CD38经TFEB介导促进溶酶体再生而调节巨噬细胞胆固醇外流*

许 浩， 孙雪妮， 吴天祺， 刘进源， 黄倩琳， 莫 蝶， 王嘉馨，陈沈娴， 邓伯丹， 许小洋△

（1广州医科大学第二临床学院，广东 广州 511436；2广州医科大学基础医学院，广东 广州 511436）

近年来发现巨噬细胞因吞噬氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein， oxLDL）而形成的脂滴（胆固醇酯）可以通过自噬[即脂噬（lipophagy）］的方式，与溶酶体融合并被其中的酶水解为游离胆固醇而经胆固醇逆转运（reverse cholesterol transport，RCT）途径排出细胞外[1-2］。因此，促进脂噬可防止泡沫细胞的形成和凋亡、增强RCT，从而起到抑制粥样斑块形成的目的。

在脂噬的过程中，随着溶酶体与含脂滴的自噬体（autophagosome）的不断融合，溶酶体的数量将不断减少[3］。然而，细胞存在自噬性溶酶体再生（autophagic lysosome reformation， ALR）的机制[4］，以维持溶酶体数量的动态平衡，确保巨噬细胞对胆固醇摄取、代谢及排出机制的稳态维持。因此，对溶酶体再生机制的阐明，将有助于探索抑制泡沫细胞形成的新途径，进而为动脉粥样硬化的干预提供新的实验依据。

在ALR 过程中，已明确溶酶体膜上的瞬时感受器电位ML1（transient receptor potential-mucolipin 1，TRPML1）钙通道释放的Ca2+，可激活钙调磷酸酶（calcineurin， Cn），后者使转录因子EB（transcription factor EB， TFEB）去磷酸化而进入细胞核发挥其转录活性，从而导致哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）的激活而促进溶酶体再生[5-8］。因此，寻找高效的、可激活TRPML1 的信号分子（或信号通路），将不仅可促进溶酶体再生，也将为抑制泡沫细胞的形成乃至预防或延缓动脉粥样硬化的发生提供靶点。

烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate， NAADP）作为细胞内的第二信使，可激活TRPML1通道而增加溶酶体Ca2+释放[9］。NAADP 可通过ADP 核糖基环化酶-CD38 催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP＋）与烟酸（nicotinic acid， NA）反应生成[10］。本课题组前期报道过NA 可促进巨噬细胞溶酶体胆固醇外流[11］，高脂饮食的CD38基因敲除小鼠可在冠状动脉中发现斑块的形成[12］，提示CD38/NAADP 可激活TRPML1 而发挥其抑制巨噬细胞溶酶体胆固醇蓄积的作用，但其是否可促进溶酶体再生仍有待进一步观察。有鉴于此，本研究拟从CD38 入手，观察其对巨噬细胞溶酶体再生及胆固醇调节的影响，以期为探寻溶酶体再生的触发机制及其效应提供新的实验支持。

材 料 和 方 法

1 主要试剂

RPMI-1640 培养液和胎牛血清购自Gibco；CD38 siRNA、β-actin 抗体和溶酶体相关膜蛋白1（lysosomal associated membrane protein 1， Lamp1）抗体购自Santa Cruz；CD38 质粒购自GeneCopoeia；siRNA 及质粒转染试剂盒购自SignaGen；NA 和烟酰胺（nicotinamide）购自Sigma-Aldrich；实时荧光定量PCR 试剂盒购自Qiagene；山羊抗大鼠Alexa Fluor 633 荧光Ⅱ抗购自Thermo；细胞培养玻片（8 室）购自Biologix；oxLDL 购自广州瑞千公司；Filipin 染色液、NAADP 拮抗剂NED-19 和Ca2+螯合剂BAPTA 购自Cayman；DiIoxLDL 购自Scintol；NAADP 购自AAT Bioquest；Nile red染色剂购自MedChemExpress；超敏ECL化学发光试剂盒和DMSO 购自碧云天；HRP 标记的羊抗兔IgG试剂购自Southern Biotech；环孢素A（cyclosporine A，CsA）购自InvivoChem；磷酸化TFEB（Ser211）抗体购自Affinity；NAADP ELISA 检测试剂盒购自SAB Signalway。

