壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌抑菌机制初步研究

黄伟英，刘晓婷，关玉凤，吴忆惠，范灿烨，刘巧瑜, ，陈海光,，吴俊师，王小玉

（1.仲恺农业工程学院 轻工食品学院，广东省岭南特色食品科学与技术重点实验室，农业农村部岭南特色食品绿色加工与智能制造重点实验室，现代农业工程创新研究院，广东广州 510225；2.广州辐锐高能技术有限公司，广东省工业钴-60 伽玛射线应用工程技术研究中心，广东广州 511458；3.拱北海关技术中心，广东珠海 519015）

肉食杆菌（Carbibacterium divergens）是一种革兰氏阳性菌，耐盐性能较强，可利用碳水化合物产酸，易存在于鱼、肉和其他各种食物中产生异味并导致腐败变质。李成[1]研究发现蟹糊在-20 ℃和4 ℃贮藏温度下的优势腐败菌均为肉食杆菌属，该菌属能分解糖类产生乳酸，降低pH，其还能利用精氨酸产生氨类物质，产生不愉快气味；桂国弘等[2]研究得出肉食杆菌在保藏过程中逐渐成为冷鲜鸡的优势腐败菌，是导致挥发性盐基氮含量升高，继而发生腐败变质的主因。作为常用的天然抑菌剂，壳聚糖和ε-聚赖氨酸均具有抑菌效果好、抑菌性广等优点[3-4]。Wei等[5]提出，由于壳聚糖氨基的质子化，产生一个抑菌基团-NH3+，与细菌表面负电荷间的静电相互作用，使细胞膜破裂，难以形成细胞壁，从而达到抑菌目的[6]。ε-聚赖氨酸源于白色链霉菌的发酵产物[7]，是一种高度安全的天然食品抑腐剂。其中，Hou 等[8]和Wei 等[9]研究表明，ε-聚赖氨酸的抑菌机制主要作用于细胞膜和细胞壁导致细胞死亡，同时还可能作用于酶。

目前除常规的热杀菌、辐照、气调包装等处理手段，在肉制品中添加天然抑菌剂是抑制肉类腐败菌生长繁殖的方法。王志琦[10]研究表明在4 ℃贮藏条件下将复配抑菌剂（0.03%ε-PL+0.08%百里香精油+0.06%肉桂醛+0.04%牛至精油）应用于阚疃板鸡成品，可显著抑制肉食杆菌属等菌群，使其货架期延长到 9 d。李新福[11]研究得出复配精油牛至+百里香（1:1，v/v）对肉食杆菌抑制作用最佳。李成[1]发现复配保鲜剂（0.01% Nisin+0.04%ε-PL+0.03%茶多酚+0.1%柠檬酸）抑制肉食杆菌的增长，有效提高腌制生食蟹糊冻藏期间的食用安全性。

本文拟通过研究壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌细胞结构和细胞保护酶的作用，探讨其对肉食杆菌的抑菌作用机制。通过测定最小抑菌浓度（minimum inhibition concentration，MIC），结合微生物生长曲线，比较其抑菌作用强弱，评价其对肉食杆菌的抑菌活性；然后通过测定电导率值、胞外核酸、胞外蛋白、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活力等指标，结合扫描电子显微镜观察，研究壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌细胞结构的破坏作用，还通过检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）活性变化，进一步探究壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌的细胞保护酶的作用影响，初步阐述壳聚糖和ε-聚赖氨酸的抑菌机理，为其在食品抑菌防腐领域中的开发应用提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

肉食杆菌P10（Carbibacterium divergens）为课题组早期从腐败酱卤肉鸽中分离、鉴定并保存的菌株；水溶性壳聚糖（分子量10W，脱乙酰度90.22%）河南万邦万邦化工科技有限公司；ε-聚赖氨酸（纯度99.26%）郑州拜纳佛生物工程股份有限公司；营养琼脂（NA）培养基、营养肉汤（NB）培养基广州环凯微生物科技有限公司；蛋白定量测试盒、AKP 测试盒、SOD 测试盒、CAT 测试盒 南京建成生物工程研究所；戊二醛 分析纯，上海源叶生物科技有限公司。

