盈江大理茶种与凤庆大叶种芽茶香气差异分析

李国萍，李家锋，朱海燕,

（1.湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南长沙 410128；2.湖南农业大学园艺学院，湖南长沙 410128）

盈江县野生茶资源丰富，境内具有饮用价值的野生茶属云南大理种。目前，共发现了12 个具有代表性的野生茶树居群，涵盖面积12.695 万亩，有野生茶树39.35 万株左右，是德宏州内野生茶树分布面积最大的县市[1-2]。近年来，随着茶行业的蓬勃发展，云南省的大理茶种也迎来了良好的发展前景，盈江县野生茶优越的环境和优良的品质得到了市场的认可，当地野生古茶树资源的合理开发利用已成为当务之急。

茶叶香气物质的差异及成茶品类的香型与茶树品种密切相关[3]。艾安涛等[4]分析了3 个品种加工制作成的遵义红茶，研究认为金牡丹制成的“遵义红”品质最佳；汤海昆等[5]分析了10 个不同茶树品种晒红茶的香气成分，为晒红茶筛选适制茶树品种提供了理论依据；徐梦婷等[6]对5 个茶树品种的工夫红茶挥发性成分进行分析，并筛选出了关键呈香物质；李金龙等[7]研究了斯里兰卡红碎茶与滇红碎茶香气成分及含量，探明了两地红碎茶差异的主要香气成分；林燕萍等[8]的研究结果表明，以梅占品种所制的红茶香气呈甜花香，梅占白茶香气呈清花香。诸多研究皆表明：茶树品种影响茶叶香气[9]，香气研究对品种的适制筛选和开发利用具有重要意义。但当前鲜有针对大理茶种挥发性化合物及有关大理茶种芽孢茶挥发性化合物的研究。

本研究以盈江县大理茶种代表性样品（芽孢红茶和芽孢白茶），以云南省凤庆大叶种代表性样品（凤庆红茶和凤庆白茶）为对照，采用全自动HS-SPMEGC-MS 分析各茶样的挥发性成分，结合感官审评方法对茶样冲泡后的香气进行描述分析，采用PCA、OPLS-DA 和OAV 比较分析样品的香气成分差异和主要香气贡献物质，为盈江大理茶种芽孢茶挥发性代谢物的进一步研究和该地野生古茶树的资源开发和利用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

以云南省盈江县勐弄乡龙门寨野生茶居群的，大理茶种野生古茶树为供试组材料，以云南省凤庆县凤庆大叶种为对照进行实验；氯化钠 中国国药集团；正己烷（纯度＞95%）德国Merck 公司；3-己酮（纯度＞95%）美国密苏里州西格玛-奥尔德里奇公司。

8890-7000D GC-MS、DB-5MS 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、120 μm DVB/CWR/ PDMS 萃取头 Agilent Technologies Inc；MM400 球磨仪Retsch；MS105DU 电子天平 Mettler Toledo；SPME Arrow 固相微萃取装置、Fiber Conditioning Station 老化装置、Agitator 样品加热箱 CTC Analytics AG。

1.2 实验方法

1.2.1 茶样制备 取大理茶种野生古茶树的芽头，分别制作成代表性样品芽孢红茶（以下简称芽孢红，YBH）和芽孢白茶（以下简称芽孢白，YBB）；以近似纬度（北纬24°）凤庆大叶种制成的红茶（以下简称凤庆红，FQH）和白茶（以下简称凤庆白，FQB）为对照，样品均于2023 年3 月按单芽标准进行采摘制作。实验茶样见图1。对茶样进行液氮速冻后置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.2.2 感官审评方法 按照GB/T 23776-2018《茶叶感官审评方法》和GB/T 14487《茶叶感官审评术语》，由湖南农业大学6 名经验丰富的评茶员采用密码审评的方式进行感官审评并评分。

1.2.3 样品前处理 从-80 ℃冰箱中取出样品进行液氮研磨，涡旋混合均匀，每个样本称取约500 mg（液体1 mL）于顶空瓶中，分别加入饱和氯化钠溶液，10 μL（50 μg/mL）内标溶液，全自动顶空固相微萃取HS-SPME 对样本进行萃取，以供GC-MS 分析。每个样品重复测定3 次[10]。在分析过程中，每10 个检测分析样本中插入一个质控样本，以监测分析过程的重复性。

