肌球蛋白磷酸化的研究进展

郝丽娟 康志琼 马上上 吕鹏 姚勤 陈克平

摘要：肌球蛋白是肌原纤维粗丝的组成单位，由多条重链与多条轻链组成，被视为一种分子马达。在肌肉收缩、趋化性胞质分裂、胞引作用、膜泡运输以及信号传导等生理过程中起重要作用。目前肌球蛋白磷酸化是研究的一个热点，它对细胞的迁移、收缩、胞质分裂以及其他未知功能都有着至关重要的作用。肌球蛋白磷酸化 分为重链的嶙酸化与轻链的磷酸化。根据国内外的最新相关研究报道，分别从肌球蛋白的结构与功能、磷酸化的作用机制、磷酸化的生物学功能以及最新研究成果等方面，对肌球蛋白的嶙酸化研究进展进行阐述。关键词：肌球蛋白；β-抑制蛋白；肌球蛋白重链磷酸化；肌球蛋白轻链磷酸化中图分类号：Q71 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）02-0154-06Progresses on Myosin PhosphorylationHAO Li-juan， KANG Zhi-qiong， MA Shang-shang， LU Peng， YAO Qin， CHEN Ke-ping*（Life Sciences Institute， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， Jiangsu， China）Abstract ： Myosin is the unit of myofibril raw silk， composed of multiple heavy chains and light chains， is regarded as a kind of molecular motors. It mainly works on muscle contraction， chemotaxis cytoplansmic* division， cell function， vesicular transport and signal transduction. Recently myosin phosphorylation is a hot topic， as it plays an important role in cell migration， contraction， cytokinesis and other unknown functions. Myosin phosphorylation is divided into heavy chain and light chain phosphorylation. According to the latest reports， it mainly elaborates the research progress on the phosphorylation of myosin on the structures and functions， the action mechanism of phosphorylation， the biological function of phosphorylation and the latest research results.Key words： myosin；β-Arrestin；phosphorylation of myosin heavy chain；phosphorylation of myosin light chain （LifeScienceResearch，2015，19（2）：154-159）l肌球蛋白的结构与功能肌球蛋白主要存在于平滑肌中，它是肌原纤维粗丝的组成单位。其分子形状如豆芽状，由多条重链与多条轻链组成。