DDS-307 电导率仪 上海仪电科学仪器股份有限公司；760CRT 紫外可见光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；TDL80-2B 台式离心机 上海安亭科学仪器厂；HITACHI SU8100 扫描电子显微镜 日本Hitachi 株式会社。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株活化及菌液制备 菌株活化：将肉食杆菌接种在NB 培养基中，并在37 ℃下培养24 h，反复传代培养[12]。

菌悬液制备：取活化的菌液以1%（体积分数，后同）接种量接入100 mL 的营养肉汤培养基中，37 ℃静置培养12 h，培养至对数生长期，得到原菌液备用。将营养肉汤在4 ℃、4000 r/min 条件下离心10 min，弃上清液，所得沉淀用无菌PBS 调整菌液，通过平板计数法得出具体菌落总数，在600 nm 下测定吸光度Abs（参考菌浓度-吸光度标准曲线），调整菌液浓度为107～108CFU/mL，现配现用[11]。

1.2.2 最小抑菌浓度（MIC）通过肉汤稀释法测定抑菌剂对肉食杆菌的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC），即37 ℃下培养24 h，明显抑制微生物生长的最小浓度[13]。参考Wang 等[14]方法，稍作修改。收集对数生长期的菌液，稀释至106CFU/mL。采用二倍稀释法将壳聚糖和ε-聚赖氨酸在无菌PBS 中依次稀释，使壳聚糖浓度依次为12.5、6.25、3.125、1.5625、0.7813、0.3906、0.1953、0.0977、0.04885 g/kg；ε-聚赖氨酸浓度依次为5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.1563、0.0781、0.0391、0.00196 g/kg。以无菌水作为对照组。37 ℃下培养24 h。随后，取0.1 mL 活化后的菌液于平板上涂布均匀。以无菌水作为空白对照，将各平板于 37 ℃中倒置培养 24 h，以完全不长菌的最小浓度确定为壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌作用的 MIC[15]。

1.2.3 细菌培养液的制备 参照蓝蔚青等[16]方法并做适当修改。将已制备的菌悬液按1%的接种量接种至NB 培养基中，以加入MIC、2 MIC 的抑菌液（壳聚糖、ε-聚赖氨酸）为实验组（MIC 组、2MIC 组），以不加抑菌液为对照组（CK 组），37 ℃静置培养。

1.2.4 微生物生长曲线 采用紫外-可见分光光度法测定肉食杆菌的生长曲线[17]。取制备好的细菌培养液，每隔2 h 测定600 nm 波长处的OD 值。

1.2.5 肉食杆菌细胞膜通透性的测定 通过测定电导率值，表示壳聚糖和ε-聚赖氨酸对菌体细胞膜通透性的影响，参照Liang 等[18]方法并做适当修改。取制备好的细菌培养液，每隔2 h 测定1 次电导率，连续12 h。

1.2.6 胞外核酸的测定 参照梅佳林等[19]方法并做适当修改。取制备好的细菌培养液，每隔2 h 取样一次，连续 12 h，以4000 r/min 低温离心10 min 后，取上清液，测定260 nm 波长处的OD 值。

1.2.7 胞外蛋白质含量的测定 参照Stec 等[20]方法并做适当修改。取制备好的细菌培养液，每隔2 h取样一次，连续 12 h，以4000 r/min 低温离心10 min后，取上清液，采用试剂盒测定细菌胞外蛋白质含量。

1.2.8 肉食杆菌细胞壁完整性的测定 通过测定碱性磷酸酶（AKP），研究壳聚糖和ε-聚赖氨酸对菌体细胞壁完整性的影响，参照Zhao 等[21]方法并做适当修改。分别在0、2、4、6、8、10、12 h 的细菌培养液离心后取上清液，用AKP 试剂盒来测定。