2 主要方法

2.1 细胞培养 实验所用原代巨噬细胞按已发表的方法培养[12-13］。简述如下：按无菌操作的要求取下小鼠股骨和胫骨，剪断骨骼两端。用注射器吸取RPMI-1640 培养基插入一侧骨髓腔，冲出骨髓。再将骨髓轻柔吹打成细胞悬浮液，1 500 r/min 离心3 min，弃上清，用含10%胎牛血清、15% L-929 条件培养基的RPMI-1640 培养基（2%双抗）10 mL 轻柔吹打成悬浮细胞并移至培养皿中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱内培养。7 d 后细胞分化完成，即可用于相应实验。

2.2 NAADP 拮抗剂及Ca2＋螯合剂处理 在观察NAADP 拮抗剂NED-19、Ca2＋螯合剂BAPTA 及钙调磷酸酶抑制剂CsA 对NA 影响溶酶体胆固醇外流实验中，先加入NED-19、BAPTA或CsA，1 h后加入NA，再经1 h 后加入oxLDL，48 h 后固定细胞，经破膜、Lamp1 抗体标记、filipin 和Nile red 染色等处理以进行激光共聚焦成像检测观察。在观察NA 对CD38 mRNA、CD38蛋白表达及磷酸化TFEB水平影响的实验中，按上述顺序分别加入NED-19（或BAPTA 或CsA）、NA 和oxLDL， 24 h 后提取总RNA 进行RT-qPCR 测CD38 mRNA 水平，48 h 后提取蛋白进行Western blot测目的蛋白表达。

2.3 巨噬细胞溶酶体数量检测 将巨噬细胞按每皿1.0×106个接种于35 mm 玻璃培养皿中，巨噬细胞溶酶体采用DiI-oxLDL 染色，溶酶体数量变化通过活细胞共聚焦扫描成像系统（Zeiss Axio Observer Z1，Carl Zeiss Microscopy）检测。各种处理结束后将含细胞的玻璃培养皿置于荧光成像系统的细胞室中（37 ℃、 5% CO2），观察时长设置为12 h， 扫描间隔2 h，细胞扫描分层（Z轴）为16层。

2.4 巨噬细胞内NAADP 水平检测 经不同处理后，按照ELISA 检测试剂盒的操作说明收集、裂解巨噬细胞并进行细胞内NAADP 检测。细胞裂解与Western blot 中细胞裂解操作相同，即用50 μL RIPA裂解并超声后，经1 500×g于4 ℃离心10 min 以移除细胞碎片，吸取上清进行蛋白浓度测定并进行NAADP 检测。NAADP 实际水平用蛋白量进行标准化定量。

2.5 巨噬细胞游离胆固醇及脂质蓄积检测 巨噬细胞游离胆固醇和中性脂质（胆固醇酯）分别通过filipin 和Nile red 荧光染色剂染色；溶酶体采用溶酶体膜表面特征蛋白Lamp1 抗体免疫标记；将诱导分化好的巨噬细胞按每室5×104个接种于8室细胞培养玻片中，经不同处理后，按已报道的方法进行固定、破膜、Lamp1 抗体标记、filipin 染色[13］，之后细胞用Nile red孵育10 min，PBS洗1次后封片用于激光共聚焦检测。激光共聚焦扫描拍照采用多光子激光扫描显微镜（Zeiss LSM 510，Carl Zeiss Microscopy），不同通道图像采取依次扫描方式获取以防止干扰，整个过程所有参数均保持一致。荧光成像的激发和发射波长参数分别为Alexa Fluor 633（ex 633 nm/em 650～710 nm）、filipin（ex 740 nm/em 435～485 nm）和Nile red（ex 514 nm/em535～590 nm）。荧光强度采用Image Pro 9.1软件（Media Cybernetics）定量，其中filipin强度代表游离胆固醇的量，Nile red 强度代表中性脂质的量。同时分析filipin 与Lamp1 间的共定位系数（Pearson's），以判定溶酶体中游离胆固醇的量。