1.2.4 HS-SPME 萃取 HS-SPME 萃取条件：在60 ℃恒温条件下，震荡5 min，120 µm DVB/CWR/PDMS萃取头插入样品顶空瓶，顶空萃取15 min，于250 ℃下解析5 min，然后进行GC-MS 分离鉴定。采样前萃取头在Fiber Conditioning Station 中250 ℃下老化5 min[11]。

1.2.5 GC-MS 分析方法 色谱条件：DB-5MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent J&W Scientific，Folsom，CA，USA），载气为高纯氦气（纯度不小于99.999%），恒流流速1.2 mL/min，进样口温度250 ℃，不分流进样，溶剂延迟3.5 min。程序升温：40 ℃保持3.5 min，以10 ℃/min 升至100 ℃，再以7 ℃/min 升至180 ℃，最后以25 ℃/min 升至280 ℃，保持5 min。

质谱条件：电子轰击离子源（EI），离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，质谱接口温度280 ℃，电子能量70 eV，扫描方式为选择离子检测模式（SIM），定性定量离子精准扫描[12]。

1.3 数据处理

以MassHunter 软件处理质谱分析后的下机原始数据，用于定性定量分析。通过迈维（武汉）生物技术有限公司自建数据库和公共数据库对代谢物进行鉴定。包含确定的RT 以及定性定量离子进行选择离子检测模式进行精准扫描，每种化合物分别选择1 个定量离子，2～3 个定性离子。每组所有需要检测的离子按照出峰顺序，分时段分别检测，如果检出的保留时间与标准参考相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，判定为该物质[13]。采用内标法（内标为3-己酮（10 μL，50 μg/mL））对其进行相对定量，选择定量离子进行积分和校正工作，增强定量的准确性。气味活度值（OAV）指某香气物质成分的质量浓度与其气味阈值的比值，计算公式为[14-15]：

式中：C 为香气成分的质量浓度，μg/kg；OT 为该香气成分的气味阈值，μg/kg。

OAV＞1，则某挥发性成分对整体香气有一定影响，OAV 数值与其对整体香气的贡献呈正比。

用Excel Office 2019、IBM SPSS Statistics 26（IBM，美国）进行数据处理。以峰面积归一法对4 个茶样YBH、FQH、YBB、FQB 的挥发性代谢物进行比较分析。对鉴定的挥发性代谢物进行多元统计分析以初步探析4 个茶样的挥发性代谢物特征，以R软件（https://www.r-project.org/）对鉴定的挥发性代谢产物进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）。根据正交偏最小二乘法判别分析模型（OPLS-DA）获得的变量重要性投影（Variable importance in projection，VIP）评分，将VIP＞1，差异倍数（Fold change，FC）值大于等于2 或小于等于0.5 的挥发性代谢物定义为差异代谢物（Significant changed metabolites，SCMs）。

2 结果与分析

2.1 感官品质特征分析

盈江大理茶种芽孢茶和凤庆大叶种的审评结果（表1）表明：大理茶种芽孢茶制成的红茶、白茶综合评分均高于对照组凤庆大叶种。两个品种的红茶对比中，YBH 的香气和滋味评分明显高于FQH，YBH以果蜜香和花草香为主，滋味甜醇带果香，FQH 香气以甜花香为主，滋味醇厚，但二者在外形上的得分差异最小。两个品种的白茶对比中，YBB 的香气和滋味评分也高于FQB，YBB 香气主要为自然清花香，滋味鲜甜带花香，FQB 香气则主要为毫香，滋味鲜淡带毫香，但二者在外形项得分差异最小。总的来说，大理茶种芽茶的各项评分均高于90，且单项评分和综合评分均高于对照样凤庆大叶种芽茶，说明芽孢茶具有较优的感官品质特征。在4 个茶样中，YBH 的香气馥郁，获得香气最高评分，明显优于对照品种FQH，可见芽孢茶的独特香气值得进一步研究。

表1 4 个茶样感官审评结果Table 1 Sensory evaluation results of four tea samples

2.2 盈江大理茶种和凤庆大叶种挥发性香气成分组成分析

通过广泛靶向代谢组学分析4 个茶样，共检测出616 种挥发性化合物，如表2 所示，4 个茶样的醇类挥发性化合物含量均较高。在本研究中，YBH 的萜类挥发性代谢物相对含量显著（P＜0.05）高于其他三个对比茶样，与对照样FQH 的差异性最大，综合呈现出“木质香”和“药草香”；在芳烃和醛类挥发性代谢物的对比上FQH 的相对含量较YBH 高，综合呈现火工香、清香、花香。YBB 呈花香、甜香的醇类和酮类挥发性代谢物含量高于对照茶样；FQB 与YBB 在杂环类化合物相对含量上的差异最大，主要呈花香[16-17]。