1.2.9 超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的测定 参照张亮亮[22]和Motavallihaghi 等[23]方法，将肉食杆菌培养至对数期（107CFU/mL），分别于0、2、4、6、8、10、12 h 取制备好的细菌培养液，各取10 mL 在低温环境下超声破碎，每次破碎5 s，处理2 min，4000 r/min 低温离心10 min。吸取上清液，用试剂盒测定超氧化物歧化酶（SOD）活力和过氧化氢酶（CAT）活力。

1.2.10 扫描电子显微镜观察 取制备好的细菌培养液，在37 ℃、120 r/min 摇床培养12 h 后，将上述培养液于4 ℃、8000 r/min 离心5 min，收集沉淀的细菌；将菌体重悬于2.5%戊二醛溶液中，并在4 ℃下固定24 h。弃掉上清液，用磷酸缓冲液冲洗样品；1%的锇酸溶液固定样品2 h[24]，再用磷酸缓冲液冲洗样品；用30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇溶液和无水乙醇对菌体依次脱水。临界点干燥，将其涂在金属载体上，喷金，在扫描电子显微镜中观察[25]。

1.3 数据处理

试验各平行3 次，采用Microsoft Excel 2019（微软公司）制表，Origin 2018 软件（Origin Lab 公司）制图，IBM SPSS Statistics 22 软件（IBM 公司）做显著性分析，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌的最小抑菌浓度

最小抑菌浓度（MIC）是衡量和评价物质抑菌能力的主要指标之一[26]，MIC 值越小，抑菌效果越好，即在较低的质量浓度下，就可以抑制微生物的生长[27]。由表1 和表2 可知，壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌的生长均有较好的抑制作用，且抑菌效果随壳聚糖和ε-聚赖氨酸浓度的增大而增强，当壳聚糖和ε-聚赖氨酸分别稀释到最小浓度0.1953 和0.1563 mg/mL 时，培养基上肉眼看不见细菌生长，因此，其MIC 分别为0.1953 和0.1563 mg/mL，而ε-聚赖氨酸对肉食杆菌的MIC 低于壳聚糖对肉食杆菌的MIC，表明ε-聚赖氨酸对肉食杆菌的抑制作用强于壳聚糖。

表1 壳聚糖对肉食杆菌的MICTable 1 MIC of chitosan against Carnobacterium divergens

表2 ε-聚赖氨酸对肉食杆菌的MICTable 2 MIC of ε-polylysine against Carnobacterium divergens

2.2 壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌生长曲线的影响

细菌的生长曲线可以直接反映其生长情况及生长速率。在一定的波长范围内，细菌悬液的浓度与吸光度值成正比[28]，可通过OD 值变化来评判壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌的抑制作用。如图1 所示，CK 组的肉食杆菌呈现出典型的“S”型生长曲线特点。4～10 h 为对数期，该阶段细菌迅速生长，10 h后进入稳定期。壳聚糖和ε-聚赖氨酸的MIC 组和2MIC 组，OD 值基本处于低值波动，显著低于CK组，说明细菌几乎停止生长。加入质量浓度为MIC和2MIC 的壳聚糖和ε-聚赖氨酸延缓了肉食杆菌细胞的生长周期，能有效抑制肉食杆菌的生长。

图1 壳聚糖（a）、ε-聚赖氨酸（b）对肉食杆菌生长曲线的影响Fig.1 Effect of chitosan (a),ε-polylysine (b) on the growth of Carnobacterium divergens