2.6 CD38 蛋白表达及磷酸化TFEB 蛋白水平检测 参照已有报道中的方法[14］，经标准的Western blot 程序完成。Ⅰ抗及Ⅱ抗浓度均为1∶500，Ⅰ抗4 ℃孵育过夜，Ⅱ抗常温孵育1 h。

2.7 CD38 mRNA 表达检测 巨噬细胞经NA、ox-LDL 处理24 h 后，提取总RNA 按已有报道中的方法进行RT-qPCR，以检测CD38的mRNA表达[12］。

2.8CD38siRNA 干扰及CD38基因回补 采用GenMute 转染试剂盒，依照原报道中的方法进行[12］。RNA 干扰效应于转染24 h 后经RT-qPCR 验证。在CD38siRNA 干扰对细胞溶酶体再生及胆固醇蓄积影响实验中，于转染scramble siRNA 和CD38 siRNA后24 h 加入NA 和oxLDL，48 h 后固定细胞，再经破膜、Lamp1 抗体标记、filipin 和Nile red 染色等处理以进行激光共聚焦成像检测观察。在CD38基因回补对LDLr/CD38双基因敲除（double knockout， DKO）巨噬细胞胆固醇外流的影响实验中，于转染含CD38cDNA 质粒（或vector） 24 h后加入NA 和oxLDL，再经48 h 后固定细胞，经破膜、Lamp1 抗体标记、filipin 和Nile red 染色等处理以进行激光共聚焦成像检测观察。

3 统计学处理

采用SigmaPlot 12.5 for Windows 进行数据统计分析。计量数据以均数±标准差（mean±SD）表示，多组间显著性差异比较使用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验（Holm-Sidak 法）。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 NAADP促进LDLr-/-巨噬细胞溶酶体数量增加

为探讨CD38/NAADP 信号途径是否可经Ca2+/Cn/TFEB 促进溶酶体再生，本研究首先观察了NAADP对溶酶体数量的影响。

采用LDL 受体敲除（LDLr-/-）小鼠的骨髓源性巨噬细胞作为观察对象，以更好地模拟高胆固醇的细胞环境。结果显示，NAADP 可明显促进巨噬细胞中溶酶体数量的增加（溶酶体再生增强），这种效应可被NAADP 拮抗剂NED-19、Ca2+螯合剂BAPTA 及Cn（Ca2+直接激活的下游分子）抑制剂CsA明显抑制（P＜0.05）；有趣的是，溶酶体数量增加后，其分布范围朝细胞边缘明显靠近（P＜0.05），见图1。

Figure 1. NAADP increased lysosome number in LDLr-/- macrophages. Macrophages were incubated with oxLDL （40 mg/L） and DiIoxLDL （1 mg/L） for 48 h， followed by being chased for 24 h， then incubated with NAADP（100 nmol/L） with or without NAADP antagonist NED-19 （100 μmol/L）， calcium chelator BAPTA （5 μmol/L） or calcineurin inhibitor CsA （5 μmol/L）and proceeded to live cell confocal microscopic scanning （duration 12 h， interval 2 h）. A： real-time （living cell） confocal microscopic images of DiI-oxLDL staining； B： summarized lysosome number calculated with Image-Pro Premier software；C： percentage of lysosome closer to cell edge analyzed with Image-Pro Premier software. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs control group.图1 NAADP增加LDLr-/-巨噬细胞溶酶体数量

