达到防御目的[61]。基于CRISPR-Cas 系统具有识别和切割特定核酸序列的特点，不仅可以进行高效地基因编辑，还可以进行基因检测，特别是Cas3、Cas12、Cas13 和Cas14 蛋白的反式切割活性的发现[62]，将CRISPR/Cas 系统和等温核酸扩增、侧流层析试纸、比色法、荧光法、电化学法等技术相结合开发了许多高灵敏、快速、可视化检测方法[63]，其中CRISPR/Cas 系统和侧流层析试纸的结合应用最为引人瞩目，成为近年来病原菌检测领域的研究热点，为食源性致病菌检测提供了新的思路。

病原菌核酸检测中常用的Cas 核酸酶主要包括两类：一类是可以切割RNA 链的Cas13a 和Cas13b；一类是可以切割DNA 链的Cas12a 和Cas14。Cas12a和Cas13 除了切割靶向核酸序列之外，还可以切割其他核酸序列，利用这种附加核酸酶特性，结合PCR 或等温核酸扩增技术实现病原菌核酸快速检测，而可以切割双链DNA 的主要是CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas9 系统，和试纸条结合实现检测结果呈现如图9 所示，报告探针标记和试纸条上T 线、C 线的标记类似于PCR-侧流层析试纸条法的检测原理。Mukama 等[64]报道了一种基于LAMP 和CRISPR/Cas12 系统的核酸免疫层析试纸条，实现铜绿假单胞菌酰基转移酶基因的高灵敏和高特异性检测，研究人员首先在65 ℃下LAMP 扩增靶标基因，产生的扩增片段与Cas12 特异性识别激活其反式切割活性，产生大量带有生物素标记的ssDNA；合成AuNP-链霉亲和素（Streptomyces avicllrdi，SA）探针并固定在试纸条的金标垫上，试纸条T 线上固定ssDNA 的互补系列，生物素标记的抗体固定在C 线上，当靶标DNA 存在时，AuNP-SA 探针和生物素标记的ssDNA 首先形成AuNP-SA-biotin-ssDNA 探针，修饰ssDNA 互补系列的T 线捕获上述探针，多余的AuNP-SA 探针与C 线上的生物素结合，T、C 线同时显色；而没有靶标DNA 时不会产生ssDNA 片段，T 线不显色，AuNP-SA 探针直接和C 线上生物素结合而显色。该方法检测快速、成本低，在纯样品和复杂样品中均可检测低至单拷贝的铜绿假单胞菌酰基转移酶基因，抗基质干扰能力强。另外，为降低检测成本，Zhou 等[65]以荧光量子点为信号探针标记链霉亲和素，设计生物素-核酸探针与试纸条T 线上固定的捕获探针互补识别，C 线上固定牛血清白蛋白（BSA）修饰的生物素探针，基于RAA 结合CRISPR/Cas12a 系统，开发出一种新型荧光增强免疫层析试纸条，当存在靶DNA 时，RAA 产生的扩增产物激活Cas12a 的反式切割活性，使得体系中的生物素-核酸探针被降解，无法和T 线上的捕获探针形成互补，T 线上没有荧光信号；反之，当没有靶DNA 时，生物素-核酸探针和T 线上的捕获探针形成互补，再通过链霉亲和素和生物素作用将量子点截留在T 线产生荧光信号，所研制的试纸条对金黄色葡萄球菌基因组DNA 的检测限低至75 amol/L，对培养液中金黄色葡萄球菌的检测限为5.4×102CFU/mL，实现金黄色葡萄球菌的快速高效检测。

图9 CRISPR/Cas-层析试纸检测食源性致病菌原理图[64,67]Fig.9 Principle diagram of CRISPR/Cas-chromatographic strip for detecting foodborne pathogens[64,67]

