基于电子鼻和气质联用分析萌芽大蒜挥发性物质差异

韩 颖，易宇文, ，何 莲，邓 静，胡金祥，吴华昌，石莉芳，杨会珍

（1.四川旅游学院，四川成都 610100；2.四川川娃子食品有限公司，四川眉山 620000）

大蒜是百合科葱属植物蒜（Allium sativumLinn.）鳞茎的统称。大蒜发源于欧洲，广泛种植于地中海及其附近区域。汉使张骞将大蒜从西域引种至中原地区，而后在我国关中地区得到广泛栽培和传播，逐步遍及全国。大蒜性温、味辛辣，具有抗氧化[1]、抗癌[2]、消炎杀菌[3]等功效。目前对大蒜的研究主要集中在药用[4]、调味品[5]等领域。近年来也有较多研究人员研究加工方式对大蒜挥发性物质的影响[6-8]。而对萌芽期大蒜挥发性物质的变化鲜有报道。

有研究表明植物种子在萌芽期其营养价值、挥发性物质均有变化[9-11]。明确萌芽大蒜挥发性物质的变化，对于大蒜的食用价值具有重要意义。电子鼻是一种模拟人类生理嗅觉的智能仿生仪器，其样品前处理具有方便快捷、无损环保等优点；传感器数据结合数据模型能实现检测结果的可视化，且检测结果重现性好。但电子鼻仅能对样品的气味轮廓进行区分，无法判断差异的具体物质[12]。捕集阱自动顶空（Trap head space）具有样品处理简单，气味物质自动萃取、富集和进样，方便快捷等特点。气相色谱质谱联用仪（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）是分离、鉴定复杂有机物的有效工具[13]。电子鼻和GC-MS 在萌芽种子整体气味轮廓及具体物质的鉴定领域有广泛应用。陆晨浩等[14]利用GC-MS 结合电子感官技术发现发芽3 d 的黑麦茶香气与未发芽的差异明显。仲梦涵等[15]利用GC-MS 结合智能感官发现相较于烘烤未发芽大麦，烘烤发芽第一天大麦的风味具有明显变化。另外，正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）是一种有监督的分析方法，其通过去除变量的数据变异，将分离信息集中在一个主成分中，使模型变得简单且易于解释。

本研究以不同萌芽期的大蒜为研究对象，采用电子鼻、HS-Trap-GC-MS 技术结合OPLS-DA、香气活度值、差异性热图、相关性分析识别不同萌芽期大蒜整体气味轮廓，鉴定萌芽大蒜挥发性物质，分析萌芽大蒜主要挥发性物质及差异，探究萌芽大蒜关键香气化合物，旨在比较不同萌芽时间的大蒜挥发性物质的异同，探明不同萌芽时间大蒜挥发性物质的变化规律，为萌芽大蒜在食品、医药领域的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原料 紫皮大蒜（产地：四川雅安），于2022 年10 月1 日购于龙泉驿永辉超市。

FOX 4000 电子鼻 Alpha MOS 公司；Clarus 680气相色谱仪、Elite-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）色谱柱、Clarus SQ8T 质谱仪、HST40 捕集阱顶空进样器 美国珀金埃尔默；HSP-BE 恒温恒湿培养箱力辰科技。

1.2 实验方法

1.2.1 大蒜萌发条件与样品处理 将大蒜去皮，然后测量长度，选择长度一致的大蒜进行萌芽实验。将大蒜用纱布包裹放入恒温恒湿培养箱（22±2 ℃，湿度75%±2%，无光照）萌芽[16-17]0、24、48、72、96 h。萌芽结束的样品放入5 ℃的冰箱冷藏室，分别编号为A（参照，不萌芽）、B、C、D、E，分组进行检测（不检测的样品置于冰箱冷冻室冷冻，避免大蒜在酶的作用下继续发生生化反应）。

1.2.2 电子鼻检测方法 准确称取剁碎的大蒜1.0 g，装入电子鼻专用瓶密封，待测。样品孵化条件：50 ℃孵化5 min；进样量：500 μL；进样速度500 μL/s；分析时间：120 s；检测器清洁时间180 s；取传感器在120 s 时的稳定值作为检测结果进行分析。每个样品平行检测30 次，取10 次稳定值（主成分分析的集中程度）作为检测数据，进行分析。