2 CD38促进LDLr-/-巨噬细胞中NAADP的合成

为明确CD38 和NA 在LDLr-/-巨噬细胞NAADP合成中的作用，我们检测了NA 对细胞内NAADP 水平的影响；同时将LDLr-/-小鼠的CD38基因敲除，以确定CD38 对NAADP 合成的作用。结果显示：加入NAADP合成底物NA后，经oxLDL处理LDLr-/-巨噬细胞中的NAADP 水平显著升高（P＜0.05）；该现象在CD38基因敲除LDLr-/-巨噬细胞中消除（P＜0.05），见图2。

Figure 2. CD38 catalyzed NAADP synthesis in LDLr-/- macrophages. A： intracellular NAADP levels of LDLr-/- macrophages treated with oxLDL， NA and CD38 inhibitor nicotinamide （Nic， 6 mmol/L）； B： NA-induced changes of NAADP level in LDLr-/-macrophages with or without CD38 gene. DKO： double knockout. Mean±SD. n=6 in A； n=4 in B. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vsNA+oxLDL group； △P＜0.05 vs LDLr-/- macrophage group； ▲P＜0.05 vsoxLDL （LDLr-/-） group.图2 CD38促进LDLr-/-巨噬细胞NAADP合成

3 NA促进CD38 mRNA和蛋白表达

为探讨NA 与CD38之间是否存在相互作用的关系，我们观察了NA 对CD38 mRNA 和蛋白表达的影响。为了排除不同基因背景下CD38表达的异同，我们同时观察了NA对野生型（wild type， WT）和LDLr-/-小鼠巨噬细胞CD38表达的调节。结果显示，不论是在WT 还是在LDLr-/-巨噬细胞中，NA 均可促进CD38的mRNA 和蛋白表达，尤其对LDLr-/-巨噬细胞的作 用更明显（P＜0.05），见图3。

Figure 3. NA promoted CD38 expression in macrophages. Total RNA and protein were extracted 24 and 48 h， respectively， from macrophages loaded with oxLDL （40 mg/L） in the presence of niacin （NA， 5 mmol/L） for CD38 expression assay. A：summarized CD38 mRNA levels by RT-qPCR； B： representative Western blot images of CD38 bands （top） and summarized intensity （bottom）. The intensity was normalized to control. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs control group； △P＜0.05 vs oxLDL（wild type） group； #P＜0.05 vs oxLDL （LDLr-/-） group.图3 NA促进巨噬细胞CD38的表达

4 NA 经CD38/NAADP 途径降低TFEB 的磷酸化水平

如图4 所示，NA 可显著降低TFEB 的磷酸化水平（即促进TFEB 去磷酸化），而NAADP 拮抗剂NED-19、Ca2+螯合剂BAPTA 及Cn 抑制剂CsA 则明显抑制NA 的这一效应（P＜0.05）。提示NA 可能通过CD38/NAADP途径激活Ca2+/Cn/TFEB 信号通路而促进溶酶体再生。

Figure 4. NA reduced phosphorylated TFEB （p-TFEB） in macrophages. Total protein was extracted from LDLr-/- macrophages incubated with oxLDL （40 mg/L） in the presence of NA （5 mmol/L） with NAADP antagonist NED-19 （100 μmol/L）， Ca2+ chelator BAPTA （5 μmol/L） or calcineurin inhibitor CsA （5 μmol/L） for 48 h. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs oxLDL group； #P＜0.05 vs NA+oxLDL group.图4 NA降低巨噬细胞TFEB的磷酸化水平

5 阻断CD38/NAADP 信号途径可抑制NA 诱导的溶酶体数量增加和胆固醇外流

结果如图5 所示：NA 可显著增加巨噬细胞的溶酶体数量（溶酶体数量增加且向细胞边缘靠近）、减少溶酶体中游离胆固醇（蓝色强度及其与红色重合部分）和胞质中脂滴（黄染部分，主要成分为胆固醇酯）的蓄积（P＜0.05）；NAADP 拮抗剂NED-19、Ca2+螯合剂BAPTA 和CD38敲减均可明显减弱NA 的上述效应（P＜0.05）。