肌球蛋白的家族较大，目前发现的肌球蛋白有24种，但依据其来源又可分为传统的肌球蛋白和非传统的肌球蛋白，如传统的肌球蛋白为肌肉的肌球蛋白，即肌球蛋白Ⅱ，但非肌肉细胞也存在肌球蛋白Ⅱ，为非肌肉肌球蛋白Ⅱ；非传统的肌球蛋白是指肌肉中不含有的肌球蛋白，如肌球蛋白I、Ⅲ、IV、V，只存在于非肌肉细胞中；肌球蛋白VⅢ、XI和XⅡ只存在于植物当中。此外，肌球蛋白I在生物体内的作用是细胞运动，胞引作用和泡液收缩；骨骼肌肌球蛋白Ⅱ的作用是使骨骼肌肌肉收缩；肌球蛋白v主要功能是靶向小包运输和mRNA的靶向运输[1]。在生物有机界中，利用化学含故化学势能进行机械做功的生物大分子，称为分子马达。而肌球蛋白作为一种分子马达[2]，参与了肌肉收缩、趋化性胞质分裂、胞引作用、膜泡运输以及信号传导等活动[1]。目前研究得较多的是肌球蛋白Ⅱ，其最早发现于动物细胞的肌肉组织和细胞质中，形状如“Y”型，是一个六聚体的大分子蛋白质，包括两条相对分子质量约为220kD的重链、两条约17kD的必须轻链和两条约20kD的调节性轻链[3]。根报重链在细胞内所起的作用，按照结构和功能不同可划分为3个区域：1）位于重链的N末端形成-个球状的头部，含有一个肌动蛋白（actin）结合位点和ATP结合位点的催化区域，负责释放化学能；2）重链的C末端则形成一个细长的a-螺旋状的尾部，尾部结构域含有决定尾部是同膜结合还是同其他的尾部结合的位点；3）连接头尾的是a-螺旋状的颈部，其与必须轻链、调钙素或类似钙调素的调节轻链相连，颈部是起到水平臂作用的区域，在这个区域中通过ATP水解将产生动力冲程，实现将化学能转化为机械能[4]。通过对各个物种的肌球蛋白重链，轻链序列的功能结构域分别进行氨基酸水平上的多序列比对，结果发现肌球蛋白较为保守，只是个别氨基酸序列存在差异，这表明各个物种肌球蛋白磷酸化的作用机制与功能大体一致（图1）。2肌球蛋白轻链的磷酸化由肌动蛋白-肌球蛋白（actin-myosin）相互作用介导的细胞收缩，对肌肉与非肌肉细胞的一些生理活动起着至关重要的作用，包括细胞分裂、粘连、趋化性和胞质分裂[5]，其动力学活性会调控细胞收缩，调节血管渗透性，控制平滑肌细胞中的血压[6]。2.1肌球蛋白轻链磷酸化的作用机制肌球蛋白（平滑肌与非肌肉蛋白）受肌球蛋內轻链（MLC）磷酸化调控[7]。磷酸化的肌球蛋白是维持细胞骨架活性及细胞功能的重要效应因子[8、9]。肌球蛋白轻链激酶（myosinlightchainkinase，ML-CK）和ROCK/ROK/Rho激酶（Rhokinase，ROCK）是在体内和体外使MLC磷酸化的两种重要激酶通常认为，当Ca2+与钙调蛋白复合体（Calmodulincomplexes，CaM）结合后，会激活MLCK，进而ML-CK使肌球蛋白轻链20（myosinlightchain20，MLC20）上第19位的丝氨酸（Serl9）磷酸化，导致激活肌球蛋白头部的Mg2+-ATP酶（简称ATP酶）[11]，该酶水解ATP产生能量会使其构象发生转变，这种构象会使肌球蛋白去结合肌动蛋白（actm），利用ATP形成一种细胞收缩的压力[12]。相反地，用肌球蛋白轻链隣酸酶（（myosinlightchainphosphatase，MLCP）使MLC去磷酸化后会使构象弯曲，结合肌动蛋白的能力下降。MLCP是一个异源三聚体蛋白，由磷酸酶（PP1C）、肌动蛋白结合区和调节区域（MYPH以及一个20kD的小亚基（ML20）组成，但ML20的功能尚不清楚。MLC的这种周期性的磷酸化与去磷酸化的状态，是细胞发生运动和收缩的必备条件[13]。RhoA的效应分子ROCK-是肌球蛋白磷酸化和调节肌球蛋白功能的另一个重要调节因子，它使肌球蛋白结合肌球蛋白磷酸酶（MLCP）的位点（MBS）磷酸化[15]，抑制MLCP活性，从而增加了肌球蛋白的磷酸化水平，诱导RhoA介导的应力纤维和粘着斑装配。在平滑肌和非肌细胞中，ROCK还能直接磷酸化MLC刺激肌球蛋白收缩[16]。