1.2.3 GC-MS 检测方法 准确称取4.0 g，装入GCMS 专用顶空瓶，放入自动进样器，待测。每个样品各装5 瓶，检测5 次。

萃取温度50 ℃，进样针55 ℃，传输线60 ℃，萃取20 min；干吹2 min，解析0.1 min，加压/释压2 min；捕集阱保持4 min；捕集阱循环2 次。

GC 条件：载气（氦气99.999%）流速1 mL/min，分流比15:1。进样口温度：250 ℃；升温程序：40 ℃，保留2 mim，以2 ℃/min 升温至170 ℃，保留5 min，以10 ℃/min 升温至250 ℃，保留1 min。

MS 条件：EI 离子源，电子轰击能量为70 eV，离子源温度230 ℃；全扫描；质量扫描范围：45～450 m/z；扫描延迟66 s。

定性分析：挥发性成分的定性以检索NIST 2011 谱库，选取正反匹配均大于700，同时与文献值进行比对和结合人工解析质谱图进行确定。

检测结果有效性选择：每个样品检测5 次，仅取3 次及以上能检测到的物质，作为有效结果进行数据分析。

定量分析：峰面积归一化法，计算相对百分含量。

1.2.4 关键香气化合物分析 参考刘登勇等[18]的方法计算香气活性值（Odor activity value，OAV）：

式中：C—挥发性物质的相对含量（%）；T—该挥发性物质的气味阈值（μg/kg）。

参照刘登勇等[18]的研究结果规定OAV 最大的香气化合物其相对香气活性值（Relative odor activity value，ROAV）为100，其他挥发性物质的ROAV计算如下：

式中：Ci—挥发性物质的相对含量（%）；Ti—该挥发性物质的气味阈值（μg/kg）；Tmax—OAV 最大的化合物的阈值（μg/kg）；Cmax—OAV 最大的化合物的相对含量（%）。

一般认为ROAV≥1 的化合物对样品整体气味有重要贡献，是关键化合物；0.1≤ROAV＜1 的化合物为修饰性物质；ROAV＜0.1 的化合物对样品整体风味无贡献，是潜在性气味化合物[19]。

1.3 数据处理

电子鼻雷达图、差异性热图、相关性分析、数据归一化处理及制图采用Origin 2021。SIMCA 14.1软件进行电子鼻OPLS-DA、计算预测变量重要性投影（Variable importance in projection，VIP）。SPSS 25 计算化合物平均值及标准偏差（）。

2 结果与分析

2.1 萌芽前后大蒜长度的变化

表1 是大蒜萌芽前后蒜体长度变化结果。表中可以看出蒜体增加的长度随萌芽时间的延长而增加，其中萌芽48～72 h 是跃变时间段，其增长率从5.92%跃变为12.80%。从蒜体萌芽后长度的标准偏差来看，在同一萌芽时间段内的大蒜增加的长度变化很小。这说明在相同条件下大蒜的萌芽程度相似。

表1 萌芽前后大蒜长度变化Table 1 Changes in garlic length before and after sprouted

2.2 电子鼻分析结果

图1 是以电子鼻传感器平均值制作的雷达图，图中可以看出样品分成3 组：A、B；C；D、E。A 和B 样品在气味上相似度高，且在大多数传感器响应值明显高于C、E 和D。有研究表明电子鼻传感器响应值越高，说明其气味越浓郁[20]。D 和E 样品在气味上相似度高，其在大多数传感器上的响应值较A、B、C 的样品低。这说明随着发芽时间延长，其气味越寡淡。

图1 电子鼻分析雷达图Fig.1 Electronic nose radar chart

图2A 是样品经电子鼻检测结合OPLS-DA 模型分析的散点图。图中可以看出，电子鼻检测A、B 样品的结果投影在二维坐标中的数据点互相交叉，说明A、B 样品极为相似。C 样品分布在A、B 与D、E 样品之间，说明萌芽48 h 的样品C 与A、B 和D、E 样品差异明显。D、E 样品分布在二、三象限，说明72 h 和96 h 的样品在气味上有差异。5 个样品除A、B 外，其他3 个样品均相对独立的分布在二维图中的二、三象限，这说明A、B 相似度高，C、D、E 差异明显。样品在二维图中的分布既能说明样品之间的相似度，也能说明电子鼻能有效区分样品且重复性好。5 个样品自变量拟合指数R2X=0.999，因变量指数R2Y=0.971；模型预测指数Q2=0.960，其预测能力为96.000%。一般认为自变量和因变量拟合指数大于0.5 即可接受[21]。