6 CD38 回补对LDLr/CD38 双基因敲除巨噬细胞溶酶体数量及胆固醇外流的影响

为进一步明确CD38/NAADP 对巨噬细胞溶酶体再生和胆固醇调节的影响，我们将LDLr-/-小鼠和CD38基因敲除（CD38-/-）小鼠杂交，筛选出子代中LDLr/CD38DKO 小鼠，以其骨髓为细胞源培养LDLr/CD38DKO巨噬细胞用于实验；并利用基因回补技术将CD38 质粒转染该细胞，以明确CD38/NAADP 信号通路在巨噬细胞溶酶体再生和胆固醇调节中作用。

结果显示：NAADP 可明显增加LDLr/CD38DKO巨噬细胞中溶酶体数量（P＜0.05）、减少溶酶体中游离胆固醇和胞质中胆固醇酯的蓄积（即促进溶酶体和胞质中胆固醇外流，P＜0.05）；NA 对LDLr/CD38DKO 巨噬细胞中溶酶体数量及胆固醇的蓄积无明显影响，进行CD38基因回补后，NA 促进溶酶体数量增加和抑制胆固醇蓄积的效应才明显地显示出来（P＜0.05），见图6。

Figure 6. Effect of CD38 rescue on lysosome number and cholesterol egression in LDLr/CD38 DKO macrophages. The macrophages were incubated with oxLDL at 40 mg/L in the presence of NAADP （100 nmol/L） for 48 h and labelled with filipin （free cholesterol， blue）， Lamp1 antibody （lysosomes， red）， and Nile red （lipid droplets of cholesterol ester， yellow）. For plasmid transfection， the macrophages were transfected with 1.33 mg/L of vector （negative control） or CD38 plasmid， and 24 h after transfection， the macrophages were incubated with 40 mg/L of oxLDL in the presence of NA（5 mmol/L） for 48 h. A：confocal fluorescence images of filipin， Lamp1 antibody and Nile red staining； B： lysosome number calculated with Image-Pro Premier software； C： summarized intensity free cholesterol （FC） stained by filipin； D： colocalization coefficient between filipin and Lamp1 （lysosome）； E： intensity analysis of Nile red-stained lipid droplets（cholesterol ester）. lm： lumen. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs oxLDL group； △P＜0.05 vsvector+NA+oxLDL group.图6 CD38回补对LDLr/CD38双基因敲除巨噬细胞溶酶体数量及胆固醇外流的影响

讨 论

巨噬细胞的溶酶体在RCT 途径中发挥着重要的作用[15-16］。溶酶体的功能异常可影响胆固醇的代谢和排出，进而促进动脉粥样硬化的发生[15，17］。同理，若溶酶体的数量减少也可导致类似的病理过程。

脂噬有助于防止巨噬细胞向泡沫细胞的转变[18-20］，抑制脂噬则促进泡沫细胞形成[21］。但脂噬的过程伴随有溶酶体数量的减少，需通过自噬性溶酶体再生的机制维持溶酶体数量的动态平衡[4］。因此，对溶酶体再生机制的阐明，将有助于探索抑制泡沫细胞形成的新途径，进而为动脉粥样硬化的干预提供新的实验依据。

在自噬性溶酶体再生中，mTOR为关键的信号中枢[4，22-23］。经溶酶体TRPML1 钙通道释放的Ca2+，通过Cn/TFEB 信号途径介导，激活mTOR 而促进溶酶体再生[5-8］。本研究进一步观察了CD38/NAADP信号通路对巨噬细胞溶酶体再生及胆固醇调节的影响，以期为探寻溶酶体再生的触发机制及其效应提供新的实验支持。

本研究发现，NAADP 可显著增加巨噬细胞中溶酶体的数量，提示其可能具有促进溶酶体再生的作用，且阻断Ca2+/Cn信号通路则抑制NAADP的上述效应，表明NAADP 的效应可能是通过激活TRPML1 而释放Ca2+，后者再激活Cn而发挥溶酶体再生的作用。