和Cas12 和Cas13 蛋白反式切割活性不同，CRISPR/Cas9 系统是由RNA 引导的内切酶，通过顺式切割完成对靶序列的识别及切割，且Cas9 蛋白的脱靶率低、细胞毒性低、靶向能力更强[66]。Wang等[67]以CRISPR/Cas9 系统被特异性靶标识别激活后产生的非靶向单链作为探针杂交的模板，设计和构建了一种新的金标核酸试纸条技术，实现1 h 内对靶基因高灵敏、高特异的裸眼可视化检测。如图9b所示，该检测方法首先设计并制备了两种AuNPDNA 探针，其DNA 序列包含一个标记区、一个核酸杂交区和一个信号探针杂交区。使用生物素化引物对基因组样品进行RPA 扩增，将生物素化的扩增产物与Cas9/sgRNA1 短暂孵育结合，当有靶标DNA存在时，生成的生物素化扩增产物-Cas9/sgRNA1 复合物滴加到试纸条上，随着毛细管作用在试纸条上进行迁移，当到达金标结合垫时，和其上标记的AuNPDNA 探针通过核酸杂交形成Cas9/sgRNA1-生物素化扩增产物-AuNP-DNA 探针复合物，流经T 线时被预先包被的链霉亲和素通过生物素-亲和素作用捕获，T 线产生红色色带；多余的AuNP-DNA 探针在C 线上和预包被的DNA 探针杂交而被捕获，C 线显色；当不存在靶标DNA 时，只有C 线显色而T 线不显色。相较于普通免疫层析试纸法，CRISPR/Cas9-层析试纸在使用特异性引物进行基因扩增后，采用专门设计的Cas9/sgRNA 系统进行二次识别，可以消除扩增反应产生的引物二聚体的干扰，使得CRISPR/Cas9-层析试纸在保持高灵敏度的同时还具有高特异性，几乎不会出现背景信号干扰，因此即使在检测非常低浓度的目标物时，也可以辨别检测结果。

CRISPR/Cas 系统同侧流层析技术的结合，呈现出高灵敏度、高特异性的特点，目前检测食源性致病菌主要利用CRISPR/Cas12 和CRISPR/Cas9 系统，CRISPR/Cas12 因其反式切割活性和精确的靶向功能，在CRISPR/Cas-侧流层析试纸中得到广泛应用。CRISPR/Cas9 相较于CRISPR/Cas12 可以缩短检测步骤，更适合开发多功能的基因检测平台。CRISPR/Cas-侧流层析试纸在核酸诊断领域仍处于初级阶段，还面临许多挑战，如CRISPR/Cas 系统均需预先扩增靶标核酸，操作步骤较为繁琐；反式切割活性具有随意性，对实现定量和多重检测的难度较大；现有Cas 蛋白大部分依赖于前间隔序列邻近基序序列发挥作用，对靶标序列的选择受到限制等。为解决上述问题，CRISPR/Cas-侧流层析试纸将会通过丰富Cas 蛋白种类、结合微流控单细胞富集等技术来提高其自动化程度，朝着更加智能化、便携化发展。

4 结论

食源性致病菌是引发食源性疾病的重要原因，控制食源性致病菌、保障食品安全离不开快速检测技术的发展。基于核酸扩增的检测技术在食源性致病菌检测中发挥着重要作用。PCR 仍是目前食源性致病菌检测中最成熟的技术，等温核酸扩增技术在微生物检测中日趋成熟，弥补了PCR 对应用场景和仪器的依赖，具有检测快速、灵敏、便捷等特点，尤其适合在基层或偏远地区进行现场快速检测，是食源性致病菌核酸检测领域发展的主要方向。但和PCR 相比，等温核酸扩增引物设计复杂、难度大，缺乏相应的设计软件，需要筛选优化合理引物，且更容易因气溶胶污染导致出现假阳性结果，检测灵敏度和荧光定量PCR 相比仍有一定差距。等温核酸扩增与CRISPR/Cas 系统结合可实现检测信号二次放大，有效提升检测灵敏度，在食源性致病菌快速检测方面得到了一些应用，但主要针对单一致病菌，需要和多重核酸扩增技术、多重层析试纸技术结合来提高检测通量，实现多目标联合检测。

基于核酸扩增-侧流层析试纸的食源性致病菌检测方法，以核酸杂交为识别机理，利用标记物与其抗体特异识别和层析作用在试纸条上呈现检测结果，综合了核酸检测的高灵敏性和层析试纸简单方便的特点，成为食源性致病菌快速检测领域的研究热点。随着科学技术的不断进步与发展，在实际应用驱动下，生物材料、物理科学、化学材料、医学诊断等多学科融合交叉发展，综合利用免疫识别、核酸扩增、纳米材料信号放大等方法，核酸扩增-层析试纸检测食源性致病菌将会向更灵敏、更便利、多元化、高通量检测的方向不断提升与完善，推动食源性致病菌可视化现场检测的进一步发展。