不同条件下兔骨骼肌肌球蛋白流变特性的研究

许 柯，吴 烨，徐幸莲*，周光宏

(南京农业大学 教育部肉品加工与质量控制重点实验室，江苏 南京 210095)

不同条件下兔骨骼肌肌球蛋白流变特性的研究

许 柯，吴 烨，徐幸莲*，周光宏

(南京农业大学 教育部肉品加工与质量控制重点实验室，江苏 南京 210095)

研究不同蛋白质量浓度、温度、pH值、KCl浓度下两种不同肌肉类型——腰大肌(白肌)(Pasoas major，PM)和半膜肌(红肌)(Semimembranosus proprius，SMp)的肌球蛋白的流变学特性。借助于幂率定律， Arrhenius方程，计算出K(黏度系数)、n(流变指数)和Ea(流动活化能)。结果表明：不同条件下的肌球蛋白溶液均呈假塑性流体特征，τ(剪切应力)和δ(剪切速率)的关系可以用幂函数表示；K和n受蛋白质量浓度、温度、pH值 、KCl浓度的影响，PM和SMp肌球蛋白变化一致。用多项式方程可以描述肌球蛋白的黏度系数和蛋白质量浓度的关系，用Arrhenius 方程可以较好地描述温度对肌球蛋白流变特性的影响。

肌球蛋白；流变特性；静黏弹性

Abstract：An investigation of rheological properties of myosin from two rabbit muscle types (Pasoas major, PM andSemimembranosus proprius, SMp) was carried out under different levels of protein concentration, temperature, pH value and KCl concentration.K(viscosity coefficient),n(flow index) andEa (activation energy) were calculated following the power law or the Arrhenius equation, and from the results of calculation, it can be concluded that myosin is a pseudoplastic fluid under different conditions, and that the relationship between sheer stress (τ) and sheer rate (δ) is a power law function.Kandnwere influenced by protein concentration, temperature, pH and KCl concentration, and myosins from both rabbit muscle types had identical changes in the two parameters. The relationship between viscosity coefficient and protein concentration complied with a polynomial equation, and the Arrhenius equation could describe the influence of temperature on the flow behavior of rabbit skeletal myosin well.

Key words：myosin；rheological property；static viscoelsaticity

肌球蛋白是肌肉中含量最高也是最重要的蛋白质，约占肌肉总蛋白质的1/3，在肉品加工中具有重要的功能性质(如持水性、黏合性、胶凝性、乳化性等)。肌球蛋白的功能特性直接影响肉制品的质量，肌球蛋白的凝胶特性决定着肉糜制品的质量，包括肉糜制品(如火腿肠等)的硬度、弹性、切片性和产率等[1]，pH值、盐浓度、温度等因素影响着肌球蛋白的凝胶特性[2]。流变学的基本内容是弹性力学和黏性流体力学，是食品力学性质方面的物性理论。黏性是表现流体流动性质的指标，黏性流动分为牛顿流动和非牛顿流动。流变特性指数n的大小反映了流体的类型，当0＜n＜1时，流体为假塑性流体；当n＞1时，流体为胀塑性流体[3]。目前对肌球蛋白溶液升温过程中的贮能模量(G′)和损耗模量(G〞)这些动黏弹性参数研究比较多，曾宪明等[4]测定了兔肌球蛋白升温过程中G′和相位角δ，刘海梅[5]测定了不同pH值和蛋白浓度下升温过程中鲢鱼肌球蛋白的G′，董永等[6]测定了不同季节草鱼骨骼肌肌球蛋白升温过程中的G′、G〞和tanδ。而对揭示流体本质特性的静黏弹性参数的研究较少，因此，本实验对肌球蛋白的静黏弹性参数及其变化规律进行研究，揭示不同条件对肌球蛋白流变学特性的影响，为肉制品的加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3月龄雄性新西兰白兔(2～2.5kg)购于江苏省农业科学院。

KCl、K2HPO4、KH2PO4、EDTA、焦磷酸钠、PIPES、(NH4)2SO4等所用试剂均不低于分析纯。

1.2 仪器与设备

Physica MCR301旋转流变仪 奥地利安东帕公司；Waring高速组织捣碎机 美国思伯明设备有限公司；UV-754分光光度计 上海第三仪器厂；Avanti J-E落地式高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提纯

