肌球蛋白轻链家族基因MYL2和MYL3在鸡皮肤组织中的表达研究

魏莹晖,葛 莹,刘 航,王欢欢,李庆海,章学东,范京辉

(杭州市农业科学研究院,浙江 杭州 310024)

动物皮肤的颜色差异主要是受色素沉着的影响,其中黑色素的形成尤为关键。黑色素是影响动物皮肤和头发颜色的主要原因,广泛存在于皮肤、黏膜、视网膜和卵巢中。黑素生成的来源是表皮黑素单位,它是由一个个单一的黑素细胞组成的,通过树突与10～36个相邻的角质形成细胞连接。黑素生成是指黑色素在黑素小体中产生,并从黑素细胞的树突状尖端转移到角质形成细胞的过程,而此过程也称为黑素小体的转运。研究证明,黑素细胞内的黑素小体分布是由微管和肌动蛋白依赖性转运之间的竞争引起的。这说明了肌球蛋白在黑色素转运中起到了至关重要的作用。

肌球蛋白的基本结构是由一条或两条重链和几条轻链组成。肌球蛋白轻链家族中肌球蛋白轻链2(MYL2)和肌球蛋白轻链3(MYL3)基因的主要生理作用是调节肌纤维的活性,影响骨骼肌的生长发育,且与肌肉的收缩有关。另外,在非肌肉细胞中起到了细胞骨架的作用,同时参与细胞物质运输、能量代谢及信号传导等途径。然而,MYL2和MYL3作为肌球蛋白轻链家族的关键因子,尚不清楚它们在鸡的皮肤组织中是否与黑色素沉着过程相关。因此,本实验通过检测不同颜色鸡皮肤中的MYL2和MYL3基因的表达水平,研究其与鸡皮肤差异的相关性。研究结果可为进一步了解MYL2和MYL3基因在黑色素转运中的作用奠定了一定的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验动物 试验动物为杭州市农业科学院采用东乡绿蛋壳鸡和江山乌骨鸡的杂交后代HW1系,从中选择5只HW1系公鸡与3只HW1系母鸡交配,连续10天收集产蛋并孵育。所有孵化出的雏鸡逐一带翅号,并在相同的条件下饲养。在91日龄时收集白色和黑色皮肤的个体,并选择了6对进行实验。屠宰时迅速收集胸部皮肤,用液氮冷冻保存。

1.1.2试验仪器及试剂 CR400 型美能达色差计(Minolta,日本),SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix 试剂盒(Invitrogen公司,货号为11752-050),SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(TaKaRa公司,货号为RR420Q),兔抗MYL2抗体、MYL3抗体、GAPDH抗体(Abcam公司,货号为ab48003、ab137767、ab181602),TRIzol®Plus RNA PurificationKit(Invitrogen公司,货号为12183-555),RNase-FreeDNase Set(Qiagen公司,货号为79254),BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司,货号为P0010),PVDF转印膜(Millipore公司,货号为IPVH00010),ECL DualVue WB Marker(Advansta公司,货号为RPN810)。

1.2试验方法

1.2.1皮肤肤色测定 用美能达色差计测定鸡肤色亮度(L*)、红度(a*)、黄度(b*)值。L*值越大表示明度越白;a*如果是正值,说明偏红,如果是负值,说明偏绿;b*值如果是正值,说明偏黄,如果是负值,说明偏蓝。

1.2.2RNA提取与cDNA链的合成 使用TRIzol®RNA纯化试剂盒提取皮肤组织的总RNA,采用电泳测定其含量、纯度及质量,-80 ℃贮存。采用SuperScriptTM试剂盒将提取的总RNA反转录合成cDNA,-20 ℃贮存备用。

1.2.3引物的设计与合成 从 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 网站上查找引物序列,通过 Primer Premier 5.0 软件设计相应引物。引物信息见表1。