2.3 壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌细胞膜通透性的影响

菌液电导率的变化可用来分析壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌细胞膜的通透性的影响[29]。图2中，壳聚糖和ε-聚赖氨酸的MIC 组和2MIC 组的电导率均显著增加（P＜0.05），而CK 组的电导率较为稳定。正常情况下，细胞内外离子在细胞膜屏障下，会保持动态平衡，膜外环境的电导率基本保持不变。CK 组菌液在2 h 内的电导率增加较明显，随后维持在相对稳定状态。在壳聚糖和ε-聚赖氨酸的作用下，肉食杆菌的细胞膜被破坏，失去保护能力和屏障作用，使原本细胞内容物中的带电离子泄漏到细胞膜外，包括K+、Ca2+、Na+，导致膜外环境的电导率升高[30]，图2 中MIC 与2MIC 组菌液的电导率始终高于CK 组，壳聚糖的增长速率高于ε-聚赖氨酸，其与处理液浓度呈正相关。壳聚糖和ε-聚赖氨酸可以通过损伤细胞膜，增加细胞膜的通透性，影响其正常代谢，从而抑制细菌生长[31]。

图2 壳聚糖（a）、ε-聚赖氨酸（b）对肉食杆菌细胞膜通透性的影响Fig.2 Effect of chitosan (a),ε-polylysine (b) on cell membrane permeability of Carnobacterium divergens

2.4 壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌核酸泄漏的影响

核酸具有编码合成蛋白质的功能，在细胞的生命活动中起着重要作用[32]，如果细胞内核酸丢失，将会导致细胞死亡。在不同培养时间，细胞内的核酸泄漏情况如图3 所示。各组的OD 值均呈现出上升趋势，MIC 和2MIC 的壳聚糖和ε-聚赖氨酸的OD 值均显著增大（P＜0.05）。壳聚糖的MIC 组和2MIC组OD 值在4 h 后明显增长，ε-聚赖氨酸处理的MIC 组和2MIC 组OD 值在0～4 h 内增长最快，之后增长速度减慢，说明壳聚糖和ε-聚赖氨酸破坏了肉食杆菌的细胞膜，导致细胞内核酸不断从细胞膜内流出，破坏强度与浓度呈正相关。因此，壳聚糖和ε-聚赖氨酸不仅破坏细胞结构，还导致胞内遗传物质的泄漏，从而影响细胞的正常生理活动。

图3 壳聚糖（a）、ε-聚赖氨酸（b）对肉食杆菌核酸泄漏的影响Fig.3 Effect of chitosan (a),ε-polylysine (b) on extracellular nucleic acid of Carnobacterium divergens

2.5 壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌胞外蛋白质量浓度的影响

由图4 可知，CK 组中胞外蛋白质量浓度趋于平稳，且均低于MIC 组和2MIC 组的胞外蛋白质量浓度，说明壳聚糖和ε-聚赖氨酸具有损伤细胞，破坏细胞的完整性，导致胞内蛋白质大量外泄的效果。0～2 h 内，壳聚糖作用菌液后的胞外蛋白质量浓度显著增加（P＜0.05），4 h 后有轻微波动，2MIC 组的壳聚糖在6 h 有最大值为0.344 mg/mL。而ε-聚赖氨酸的MIC 组和2MIC 组是在4 h 后胞外蛋白质量浓度迅速增加，2MIC 组的ε-聚赖氨酸在6 h 有最大值为0.4287 mg/mL，随后趋于稳定。两者相比之下，壳聚糖抑菌的速度远远大于ε-聚赖氨酸，可明显抑制肉食杆菌的生长繁殖。细胞膜通透性增加，胞内蛋白外泄，引起胞外蛋白迅速增加，且高浓度壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌蛋白质泄漏影响更剧烈，可能导致菌体内可利用的蛋白质较少[33]，菌体无法继续繁殖，甚至死亡。

图4 壳聚糖（a）、ε-聚赖氨酸（b）对肉食杆菌胞外蛋白质量浓度的影响Fig.4 Effect of chitosan (a),ε-polylysine (b) on extracellular protein concentration of Carnobacterium divergens