对于所有的肌球蛋白，大体机制都可以解释为当肌动蛋白结合到马达区域时，马达运动由于在活性位点ATP诱导的构象发生变化引起RD（一种调控区域可以使必须轻链、调节轻链以及重链结合）旋转ln]。RD包含着重链（heavychain，HC）的一段较长的螺旋，可以使调节轻链（regualatelightchain，RLC）和必须轻链（essentiallightchain，ELC）以反向平行的方式结合。轻链可以稳定HC螺旋，然后作为一个较为自由的转换器，由一种构象转换为另一种构象去产生工作的动力。2.2肌球蛋白轻链磷酸化的主要生物学功能2.2.1磷酸化对细胞迁移的调节Totsukawa等在2004年将成纤维细胞作为研究材料发现，MLCK与ROCK在调节MLC磷酸化时，在MLC所处的不同空间分布中起着不同的作用。在细胞迁移中MLCK诱导细胞周边和前端肌球蛋白轻链磷酸化，ROCK诱导细胞中心肌球蛋内轻链磷酸化。肌球蛋白Ⅱ在细胞周边的磷酸化有两种功能：第一，阻止由肌动蛋白多聚化产生的突触，以便于细胞迁移；第二，位于细胞周边的肌球蛋白Ⅱ磷酸化对在运动细胞的前端装配成熟的粘附结构是必需的[16]。2.2.2磷酸化对细胞收缩行为的影响肌球蛋白Ⅱ产生的收缩力不仅为细胞的迁移提供动力，在维持细胞形态，促进伤口愈合，介导胞外基质和细胞信号转导中也起着重要的作用[16]。Beningo等使用特异性抑制剂blebb1Stam处理后，发现抑制了肌球蛋白Ⅱ的收缩活动，同时抑制ROCK也会很大程度减少肌球蛋白Ⅱ的收缩[18]。2.2.3磷酸化对细胞形态与凋亡的影响肌球蛋白Ⅱ的活性对于应力纤维粘着斑的形成是必需的。ROCK使肌球蛋白结合肌球蛋白磷酸酶（MLCP）的位点（MBS）磷酸化，抑制肌球蛋白磷酸酶活性，从而增加了肌球蛋白的磷酸化水平，诱导RhoA介导的应力纤维和粘着斑装配。而且它还与整合素介导的一些信号通路相关[16]（表1）。P114RhoGEF是一种RhoA激活剂，能结合到肌球蛋白TIA上，并起到一定的调控作用[19、20]，有数据显示，P114RhoGEF能驱动上皮细胞的迁移，变形虫的运动以及肿瘤细胞的入侵[21]。2.3肌球蛋白轻链磷酸化的最新研究成果2.3.1β-抑制蛋白调控的嶙酸化2013年ElieSimard等通过利用兔子的骨骼肌，发现β-抑制蛋白可以调控由血管紧张肽Ⅱ型la受体（ATlaR）刺激的肌球蛋白MLC的磷酸化。β-抑制蛋白属于抑制蛋內家族，包括β-抑制蛋白-1和β-抑制蛋白-2，它可以在哺乳动物组织中广泛表达[5]。抑制蛋白介导G蛋白耦联受体和其他一些受体的信号通路的调控，在细胞的生长、凋亡及免疫功能中都发挥了重要作用，并且与一些疾病的发病密切相关。一些研究表明，β-抑制蛋白-1对于激活RhoA/ROCK以及迫使形成肌纤维是不可缺失的。一些G蛋白偶联受体（GPCRs），如血管紧张肽Ⅱ型la受体（ATlaR），参与调控细胞收缩[12]。而ATlaR的拮抗剂Ⅱ（AngⅡ）能够很好地防治血管收缩类的疾病[22]。另外，Elie Simard等利用酵母双杂交系统研究发现，由于β-抑制蛋白-1的163-253位氨基酸包含MYPT-1的结合区域，所以β-抑制蛋白-11-418位氨基酸和1-253位氨基酸会与MYPT-1的643-943位氨基酸相互作用。当受到ATlaR的刺激时，β-抑制蛋白-2也会与MYPT-1（肌球蛋白调控区域）相结合。通过β-抑制蛋白诱导会激活ATlaR的信号通路，促进MLC的磷酸化，而β-抑制蛋白-2/MYPT-1复合体会阻断到MLCP亚基的人口，亲和性降低，所以β-抑制蛋白-2会使MLC去磷酸化。周期性的MLC磷酸化会加速细胞收缩[23]。此研究表明，β-抑制蛋白对于MLC的磷酸化与去磷酸化是不可缺失的，当肌肉细胞中缺失β-抑制蛋白-1，在应对ATlaR的刺激下，MLC的磷酸化水平会下降。