图2 电子鼻OPLS-DA 分析（A）、模型交叉验证结果（B）Fig.2 Results of electronic nose OPLS-DA analysis (A) and model cross validation (B)

图2B 是判别模型经过200 次（最大999）置换检验的结果。图中，R2为0.991，截距为-0.003，Q2为0.985，截距为-0.358，这说明模型拟合效果好，模型验证有效。一般认为截距小于0 时，统计模型拟合效果好，没有过拟合[22]。

2.3 GC-MS 结果

为从化合物角度探究萌芽大蒜挥发性物质的差异，实验对不同萌芽时间的大蒜进行GC-MS 分析，定性及定量检测结果见表2，分类见表3。A、B、C、D、E 5 个样品分别检测出17、41、40、39、39 种挥发性物质，共65 种，包括含硫化合物31 种、醛类物质13 种、醇类8 种，其他13 种，未萌芽的样品仅检测到含硫化合物和醛类物质；5 个样品相对含量分别为95.36%、96.93%、94.89%、94.28%、95.37%，以含硫化合物为主。5 个样品共有物质12 种（11 种含硫化合物+1 种醛类物质）：烯丙硫醇、烯丙基甲基硫醚、二甲基二硫醚、二烯丙基硫醚、3,4-二甲基噻吩、丙基烯丙基硫醚、烯丙基甲基二硫醚、2,3-二甲基噻吩、二甲基三硫、二烯丙基二硫醚、二烯丙基四硫醚、（E）-丁-2-烯醛。这些被检测到的物质、种类、含量及共有物质的差异，初步反映了未萌芽和萌芽大蒜挥发性物质的差异。

表2 萌芽大蒜挥发性物质分析Table 2 Analysis of volatile substances in sprouted garlic

表3 萌芽大蒜挥发性物质种类及相对含量Table 3 Types and relative content of volatile substances in sprouted garlic

由表3 可知，含硫类化合物是大蒜的主要挥发性物质，其整体相对含量随萌芽时间的延长而呈下降趋势，其种类则呈递增趋势。醛类物质含量低、种类不多，其相对含量和种类均随萌芽时间的延长而呈递增趋势。A 样品未检测到醇类物质，但在B、C、D、E 中均检测醇类物质，其相对含量和种类变化趋势大致随萌芽时间的延长而呈递增关系（D 样品的含量除外）。A 样品未检测到其他类物质，B、C、D、E 均有其他类物质被检测到，其相对含量呈现出先增加后降低的趋势，物质种类呈递减趋势。

由表2、表3 可知，大蒜主要挥发性物质是含硫类化合物。大蒜的辛辣刺激味主要源于二烯丙基二硫醚，二烯丙基硫醚，二烯丙基三硫醚，二烯丙基四硫醚、烯丙硫醇等含硫化合物。这些物质是大蒜组织受到破坏时蒜氨酸在蒜氨酸酶的作用下生成了次磺酸和大蒜素等物质，这些物质进一步分解成了硫醚类物质[23-24]。大蒜素的分解转化如图3[23-24]：