健康的雄性新西兰白兔，宰前充分休息过夜，以减少应激。机械击昏后切断颈部血管，充分放血，迅速剥皮，去头、内脏、爪，先后用自来水、蒸馏水冲洗以去除血迹。将腰大肌(Pasoas major， PM)肌球蛋白和半膜肌 (Semimembranosus proprius，SMp) 肌球蛋白剥离后置于－20℃冰箱0.5h，使其迅速冷却，剔除可见脂肪和结缔组织，切碎后称质量。用高速组织捣碎机搅打约30s，在0～4℃下提取肌球蛋白，方法参照Wang等[7]。纯化的肌球蛋白溶解在溶液(0.6mol/L KCl，pH 6.0，20mmol/L 磷酸缓冲液)中，搅拌透析24h，中间换两次透析液。透析后的肌球蛋白贮存于0～4℃，在1周内使用完。

1.3.2 蛋白质量浓度测定

采用双缩脲法测定蛋白质量浓度，牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白[8]。

1.3.3 不同蛋白质量浓度、温度、pH值、KCl浓度下肌球蛋白溶液的流变特性测定

将提取纯化得到的肌球蛋白溶解在不同的透析液中，搅拌透析24h，中间换两次透析液，以达到所需的不同蛋白质量浓度(5、10、15、20mg/mL)、pH值(6.0、6.5、7.0、7.5)、KCl浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mol/L)。

不同蛋白质量浓度下的肌球蛋白溶液KCl浓度为0.6mol/L，pH 6.0。不同温度下的肌球蛋白溶液蛋白质量浓度为15mg/mL，KCl浓度为0.6mol/L，pH值为6.0。不同pH值下的肌球蛋白溶液蛋白质量浓度为10mg/mL，KCl浓度为0.6mol/L。不同KCl浓度下的肌球蛋白溶液蛋白质量浓度为15mg/mL，pH值为6.0。

在4℃的条件下，测量板和载物台间距为0.5mm。用不同的剪切速率(δ)(2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024s-1)测定相应的τ(剪切应力)，根据幂率定律求出不同蛋白质量浓度、pH值、KCl浓度下的K和n[9]。

式中：τ为剪切应力/Pa；δ为剪切速率/s-1；K为黏度系数/(Pa·sn)；n为流变指数。

研究温度对肌球蛋白溶液流变学特性的影响时，实验温度分别设为4、10、15、20℃，并通过Arrhenius方程[10]描述温度对肌球蛋白溶液K的影响。

式中：K代表黏度系数/(Pa·sn)；A为指前因子/(Pa·sn)，为常数；e为自然对数的底(e=2.718)；Ea指流动活化能/(J/mol)，反映了高分子流动的难易程度；t即温度/℃；R指摩尔气体常数，8.314J/(mol·K)。

1.3.4 数据统计分析

各指标重复测定3次，实验数据均用Excel和SAS(Statistics Analysis System)8.2处理，差异显著性建立在P＜0.05水平，用Matlab 2007a进行数据拟合。

2 结果与分析

2.1 蛋白质量浓度对肌球蛋白溶液流变特性的影响

图1 不同蛋白质量浓度下肌球蛋白的流变曲线Fig.1 Rheological curves of PM and SMp myosins under different protein concentrations

由图1可知，随着剪切速率的增大，剪切应力也随之增大，并且随着蛋白质量浓度的增大，剪切应力也随之增大，PM和SMp肌球蛋白的变化一致。20mg/mL蛋白质量浓度，1024s-1剪切速率条件下，PM肌球蛋白的剪切应力(67.48Pa)大于SMp肌球蛋白(61.5Pa)。

采用幂率定律(方程1)用Matlab进行拟合，得到肌球蛋白溶液的K，n值，结果见表1。

表1 蛋白质量浓度对肌球蛋白流变参数的影响Table 1 Power law parameters of PM and SMp myosins under different protein concentrations

R2反映的是拟合精度，拟合得到PM肌球蛋白的流变参数的R2在0.9129以上，SMp肌球蛋白的流变参数的R2在0.9278以上，说明该蛋白质量浓度下的肌球蛋白溶液对幂率定律具有极高的拟合精度。不同蛋白质量浓度下的流变指数n均小于1，表明该条件下肌球蛋白溶液均为假塑性流体。随着蛋白质量浓度的增大，黏度系数K也逐渐增大。PM肌球蛋白的K从0.503Pa·sn增大到了2.463Pa·sn，而SMp肌球蛋白的K从0.418Pa·sn增大到了1.873Pa·sn，说明PM肌球蛋白的黏度系数受蛋白质量浓度影响更大，而相同蛋白质量浓度下的K也是PM大于SMp肌球蛋白。