表1 相关引物信息

1.2.4荧光定量分析 荧光定量PCR反应体系:cDNA 1.0 μL;10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL;SYBR® Green 酶10.0 μL;水8.0 μL。反应条件:95 ℃ 1 min;40个循环(95 ℃ 15 s;63 ℃,25 s);收集55～95 ℃熔解曲线。每个样品重复3次。目的基因的引物序列见表1。以甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内对照。目的基因相对表达量=2(内参基因的Ct值-目的基因的Ct值)。

1.2.5Western印迹分析 取鸡皮肤组织,总蛋白提取物在4%～20% Sure PAGE凝胶上进行电泳分离,并通过电印迹转移到PVDF膜。非特异性结合位点用5%牛血清白蛋白在TBST中孵育1 h。然后将膜与含有0.25%牛血清白蛋白的一抗(1∶1 000)在TBST中孵育过夜。在TBST中洗涤3次后,用稀释的(1∶2 000)二抗兔(Abcam,ab6721)在室温下孵育1 h。使用ECL化学发光法对条带进行显色。将目的蛋白的表达值归一化为GAPDH作为加载对照。

1.2.6统计分析 使用SPSS 21.0统计软件对试验数据进行统计分析。先对数据进行正态性检验和方差齐性检验,然后采用t-test和单因素方差分析。使用GraphPad Prism 9.0软件绘制基因表达量的柱状图。每个试验重复数n≥3。试验结果用平均数±标准误差(mean±S.E)表示。以*表示差异显著(P<0.05);**表示差异极显著(P<0.01)。

2 结果

2.1肤色测定 屠宰前将6对试验鸡进行肤色测定,由图1A可知,黑肤的L*和b*值极显著低于白肤(P<0.01),而a*值显著小于白肤组(P<0.05)。之后,将6对试验鸡屠宰后对皮肤进行拍照,也能看出肤色的明显差异(图1B)。

图1 黑肤组与白肤组皮肤肤色值和照片注:*、#、&,P<0.05,表示差异显著;**、##、&&,P<0.01,表示差异极显著(图2～3亦同)。

2.2不同肤色中MYL2和MYL3 mRNA的表达 通过荧光定量PCR对白皮肤和黑皮肤样品中MYL2和MYL3的转录水平进行检测。如图2所示,黑皮肤组较白皮肤组MYL2和MYL3的表达均极显著下调(P<0.01)。

图2 黑肤组与白肤组皮肤组织中MYL2和MYL3的转录水平

2.3不同肤色中MYL2和MYL3蛋白水平的表达 从Western Blot结果(图3A～C)可以看出:黑皮肤组与白皮肤组相比,MYL2的蛋白表达量下调(P<0.05),且MYL3的蛋白表达量极显著下调(P<0.01)。

图3 黑肤组与白肤组皮肤组织中MYL2和MYL3的蛋白表达水平

3 讨论

肌球蛋白是一种多功能的蛋白质,在细胞的运动和细胞内物质传递方面起着重要作用。肌球蛋白轻链2(MYL2)是一种蛋白质编码基因,作为调节性轻链,由位于第17号染色体上的基因编码167个氨基酸组成。与MYL2 相关的途径包括指导线索和生长锥运动以及 cAMP 依赖性蛋白激酶A的激活。肌球蛋白轻链3(MYL3)也是肌球蛋白家族成员,由199个氨基酸组成。早期研究发现,MYL3通过与钙离子结合促进肌肉发育,从而参与横纹肌的收缩。有研究报道,MYL2已被证明是在胃肠道疾病中改变细胞旁通透性的关键调节蛋白,这说明MYL2可能在黑素小体从树突释放,再到传递给周围角质细胞过程中起作用。另外值得注意的是,MYL2和MYL3在心肌细胞中高度表达,而在其他组织中的表达量不高,但是本文实验结果在鸡皮肤组织中也检测到MYL2和MYL3的表达,并且在不同颜色的皮肤组织中表达有显著差异。这暗示MYL2和MYL3不仅在鸡的皮肤中也有表达,而且可能参与了鸡皮肤颜色加深这一过程。