经实验发现，这可能是基于两方面的原因：其一是MYPT-1远离了MLCP的复合体；其二是依赖失抑制蛋白-1的RhoA因子水平下降[24]，随后ROCK活性损失，MLCP活性增强；但当肌肉细胞中缺失抑制蛋白-2，在ATlaR的拮抗剂Agonist的刺激下，会使MLC磷酸化水平升尚。有趣的是，两种β-抑制蛋白会相互调控MLC的磷酸化，缺失抑制蛋白-1或者抑制蛋白-2对细胞收缩和运动都会有相似的效果。因此，MLC的磷酸化对细胞收缩和驱动细胞运动起着关键性作用（图2）。2.3.2ELC与RLC相互作用对磷酸化的影响上文提到，肌球蛋白由重链与轻链组成，而轻链又是由必须轻链（ELC）与调节轻链（RLC）构成。对于所有的肌肉组织，收缩与释放都是由细胞内的Ca2+含量变化调控的。在横纹肌中，合到细肌丝的肌钙蛋白的复合体上激活肌动蛋白-肌球蛋白（actin-myosin）ATP酶，因而发生肌肉收缩。相比较而言，在软体动物与脊椎动物的平滑肌和非肌肉细胞中，收缩的方式有两种：其一直接由Ca2+结合到肌球蛋白IIELC2上；其二是由RLC的N-端区域磷酸化，这种磷酸化由Ca2+依赖的ML-CK调控的。肌球蛋白调控的结构机制首次以原子级的分辨力揭示，扇贝肌球蛋白II的RD构造包含着ELC和RLC，以及可以结合一部分轻链的HC[25、26]。在扇贝肌球蛋白中，Ca2+会结合到ELC-N端结构域I中的EF臂的上。2012年ShaoweiNi等通过用鸡的平滑肌HMM在Sf9细胞中表达后得到HC、RLC与ELC的全长。研究发现，必须轻链（ELC）与调节轻链（RLC）交界处的修饰会阻断激活平滑肌肌球蛋白依赖的磷酸化。他们表达了16个平滑肌水解重酶解肌球蛋白（SmHMM），两条MLC与周围的HC的衔接处发生突变。结果发现：1）RLC被MLCK磷酸化；2）亚基组成是正常的，突变并不会降低ELC或者RLC结合到HC的能力；3）依赖肌动蛋白激活的ATPase的动力学以及在体外运动的机械性能在去磷酸化的状态下与WTHMM相一致；4）对于磷酸化的水解重酶解肌球蛋白（HMM），缺失肌动蛋白（actin）状态下其ATPase活性会被抑制。另外，当阻断RLC与ELC的相互作用时，磷酸化不再有激活HMM捕捉肌动蛋白的能力。经研究发现，这种现象与RLC的M129Q与G130C的突变有关。M129Q和G130C对于稳定结构，激活捕捉actin的能力起着关键作用。同时研究发现，与Asp-131相互作用的HC突变体Q826A，也可以起稳定RLC/ELC的相互作用（图3）。通过突变HC、RLC以及ELC去破坏S者之间的相互作用，若不发生磷酸化，所有的突变体都与野生型（wt）的现象相似，相反，肌球蛋白会运动缓慢，ATPase活性下降。分子动力学研究表明，阻断RLC/ELC的相互作用会导致肌球蛋白弹性增加，很可能会阻碍磷酸化的激活。因此作者猜想，RLC磷酸化重要的功能就是去维持RLC与ELC相互作用的完整性。一旦RLC/ELC相互作用阻断，结构破坏，就不会再受到磷酸化的调控的影响[27]。3肌球蛋白重链的磷酸化非肌肉肌球蛋白Ⅱ是一个六聚体复合物，由两条重链（NMHC-II）、两条必须轻链、两条调节轻链组成。在脊椎动物中，NMHC-n有3种异构体，分别是NMHC-IIA（MYH9）、NMHC_IIB（MYHIO）以及NMHC-nCCMYHM）[28]，在组织和细胞形态中都会表现出不同的模式虽然NMHC-II的异构体会有很高的保守性，但是一些酶的活性还是有些差异的[30]。另外，NMHC-Ⅱ在细胞中的定位也不一样[31]，也会与不同的蛋白结合[32]。3.1重链磷酸化的作用机制在哺乳动物细胞中，肌球蛋白Ⅱ调节轻链的丝氨酸19（Ser-19）的磷酸化普遍地参与了体内装配的调控[33]，但是，存在一种证据证明非肌肉肌球蛋白Ⅱ装配的调控是可以通过重链的磷酸化来实现的，特别是蛋白激酶C（PKC）与酪蛋白激酶2（CK2）对肌球蛋白Ⅱ-A与Ⅱ-B有着至关重要的作用，PKC会使NMHC-IIA的Serl916磷酸化[34]。