采用(3)、(4)、(5)三式[11]分别拟合K和蛋白质量浓度C的关系，结果见表2。

表2 肌球蛋白质量浓度与黏度系数的数学模型Table 2 Mathematic models between protein concentration and viscosity coefficient for PM and SMp myosins

由表2可见，三个方程的R2都大于0.92，说明这些模型拟合精度很高，均能很好的说明描述黏度系数和蛋白质量浓度的关系。对于PM肌球蛋白，方程5的R2最大，达到了0.9869，K=1.08×10-2C2－0.15C+1可以描述黏度系数和蛋白质量浓度的关系。对SMp肌球蛋白，也是方程(5)的R2最大，达到了0.9819，K=9.86×10-3C2－0.15C+1可以描述黏度系数和蛋白质量浓度的关系。

2.2 温度对肌球蛋白溶液流变特性的影响

研究发现25℃下测定的肌球蛋白的剪切应力已经很小，在1024s-1条件下PM肌球蛋白的剪切应力只有5.2Pa，50℃时1024s-1条件下的剪切应力只有3.1Pa。表明肌球蛋白已经发生了微弱的聚集，所以实验温度范围定为4～20℃。

图2 不同温度下肌球蛋白的流变曲线Fig.2 Rheological curves of PM and SMp myosins under different temperatures

从图2可见，随着剪切速率的增大，剪切应力也随之增大，并且随着温度的升高，剪切应力随之减小。4℃条件下的剪切应力最大，在1024s-1条件下PM肌球蛋白的剪切应力达到了22.3Pa，SMp肌球蛋白的剪切应力达到了33.6Pa。20℃条件下测定的剪切应力最小，在1024s-1条件下的PM肌球蛋白的剪切应力只有8.6Pa，SMp肌球蛋白的剪切应力只有10.9Pa。

采用幂率定律(方程1)用Matlab进行拟合，得到肌球蛋白溶液的K，n值，结果见表3。

表3 温度对肌球蛋白流变参数的影响Table 3 Power law parameters of PM and SMp myosins under different temperatures

拟合得到的PM肌球蛋白的流变参数除了20mg/mL质量浓度的R2为0.902外，其他都在0.960以上，拟合得到的SMp肌球蛋白的流变参数除了20mg/mL质量浓度的R2为0.8852外，其他都在0.980以上，说明该温度下的肌球蛋白溶液对幂率定律具有极高的拟合精度。不同温度下的肌球蛋白溶液流变指数n均小于1 ，表明该条件下肌球蛋白溶液均为假塑性流体。随着温度的升高，蛋白质分子运动加强，蛋白质结构发生变化，蛋白质间发生相互作用[12]。在温度小于40℃时，重酶解肌球蛋白或其亚基纤丝之间相互交联，使溶液具有凝胶性[13]，所以K逐渐变大，PM和SMp肌球蛋白变化一致。

Arrhenius方程常用来描述流变学参数对温度的依赖性[14]，采用Arrhenius方程对PM和SMp肌球蛋白溶液的黏度系数与温度的关系进一步拟合，结果见表4。

表4 肌球蛋白的黏度系数与温度的数学模型Table 4 Mathematic models between protein concentration and viscosity coefficient for PM and SMp myosins

由表4可见，对于PM肌球蛋白，R2为0.9746，拟合精度很高，可以用方程2描述温度对PM肌球蛋白溶液K的影响。对于SMp肌球蛋白，R2为0.8762，也可以用方程2描述温度对SMp肌球蛋白溶液K的影响。方程2反映黏度系数对温度敏感程度的量度，即Ea越大，黏度系数对温度的变化越敏感。即流动活化能增大，流体的流动性变差，黏弹性变强[15-16]。 PM和SMp肌球蛋白的流动活化能分别为26250J/mol 和20090J/mol，PM的活化能较高。吸收的热量越大，根据能量守恒定律，所以最终形成的热凝胶强度越大。骨骼肌肌肉被分为红肌(慢肌)和白肌(快肌)，红肌与白肌不仅生物化学特性不同，而且化学组成也存在差异。Fretheim等[17]研究牛肉中红肌和白肌肌球蛋白的凝胶特性发现，白肌肌球蛋白形成的凝胶强度比红肌肌球蛋白的大，本结果和其相似，说明PM代表的白肌的凝胶强度大于SMp代表的红肌。

2.3 pH值对肌球蛋白溶液流变特性的影响

图3 不同pH值下肌球蛋白的流变曲线Fig.3 Rheological curves of PM and SMp myosins under different pH values