黑素细胞中的黑素体转运被认为是两个步骤。在合成后,黑素体被认为通过由小 GTPase Rab7调节的驱动蛋白和动力蛋白马达的作用沿着微管进行快速、长距离运输到树突中。它们通过与肌球蛋白募集介导的肌动蛋白细胞骨架相互作用而保留在那里。该模型基于对源自稀释突变小鼠(缺乏肌球蛋白)的黑素细胞的观察,其中黑素体聚集在细胞核周围,而不像野生型黑素细胞那样遍布外周细胞质和树突。另外两只突变小鼠,缺乏 Rab27a 蛋白和缺乏嗜黑素蛋白(Mlph),表现出相似的黑素体分布,这些蛋白质似乎将肌球蛋白Va 运动锚定在黑素小体上。这种机制允许黑素体保留在树突中,并在转移到角质形成细胞之前沿着肌动蛋白丝向质膜进行短的肌球蛋白驱动运动。本实验对肌球蛋白组成结构中的肌球蛋白轻链进行测定,结果显示黑皮肤组织中MYL2和MYL3的表达显著下调。这显示MYL2和MYL3的表达或许与肌球蛋白Va影响黑色素的生成是负相关。有结果证明,在小鼠黑素细胞中,其中依赖于微管的黑素体运动是双向的。有实验证明在人的黑素细胞中,与微管相关的双向黑素体运动受到了细胞质动力蛋白和驱动蛋白控制。黑素小体在驱动蛋白的作用下向微管的正方向运动即往树突方向转运黑色素细胞,相反动力蛋白则向反方向运动。黑素小体到达微管端部必须依赖于两种动力相互协调的作用。这表明转运至树突远端的黑素小体为了使其靠近树突胞膜必须调控好其反向细胞核周围的反向运动。树突远端是肌动蛋白的富集区域,当黑素小体一旦与肌球蛋白Va完成结合,这种长距离双向运动就会马上停止。此时,黑素小体就会只限定于树突的远端区域并做短距离的局部运动。这提示MYL2和MYL3或许在黑素小体与肌球蛋白结合过程中起到了抑制作用,即二者在双向运动中阻止黑素小体靠近树突远端,从而导致黑素小体转运受到抑制,黑色素形成受阻,最终皮肤肤色变淡。至于MYL2和MYL3基因如何调控的,还有待于进一步研究。

肌球蛋白已被证明在囊泡运输、肌动蛋白组织和细胞运动中发挥作用。激酶和磷酸酶是许多细胞过程的关键调节成分。肌球蛋白发挥其作用时以激酶-磷酸酶途径最为突出,即肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)。肌球蛋白轻链激酶(MLCK),是一种钙调素(calmodulin,CaM)依赖酶。当MLCK活性和表达增强时,将催化肌球蛋白轻链的磷酸化,诱导细胞内Ca+增加,导致肌动球蛋白激活其ATP酶,从而导致平滑肌进行收缩。有研究显示MYL2磷酸化诱导的肌球蛋白环收缩是调节肠黏膜的生理和病理的关键途径,肌球蛋白环收缩会导致紧密连接结构和组成的分子重组,包括闭合蛋白内吞作用。至于鸡皮肤组织中是否由于肌球蛋白轻链磷酸化影响导致MYL2和MYL3表达的下调,进而引起鸡肤色的加深还有待于进一步研究。

本实验通过对黑肤鸡和白肤鸡皮肤组织中MYL2和MYL3基因表达的检测,发现MYL2和MYL3表达的下调可能使得鸡皮肤颜色加深,提示肌球蛋白轻链家族很可能影响肌球蛋白的功能,进而参与了鸡皮肤黑色素转运这一过程。