2.6 壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌细胞壁完整性的影响

碱性磷酸酶（AKP）主要存在于细胞壁与细胞膜间。当细胞结构被破坏时，AKP 会从细胞内渗出。可通过测定AKP 的活力变化来判断抑菌剂对菌体细胞壁的破坏情况[34]。由图5 所示，MIC 和2MIC的壳聚糖和ε-聚赖氨酸的AKP 活力均显著增加（P＜0.05），而CK 组中的AKP 活力均维持较为稳定的水平。在0～2 h 时，检测到壳聚糖中MIC 组和2MIC 组的AKP 大量渗出，随后趋于稳定，且壳聚糖2MIC 组的菌液中的AKP 泄漏量高于MIC 组。当ε-聚赖氨酸作用于肉食杆菌时，0～2 h 内，MIC 组的菌液中AKP 活力迅速增加且高于2MIC 组，可能由于菌体受到高质量浓度的ε-聚赖氨酸后，刺激其自我修复功能，少数菌体恢复活力，继续生存繁殖[35]。壳聚糖和ε-聚赖氨酸可通过诱导细胞膜损伤而后作用在细胞壁，增加细胞壁的通透性，导致大量AKP 渗漏到细胞外。壳聚糖和ε-聚赖氨酸相比之下，壳聚糖的抑菌时间更短，可能是当壳聚糖达到高浓度时，也会诱导几丁质蛋白酶，即激发某些细菌本身的几丁质蛋白酶活力，使其降解微生物自身细胞壁的几丁质，细胞壁遭到破坏，细菌被杀灭，达到抑菌作用[36]。

图5 壳聚糖（a）、ε-聚赖氨酸（b）对肉食杆菌细胞壁完整性的影响Fig.5 Effect of chitosan (a),ε-polylysine (b) on cell wall integrity of Carnobacterium divergens

2.7 壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌CAT 活力的影响

过氧化氢酶（CAT）存在于细胞的过氧化物酶体内，能将过氧化氢催化分解为氧气和水，避免机体受到氧化损伤[37]。由图6 可知，CK 组菌体内CAT 活性较为稳定。壳聚糖和ε-聚赖氨酸处理导致肉食杆菌的CAT 活性先升高后降低。0～4 h 内，壳聚糖MIC组和2MIC 组的菌体CAT 活力显著升高（P＜0.05），CAT 活力分别达到了13.58、15.44 U/mg。4 h 后，菌体内CAT 活性明显下降，在12 h 时，CAT 活力分别为5.92、3.81 U/mg。ε-聚赖氨酸MIC 组和2MIC组的CAT 活力迅速上升，在4 h 时MIC 组达到了15.93 U/mg，而2MIC 组在2 h 时达到最大值15.83 U/mg，随着抑菌时间的延长，在12 h 时出现最小值分别为5.50、3.77 U/mg。肉食杆菌在壳聚糖和ε-聚赖氨酸的逆环境胁迫下，CAT 酶活力前期呈上升趋势，可能是菌体为维持自身的氧化平衡状态，提高过氧化氧化酶活性，从而清除过量过氧化物的一种自我调节与保护作用[38]。后期呈下降趋势，可能由于高浓度的壳聚糖和ε-聚赖氨酸削弱了菌体细胞自身清除过氧化物的能力，加剧氧自由基的积累[39]，细胞通透性增加，蛋白质变性严重，导致酶活性完全被抑制，造成菌体自身防御机能降低而死亡。

图6 壳聚糖（a）、ε-聚赖氨酸（b）对肉食杆菌CAT酶活力的影响Fig.6 Effect of chitosan (a),ε-polylysine (b) on CAT enzyme activity of Carnobacterium divergens