通过PKC或者CK2使重链磷酸化会减少肌球蛋白Ⅱ异构体装配成肌丝[35]。涉及到磷酸化作用，肌球蛋白Ⅱ-A装配可以通过结合转移因子mtsl或者钙结合蛋白S100A4来调控[36]。S100A4会优先地结合到非肌肉肌球蛋白Ⅱ-A[37]，然后促进单体的、未装配的肌球蛋白Ⅱ-A装配[38]。CK2使NMHC-ⅡA的Serl943磷酸化会抑制钙结合蛋白S100A4结合以及S100A4诱导的单纤维的装配，S100A4介导的肌球蛋白Ⅱ-A肌纤维的去磷酸化[39]。因此，重链的磷酸化以及Ca2+的结合会调控S100A4与肌球蛋白Ⅱ-A的相互作用。3.2肌球蛋白重链磷酸化的生物学功能及最新研究成果3.2.1重链磷酸化对癌细胞迁移的调控2007年NatalyaG.Duiyaninova等研究发现，肌球蛋白Ⅱ-A重链磷酸化可以调控MDA-MB-231癌细胞的迁移。研究中选取了人类胸腺癌细胞肌球蛋白Ⅱ-A重链，其磷酸化会依赖表皮生长因子（epidermalgrowthfactor，EGF）。EGF通过刺激MDA-MB-231细胞会导致装配与重链磷酸化的瞬时增加。细胞经过EGF刺激，肌球蛋白Ⅱ-A重链会在酪氨酸激酶2位点（S1943）磷酸化，肌球蛋白Ⅱ-A重链S1943E与S1943D突变体会迁移到创伤位点。相比较而言，细胞表达的S1943A突变体迁移变慢，充分证明肌球蛋白Ⅱ-A重链磷酸化会介导癌细胞的迁移[40]。3.2.2棘阿米巴原虫肌球蛋白Ⅱ重链磷酸化对MgATPase活性的调控2012年Liu等通过研究发现了棘阿米巴原虫肌球蛋白Ⅱ受肌动蛋白激活的MgATPase活性是受肌球蛋白马达区域丝氨酸639磷酸化调控的，至今为止并未发现还有其他的肌球蛋白会受这种方式来调控[41]。先前推测棘阿米巴原虫肌球蛋白Ⅱ有MgATPase活性，这种活性可以通过两条重链C-端非螺旋区域的重复序列中4个Ser残基磷酸化来抑制，研究者利用重组的WT与突变的肌球蛋白重新进行了研究，得到了相反的结论。HMM与亚片段1有受肌动蛋白激活的MgATPase的活性，通过磷酸化作用活性衰减。通过质谱分析，鉴定了重链上的5种Ser可以发生磷酸化，4种Ser存在于非螺旋结构中，Ser639存在于马达区域的环2中。通过将Ser639A突变，仍然检测到肌球蛋白有MgATPase活性，并不会因Ser磷酸化而受到抑制。相反，亚片段1与全长的肌球蛋白的Ser639D突变失活，与Ser磷酸化无关。4小结与展望肌球蛋白是肌原纤维粗丝的组成单位，存在于平滑肌中，在肌肉运动中起重要作用。用蛋白分解酶处理可以将其分割为头部（H-酶解肌球蛋白）和尾部（L-酶解肌球蛋白）。肌球蛋白作为其重要功能如肌肉收缩、迁移、胞质分裂、细胞凋亡等机制中主要的调节结构域，其磷酸化与去磷酸化在功能调控方面起着重要的作用。研究肌球蛋白轻链与重链的磷酸化，为寻求一些肌肉收缩以及其他疾病如慢性阻塞性肺病、充血性心肌衰竭m等方面提供了重要的参考依据。更值得一提的是，近年来随着肿瘤细胞研究越来越热，进而发现了肌球蛋白磷酸化可以介导癌细胞的迁移，还有一些调控因子可以促进肿瘤细胞的入侵，这为以后更好地研究癌细胞的运动提供了佐证。但其调控机制并未见过多的文章对其进行阐述，因此，肿瘤运动与迁移很可能成为未来的一个研究方向。另外最近几年史'多的研究发现，月JU求蛋白不仅可以发生磷酸化，其被病毒侵袭或者在激素水平（如皮质醇）下，肌球蛋白被自身泛素化的报道也屡见不鲜，但其一些作用机制与功能尚不清楚，因此，肌球蛋白泛素化有可能会成为未来继磷酸化之后的又一研究热点。参考文献（References）：[1]ANDRUC110V 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