NAADP 作为细胞内第二信使，可由一关键酶CD38 催化NADP＋与NA 的烟酰胺基团交换产生[10］。与此相一致，本研究也观察到NA 可使LDLr-/-巨噬细胞中的NAADP 水平显著升高，当CD38基因敲除后，NA 的这种效应基本消失。这一结果进一步明确了CD38 在NA 促进NAADP 生成中作用，同时也提示，NA有可能成为促进溶酶体再生的潜在药物。

为进一步阐明NA 的作用机制，本研究观察了NA 对CD38 mRNA 和蛋白表达的影响。结果显示，NA 可促进WT 和LDLr-/-巨噬细胞CD38 的mRNA 和蛋白表达，尤其对LDLr-/-巨噬细胞的作用更明显。提示NA 不仅作为反应底物促进NAADP 的合成，还可通过酶诱导作用，促进CD38的表达而增强其催化效应。至于NA 对促进LDLr-/-巨噬细胞CD38 表达的作用为何更明显，仍有待进一步深入探讨，可能与LDLr基因敲除小鼠体内存在较高水平的LDL，后者通过某种机制促进了CD38的表达有关。

如前所述，在自噬性溶酶体再生的过程中，Ca2+/Cn/TFEB 信号途径起着始动性的作用[5-8］。本研究的结果显示，NA 可显著促进TFEB 去磷酸化，且阻断NAADP/Ca2+/Cn 信号分子则明显抑制NA 的这一效应。从而表明NA 可能通过CD38/NAADP 途径激活Ca2+/Cn/TFEB信号通路而促进溶酶体再生。

巨噬细胞溶酶体再生对维持溶酶体数量的稳态、促进胆固醇逆转运和减少泡沫细胞的形成至关重要[24］。本研究观察到，NA 不仅可增加巨噬细胞的溶酶体数量，还可减少溶酶体中游离胆固醇和胞质中胆固醇酯（脂滴）的蓄积；阻断CD38/NAADP 信号通路后，NA 的上述效应明显减弱。说明CD38/NAADP 信号通路与溶酶体再生的始动环节密切相关，激活CD38/NAADP 信号通路既可促进溶酶体再生，也有利于巨噬细胞中对胆固醇的调节，从而有助于减少泡沫细胞的发生。而CD38 基因回补的结果则进一步证实了CD38/NAADP 信号通路在促进巨噬细胞溶酶体再生和抑制胆固醇蓄积中的作用。

自噬性溶酶体再生过程往往需要一定的诱发因素，如饥饿、缺氧或化学试剂的诱导[25-26］，实验中常用饥饿作为诱发自噬的手段[27］。如能避开饥饿等手段，直接通过某种药物或信号分子干预巨噬细胞自噬性溶酶体再生的信号通路，则有可能影响溶酶体的再生甚至调节巨噬细胞细胞对脂质的代谢。而本研究结果表明，不必采取饥饿的手段，NA 即可经CD38/NAADP 信号通路促进巨噬细胞溶酶体再生，进而对巨噬细胞的脂质调节产生有利影响。这为日后动脉粥样硬化的预防和治疗提供了新的思路。

本研究观察到CD38/NAADP 信号通路经TFEB介导，参与了巨噬细胞溶酶体的再生过程，但目前只是对该过程中Ca2+/Cn/TFEB 信号途径的触发机制进行了探讨，今后应针对如何提高NA 对CD38/NAADP的作用效应及其对TFEB 的下游信号通路的影响进行更加深入的观察，以期为促进溶酶体再生进而抑制泡沫细胞的形成提供更多的实验支持。

综上所述，CD38 可经TFEB 介导，触发巨噬细胞溶酶体再生，进而促进巨噬细胞溶酶体游离胆固醇和胞质中胆固醇酯的外流。