2.8 壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌SOD 活力的影响

超氧化物歧化酶（SOD）是一种抗氧化金属酶，负责分解细胞体内超氧化物自由基，催化超氧阴离子（O2-）自由基歧化生成氧和过氧化氢，减少对膜的损害[40]，在生物体氧化平衡中发挥关键作用。如图7所示，随着抑菌时间和抑菌剂（壳聚糖、ε-聚赖氨酸）浓度的升高，菌体细胞 SOD 活性呈现先升高，壳聚糖在4 h 达到最大活性，此时MIC 组和2MIC 组的SOD 活力分别为76.96、78.04 U/mg，4 h 后呈现下降趋势。而ε-聚赖氨酸在6 h 达到最大活性，此时MIC组和2MIC 组的SOD 活力分别为 74.35、71.17 U/mg，随后其SOD 活力迅速下降。因此，前期SOD 活力呈上升趋势，说明此时肉食杆菌受到壳聚糖和ε-聚赖氨酸的损害，可能胁迫作用导致细胞内超氧阴离子自由基代谢平衡被破坏[41]，使SOD 活力升高。随后SOD 活力迅速下降，可能由于壳聚糖和ε-聚赖氨酸对菌体的影响发挥主导作用，影响了蛋白质与SOD生成，使SOD 对超氧离子清除率下降，导致超氧阴离子自由基的积累[42]，影响机体氧化应激系统的动态平衡，触发细胞凋亡或坏死性死亡。

图7 壳聚糖（a）、ε-聚赖氨酸（b）对肉食杆菌SOD酶活力的影响Fig.7 Effect of chitosan (a),ε-polylysine (b) on SOD activity of Carnobacterium divergens

2.9 壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌细胞形态的影响

通过扫描电子显微镜对菌体进行形态观察，更直观看到壳聚糖和ε-聚赖氨酸作用后肉食杆菌的细胞形态变化，结果如图8 所示。从图8 中（a1）、（a2）可以看出，CK 组的肉食杆菌的细胞呈正常的短棒状，细胞边界清晰，结构完整、形态饱满、表面光滑、分布均匀，没有细胞破裂或内容物溢出等现象。相比之下，壳聚糖实验组的变化则较为明显，壳聚糖的MIC 组和2MIC 组作用后，从图8 中（b1）、（b2）可知，肉食杆菌的细胞形态发生较大变化，观察到菌体表面粗糙，细胞出现扭曲变形，图8 中（c1）、（c2）的菌体变形的同时，细胞质从菌体细胞体内大量渗出，基本没有形态正常的细胞；ε-聚赖氨酸的MIC 组作用肉食杆菌后（图8 中（d1）、（d2）），肉食杆菌的细胞形态受到严重破坏，菌体表面粗糙，菌体发生扭曲变形，出现褶皱凹陷，ε-聚赖氨酸的2MIC 组作用后（图8中（e1）、（e2）），出现褶皱和扭曲变形的现象更加明显，细胞表面粗糙不平并出现孔洞，细胞内容物外泄。细胞形态改变可能是壳聚糖和ε-聚赖氨酸破坏了细菌的细胞膜，引起胞内物质外泄所致，最终导致菌体死亡。

图8 壳聚糖（a）、ε-聚赖氨酸（b）对肉食杆菌处理前后微观结构的扫描电子显微镜观察Fig.8 Scanning electron microscopic observation of the microstructure of Carnobacterium divergens before and after treatment with chitosan (a) and ε-polylysine (b)

3 结论

本文研究表明，壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌有良好的抑菌效果，能显著减缓细菌生长速率，损伤肉食杆菌的细胞膜，使细胞内物质向外渗出，导致电导率增大，胞外核酸和蛋白含量明显增加，从而导致菌体死亡。同时，AKP 活力增大，表明细胞壁完整性受损，抗氧化酶（CAT、SOD）活力降低，使菌体不能清除体内的自由基，造成菌体不可逆损伤，从而失去代谢和增殖活性。扫描电镜图显示，壳聚糖可使菌体细胞壁与细胞膜的通透性增加，核酸、蛋白质、Na＋、K＋等内容物发生泄漏，明显抑制细菌的正常生长，ε-聚赖氨酸能使菌体褶皱和扭曲变形的现象明显，细胞表面粗糙不平并出现孔洞，细胞内容物外泄，破坏微生物的正常生理代谢，最终导致细胞死亡。本文初步探究壳聚糖和ε-聚赖氨酸对肉食杆菌的抑菌机理，也为这两种天然抑菌剂在食品工业中的应用提供一定的理论参考。