表2 4 个茶样的挥发性代谢化合物数量和相对含量Table 2 Quantity and relative content of volatile metabolic compounds in four tea samples

2.3 盈江大理茶种和凤庆大叶种差异香气物质分析

2.3.1 盈江大理茶种和凤庆大叶种挥发性化合物的PCA 和OPLS-DA 分析 本研究结合单变量统计分析（差异倍数，FC）、多变量统计分析（PCA、OPLSDA）和气味活度值（OAV）评估的方法，探究各茶样挥发性代谢物的差异。PCA 是一种用于无监督模式识别的多维统计分析方法。本研究的PCA 得分图（图2）显示，两个主成分（PC1 和PC2）贡献率分别为47.05%和34.35%，4 个茶样分离趋势明显，说明以盈江大理茶种制成的红茶和白茶与近似纬度凤庆大叶种制成的红茶和白茶的香气组成存在较大差异。

图2 4 个茶样香气化合物PCA 分析Fig.2 PCA analysis of four tea aroma compounds

为进一步探讨盈江大理茶种和凤庆大叶种的差异香气成分，通过有监督模式识别的多变量统计分析方法—OPLS-DA 模型（生物学重复≥3）得到变量重要性投影（VIP）。OPLS-DA 评价模型的预测参数中，R2X 和R2Y 分别表示所建模型对X 和Y 矩阵的解释率，Q2表示模型的预测能力，这三个指标越接近于1 时表示模型越稳定可靠。OPLS-DA 评分图（图3A）显示，4 个茶样的香气物质存在显著（P＜0.05）差异（图3B），在聚类热图上也明显分为4 组（图3 C），由图3D 可知，Q2为0.995，R2X 为0.809，R2Y 为0.998，P＜0.05，说明模型可靠，可根据VIP 值分析筛选不同样品之间的挥发性差异代谢物。

图3 4 个茶样的OPLS-DA 分析及挥发性代谢物聚类热图Fig.3 OPLS-DA analysis and volatile metabolite clustering heat map of four tea samples

2.3.2 芽孢红茶与凤庆红茶特征差异化合物分析在YBH 与FQH 的对照中，基于OPLS-DA 判别模型，结合变量重要性投影VIP＞1、FC≥2 或≤0.5 且P＜0.05 的条件筛选到86 种（49 个上调，37 个下调）差异挥发性代谢物，整理为表3。

表3 FQH vs YBH 主要特征差异代谢物统计Table 3 Metabolite statistics of FQH vs YBH main characteristic differences

与FQH 相比，8 种主要特征差异物质仅存在于YBH。分别为5 种萜类物质（R）-β-希马赫勒烯、顺式-α-甜没药烯、α-衣兰油烯、古巴烯、α-柏木烯，强烈果香的酯类物质（E）-2-甲基-2-丁烯酸苯甲酯，以及醇类物质顺-2-异丙烯基-1-甲基环丁基乙醇，和醛类物质4-（1-甲基乙烯基）-1-环己烯-1-甲醛，主要贡献了清新偏木质香草和甜香的香气特征，推测是形成YBH 花草偏木质甜果香气的贡献挥发性化合物。此外，YBH 的挥发性代谢物胡椒酮1-氧化物、（Z）-癸-2-烯醛、乙酸芳樟酯、3-甲氧基-苯甲醛、姜烯、α-松油醇等物质的相对含量显著高于FQH，综合呈现出强烈的花果香和香草香。

2.3.3 芽孢白茶与凤庆白茶特征差异化合物分析在YBB 与FQB 的对照中，基于OPLS-DA 判别模型，结合变量重要性投影VIP＞1、FC≥2 或≤0.5 且P＜0.05 的条件筛选到89 种（上调31 种，下调58 种）主要特征差异挥发性代谢物，整理为表4。

表4 FQB vs YBB 主要特征差异代谢物统计Table 4 Metabolite statistics of FQB vs YBB main characteristic differences

根据表4 可知，与FQB 相比，3 种主要特征差异挥发性化合物，即醇类物质3-甲氧基苄醇、呈花香的萜类物质α-紫罗兰酮和呈清香的醛类物质（E）-2-己烯醛仅存在于YBB 中。与FQB 相比，YBB 呈清花香的胡椒酮1-氧化物、（Z）-癸-2-烯醛、己酸、乙酸芳樟酯、水杨酸甲酯（薄荷）、柠檬醛等物质相对含量较高，综合香气呈现与YBB 的感官审评结果相符。