图3 大蒜素的分解转化Fig.3 Decomposition and transformation of allicin

二烯丙基二硫醚、二烯丙基硫醚（蒜香）、二烯丙基四硫醚、烯丙基甲基二硫醚、二甲基二硫醚、烯丙基甲基硫醚是萌芽大蒜的主要共有挥发性物质，均属于链状含硫化合物，是样品中含量较高（＞2.50%）的物质。二烯丙基二硫醚是大蒜素降解的主要产物[25]，具有辛辣刺激的大蒜气味，具有抑制镰孢菌生长和孢子萌发能力和预防心血管疾病、抗肿瘤及抗氧化等多种生理活性功能[26-28]；A、B、C、D、E 相对含量分别为49.03%、38.13%、20.28%、18.17%、19.44%，其含量随着萌芽时间的延长而呈下降趋势，其可能是烯丙基硫醚类化合物中不稳定的C-S 键断裂，形成丙烯基自由基和烷硫基。二烯丙基二硫醚是样品在萌芽过程中含量降低最多的物质。陈玲[29]的研究表明新鲜大蒜中二烯丙基二硫醚的降低是黑蒜刺激性气味降低的主要原因。二烯丙基硫醚是一种具有汽油味和生蒜味的物质，具有治疗多种类型的癌症和神经系统疾病的功效[30]；它的形成与二烯丙基二硫醚的形成类似；5 个样品的相对含量随萌芽时间的延长呈下降趋势，分别为18.87%、14.20%、15.58%、15.71%、15.24%。由此可推测萌芽大蒜的辛辣味和生蒜味可能不及未萌芽大蒜浓郁。二烯丙基四硫醚具有独特的生理活性功能[31]，其含量先上升后下降，在24 h 时含量最高（18.90%）。烯丙基甲基二硫醚具有韭菜为和蒜香味，其含量随着萌芽时间的延长而呈递增趋势（3.30%→10.00%）。烯丙基甲基硫醚具有洋葱味，其含量随萌芽时间的延长总体呈递增（2.50%→10.00%）趋势（C 样品除外）。烯丙硫醇在C、D、E 样品中含量较高（＞1.00%）。二甲基二硫醚的相对含量在A、D、E 中含量较高（＞1.00%）。主要共有含硫类物质含量大多随萌芽时间的延长而降低，仅有少数含量增加。

萌芽大蒜非共有主要挥发性物质（大多＞1%），2,5-二甲基噻吩、2-亚乙基-1,3-二硫烷、1,3-二噻烷、5-甲基噻二唑、己醛（＞1.30%，呈青草香和苹果香）、2,5-二甲基呋喃是A 样品中未检测到的物质，而在其他样品中均检出，其含量大多随萌芽时间的延长呈递增趋势，这些含硫的物质可能是由其他含硫化合物分解转化而来。甲基丙烯基二硫醚是B 样品未检测到的物质，其含量大致呈递减趋势。1-戊烯-3-醇是具有青草气息的物质，仅在B、C 样品中检测到。6-甲基-2-庚炔（1.18%）、叠氮二羧酸二叔丁酯（2.86%），这两种物质均在样品D 中检测到，而在其他样品中均未检测到。丙烯醇（2.42%）是具有淡臭味的物质，本研究仅在E 样品中检测到。非共有物质的相对含量大体呈现先升后降的趋势。

2.4 萌发大蒜挥发性成分的ROAV 分析

在GC-MS 分析中，仅仅依据某种物质的含量高低来判断其对样品整体气味的贡献是有局限的。香气阈值是描述某种化合物能被人嗅到的该物质的最低浓度。本研究利用ROAV 值来表征不同萌芽时间的大蒜的关键性气味物质。样品中二烯丙基四硫醚的含量尽管不是最高，但其气味阈值最低，所以其ROAV 值最大。表4 是依据能查阅到阈值的化合物结合公式（2）计算的ROAV 值。表中可以看出不同萌芽期的大蒜共有关键化合物为2 种（二烯丙基四硫醚、烯丙硫醇），烯丙硫醇是一种具有烤葱香味的物质，在大蒜萌芽48 h 后的样品中ROAV 值均大于10，其对样品整体贡献大。二烯丙基二硫醚具有蒜香是未萌芽和萌芽24 h 样品的关键化合物。二烯丙基硫醚具有生蒜香，是未萌芽大蒜的关键化合物。从关键化合物来看，随着萌芽时间的延长大蒜的烤葱香气在逐步增加，而大蒜辛辣刺激性气味在逐步减弱。

表4 大蒜香气成分ROAV 分析Table 4 ROAV analysis of garlic aroma components

2.5 大蒜主要挥发性物质差异分析

依据表4 的分类，选取每类中含量大于1%的物质进行差异性热图分析，其结果见图4。由图4 中各种物质的丰度可知，二烯丙基二硫醚、二烯丙基硫醚、二烯丙基四硫醚、烯丙基甲基二硫醚、烯丙基甲基硫醚是样品的主要共有挥发性物质。1,3-二噻烷、2,5-二甲基呋喃、2-亚乙基-1,3-二硫烷、己醛是B、C、D、E 样品共有主要挥发性物质。5-甲基噻二唑、硫化丙烯是C、D、E 样品共有主要挥发性物质。硫化丙烯、己醛、叠氮二羧酸二叔丁酯、丙烯醇、6-甲基-2-庚炔、5-甲基噻二唑、2-亚乙基-1,3-二硫烷、2-丙-2-炔基磺酰基丙烷、2,5-二甲基噻吩、2,5-二甲基呋喃、1-戊烯-3-醇、1,3-二噻烷的缺失是A 与B、C、D、E 的差异的进一步体现。6-甲基-2-庚炔、叠氮二羧酸二叔丁酯是D 样品独有的主要物质。丙烯醇是E 样品独有主要物质。