从图3可见，随着剪切速率的增大，剪切应力也随之增大。随着pH值的增大，剪切应力相应减小，但当pH值为7.5时，又开始变大。PM肌球蛋白的剪切应力在1024s-1、pH7.5条件下，达到了最大，为12.1Pa；而SMp肌球蛋白的最大剪切应力在1024s-1、pH6.0条件下，达到了8.62Pa，相对应的pH7.5条件下的剪切应力为8.34Pa，仅增大了0.28Pa。

采用幂率定律(方程1)用Matlab进行拟合，得到肌球蛋白溶液的K，n值，结果见表5。

表5 pH值对肌球蛋白流变参数的影响Table 5 Power law parameters of PM and SMp myosins under different pH values

拟合得到的PM肌球蛋白的流变参数的R2都在0.940以上，拟合得到的SMp肌球蛋白的流变参数的R2都在0.970以上，说明该pH值下的肌球蛋白溶液对幂率定律具有极高的拟合精度。不同pH值下的肌球蛋白溶液流变指数n均小于1，表明该条件下肌球蛋白溶液均为假塑性流体。随着pH值的升高，K先变小后变大，n先变大后变小，PM和SMp肌球蛋白变化一致。肌球蛋白的等电点在5.3左右[18]，pH值接近等电点时，蛋白容易聚集。远离等电点时，分子间斥力占主导地位，互相排斥，导致黏度系数变小。而当pH值为7.5时，可能是由于分子间的距离达到足够大，分子之间的引力起主导作用，所以黏度系数又有所增大。

2.4 KCl浓度对肌球蛋白溶液流变特性的影响

由图4可知，随着剪切速率的增大，剪切应力也随之增大，并且随着KCl浓度的增大，剪切应力也随之增大。KCl浓度为1.0mol/L，1024s-1剪切速率条件下PM肌球蛋白的剪切应力达到最大值24.5Pa，大于SMp肌球蛋白的最大值21.2Pa。

图4 不同KCl浓度下肌球蛋白的流变曲线Fig.4 Rheological curves of PM and SMp myosins under different KCl concentrations

采用幂率定律(方程1)用Matlab进行拟合，得到肌球蛋白溶液的K、n值，结果见表6。

表6 KCl浓度对肌球蛋白流变参数的影响Table 6 Power law parameters of PM and SMp myosins under different KCl concentrations

拟合得到PM肌球蛋白的流变参数的R2都在0.980以上，拟合得到SMp肌球蛋白的流变参数的R2都在0.960以上，说明该KCl浓度下肌球蛋白溶液对幂率定律具有极高的拟合精度。不同KCl浓度下的肌球蛋白溶液流变指数n均小于1，表明该条件下肌球蛋白溶液均为假塑性流体。随着KCl浓度的增大，K先变大再变小后变大， PM和SMp肌球蛋白变化一致。肌球蛋白在低盐浓度下不溶，在高盐浓度下可溶，所以黏度系数随着KCl浓度的增大而增大。而之后减小是由于盐浓度的增大使肌球蛋白分子的单体数增多，导致了黏度系数的减小。

3 结 论

不同蛋白质量浓度、温度、pH值、KCl浓度下的肌球蛋白溶液为非牛顿流体，其剪切应力τ和剪切速率δ的关系可以用幂函数τ=K·δn表示。不同条件下的肌球蛋白溶液流变指数n均小于1，表明其为假塑性流体。K和n受蛋白质量浓度、温度、p H值、K C l浓度的影响，两种不同肌肉类型的肌球蛋白溶液变化一致。用多项式方程K=1.08×10-2C2－0.15C+1可以描述PM肌球蛋白溶液的黏度系数和蛋白质量浓度的关系，K=9.86×10-3C2－0.15C+1可以描述SMp肌球蛋白溶液的黏度系数和蛋白质量浓度的关系。25℃以上肌球蛋白已经发生了聚集，温度对黏度系数影响的数学模型为，由该方程二次拟合得到的PM肌球蛋白的流动活化能为26250J/mol，大于SMp肌球蛋白的流动活化能20090J/mol，反映了白肌形成凝胶的强度大于红肌的原因。

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Rheological Properties of Rabbit Skeletal Myosin under Different Conditions

XU Ke，WU Ye，XU Xing-lian*，ZHOU Guang-hong
(Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095, China)

TS201.7

A

1002-6630(2010)21-0010-05

2010-06-01

国家自然科学基金项目(30771526)

许柯(1987—)，男，硕士研究生，研究方向为肉制品质量控制。E-mail：tzxhxk_2004@163.com

*通信作者：徐幸莲(1962—)，女，教授，博士，研究方向为畜产品加工与质量控制。E-mail：xlxu@njau.edu.cn