2.3.4 盈江大理茶种和凤庆大叶种主要特征差异代谢物的OAV 分析 在一定范围内，总体气味的呈现与组分的OAV 值呈正比[26]。计算4 个茶样的主要特征差异挥发性化合物的OAV，共发现10 种对香气呈现存在贡献（OAV＞1）的主要特征差异物质（表5），分为萜类、醛类、酯类和醇类物质。盈江县大理茶种芽孢茶中，（Z）-癸-2-烯醛和香叶醇的OAV 值较凤庆大叶种茶高，主要呈甜花香，其中（Z）-癸-2-烯醛的OAV 高于100，认为是大理茶种芽孢茶的关键香气成分；凤庆大叶种中的苯甲醛、苯乙醛和β-紫罗兰酮OAV 值较芽孢茶高，主要呈蜜香和花果香[27]，其中，β-紫罗兰酮的OAV 大于10，说明其对凤庆大叶种的香气呈现有重要作用[16]。在红茶对比组中，YBH 的（Z）-癸-2-烯醛、大马士酮以及香叶醇OAV 值较FQH 高，这些物质主要贡献了强烈的花香和果香，其中大马士酮仅在YBH 存在贡献（OAV＞1），推测是YBH 产生浓郁花香的关键物质；在白茶对比组中，YBB 的（Z）-癸-2-烯醛、己酸、水杨酸甲酯、乙酸芳樟酯、香叶醇和2-苯乙醇的OAV 值较FQB 高，综合呈清香和花香，其中己酸和乙酸芳樟酯的OAV 值大于10，可认为此二者对茶叶整体的气味贡献极大，可能是YBB 呈自然清花香的主要物质。

表5 4 个茶样OAV＞1 的挥发性物质Table 5 Volatile substances with OAV＞1 in four tea samples

3 讨论与结论

茶叶中芳香物质的组成与浓度影响成茶香型。本研究在4 个茶样中共鉴定出616 种挥发性化合物，YBH、FQH、YBB 和FQB 的挥发性代谢物相对含量分别以萜类、醛类、醇类和杂环化合物的占比最高。通过对两个云南品种进行香气差异分析，发现红茶对比组中以萜类、酯类和醛类物质居多，（E）-2-甲基-2-丁烯酸苯甲酯、α-衣兰油烯、α-柏木烯、古巴烯和4-（1-甲基乙烯基）-1-环己烯-1-甲醛等呈香草和木质香的物质，对YBH 花果香和木质香草气可能存在重要贡献。在两个云南品种的白茶对比组中，特征差异化合物主要为醛类、萜类、醇类物质，与张晓珊等[31]对云南白茶的香气成分研究结果相近，呈花果香的α-紫罗兰酮，呈清香（E）-2-己烯醛，或为形成YBB 独特香气的关键物质。此外，挥发性化合物胡椒酮1-氧化物，在芽孢茶中的相对含量均高于对照凤庆大叶种，推测其作用于芽孢茶特殊香气的形成。

在4 个茶样的主要特征差异化合物中筛选出10 个OAV＞1 的关键香气物质，发现（Z）-癸-2-烯醛和香叶醇对芽孢茶的香气贡献较大，β-紫罗兰酮对凤庆大叶种的香气贡献较大，与汤海昆等[5]对云南不同品种红茶香气成分的研究相近。大马士酮于1970年首次在保加利亚玫瑰油中发现，是类胡萝卜素降解产物中常见的芳香化合物[32]，推测具有强烈花果香气[33]的大马士酮为YBH 花果香的贡献物质；己酸（清花香）和乙酸芳樟酯（甜的木质清新果香）可能为YBB 呈“自然清花香”的重要贡献香气物质。此外，呈花蜜香的2-苯乙醇仅在YBB 的香气中存在一定的贡献，对YBH 的香气不产生主要贡献。

本研究发现大理茶种芽孢茶较凤庆大叶种芽茶的香气成分更为丰富，且芽孢茶制成红茶香气更佳，后续可增加不同产地、不同季节以及不同加工工艺的芽孢茶鲜叶及成品茶的横向对比研究，结合GCO 技术、电子鼻、香气的重组和缺失实验等研究方法，探究不同地区大理茶种芽孢茶的香气组成，进一步确定形成芽孢茶香气的重要物质，从而为大理茶种的香气组成研究和大理茶种野生古树茶的适制性和资源开发提供参考。