图4 不同萌芽期大蒜主要挥发性物质差异性热图Fig.4 Heat map of the differences in the main volatile substances of garlic at different germination stages

纵观整个差异性热图，A、B 相似度高，与C、D、E 差异明显，这与电子鼻检测结果结合OPLSDA 散点图中分析的结果一致。GC-MS 分析与电子鼻分析结果具有一致性。

2.6 大蒜主要挥发性物质与电子鼻传感器相关性分析

图5 是利用Origin 2021 结合Correlation Plot 插件绘制的大蒜主要挥发性物质的相对含量与电子鼻传感器相关性热图。图中可以看出烯丙基甲基硫醚、丙基甲基二硫醚、二烯丙基二硫醚、2-亚乙基-1,3-二硫烷、己醛、1,3-二噻烷与LY2/LG、T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2、PA/2、P30/1、P40/2、P30/2、T40/2、T40/1、TA/2 呈极显著（P＜0.01）负相关；而丙基甲基二硫醚、己醛、1,3-二噻烷与LY2/G、LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCTl、LY2/gCT 呈极显著（P＜0.01）正相关。二烯丙基二硫醚与LY2/LG、T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2、PA/2、P30/1、P40/2、P30/2、T40/2、T40/1、TA/2 呈极显著正（P＜0.01）相关。5-甲基噻二唑、二甲基二硫醚、烯丙硫醇、1-戊烯-3-醇、6-甲基-2-庚炔、叠氮二羧酸二叔丁酯、丙烯醇与绝大多数传感器存在显著（P＜0.01）正或负相关。甲基丙烯基二硫醚、硫化丙烯、2,5-二甲基噻吩、2-丙-2-炔基磺酰基丙烷与传感器的相关性不显著。由此可见大蒜的主要挥发性物质与电子鼻大多数传感器存在相关性，电子鼻能够有效区分不同萌芽期的大蒜。

图5 大蒜主要挥发性物质与电子鼻相关性分析Fig.5 Correlation analysis between the main volatile compounds in garlic and electronic nose

3 结论

实验以萌芽大蒜为研究对象，通过电子鼻和GC-MS 分析，结合OPLS-DA、差异性热图等方法对萌芽大蒜整体气味轮廓进行识别和鉴定具体挥发性物质。电子鼻雷达图及OPLS-DA 分析表明不同萌芽时间大蒜的差异明显，大蒜的气味强度会随萌芽时间的延长而逐步减弱。GC-MS 检测表明不同萌芽时间的大蒜分别鉴定出17、41、40、39 和39 种，共计65 种挥发性物质，差异明显；相对含量分别为95.36%、96.93%、94.89%、94.28%、95.37%；含硫化合物是不同萌芽时间样品的主要挥发物质；含硫化合物的相对含量随萌芽时间延长而呈递减趋势，而种类呈现出递增趋势；二烯丙基四硫醚、烯丙硫醇是样品共有关键性化合物。差异性热图分析显示硫化丙烯、己醛、叠氮二羧酸二叔丁酯、丙烯醇、6-甲基-2-庚炔、5-甲基噻二唑、2-亚乙基-1,3-二硫烷、2-丙-2-炔基磺酰基丙烷、2,5-二甲基噻吩、2,5-二甲基呋喃、1-戊烯-3-醇、1,3-二噻烷的缺失进一步加大了未萌芽和萌芽大蒜气味的差异；大蒜主要挥发性物质与电子鼻大多数传感器存在显著正相关性或负相关。

造成萌芽大蒜和未萌芽大蒜气味差异的原因以及生理活性是否有差异，本文未作进一步探讨。课题组会在随后的研究中将其列入研究的重点，以阐明大蒜萌芽过程变化的机理，为其应用提供参考。