熊胆粉不同极性部位HPLC 指纹图谱及化学模式识别研究

王晨曦 ，杨 敏，梁红宝 ，姚景春，张贵民 ，冯 帅，李 峰*

1. 山东中医药大学药学院，山东 济南 250355

2. 鲁南制药集团股份有限公司 经方与现代中药融合创新全国重点实验室，山东 临沂 276006

熊胆粉来源于熊科熊属动物黑熊Selenarctos thinbetanusCuvier 或棕熊UrsusarctosLinnaeus 的干燥胆汁[1]。按产地划分可分为东胆（东北）和南胆（云、贵、川），尤以云南的品质最佳[2-4]。

现代药理研究表明，熊胆粉具有镇静、镇痛、抗惊厥、解痉、降血压、调血脂、降血糖、镇咳、祛痰、平喘、利胆、溶石、抗菌、抗炎、抗过敏、解毒、止痛、消肿、明目、去翳、抗疲劳等作用[5]。现代研究发现，熊胆粉化学成分主要含结合型熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、胆酸、去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸，牛磺鹅去氧胆酸及胆固醇类，胆色素类，氨基酸类、蛋白质、肽、脂肪酸、微量元素等[6-9]。其中，牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸是熊胆粉重要的特征成分。到目前为止，大多数学者致力于胆酸成分的药理、药化、药代以及临床研究，并取得了可喜的成果[10-15]。胆汁酸的代表成分熊去氧胆酸已合成并进入国家基本药物。但是对熊胆粉的非胆酸部分的研究比较少。熊胆粉的药理作用绝大多数都是胆汁酸类成分发挥作用，但是熊胆粉的一些作用机制尚不明确，很可能与其中非胆酸成分有很大关系。

因此，本实验尝试对熊胆粉的不同极性部位进行提取分析，建立熊胆粉不同极性部位的HPLC 指纹图谱，研究不同提取溶剂下熊胆粉化学成分的变化情况，以期为熊胆粉及其相关中成药质量标准的完善提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UltiMate3000 型高效液相色谱仪，赛默飞世尔科技有限公司；CoronaVeo 型电喷雾检测器，赛默飞世尔科技有限公司；ME204 型万分之一电子天平，梅特勒托利多科技（中国）有限公司；SB25-12DT型超声波清洗机，宁波新芝生物科技有限公司；SHB-IIIG 型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；RE-2000B 型旋转蒸发器，郑州科泰实验设备有限公司。

1.2 试剂

对照品鹅去氧胆酸（批号110806-202009）、熊去氧胆酸（批号110755-202005）、牛磺熊去氧胆酸对照品（批号110816-202110），质量分数均≥98%，中国食品药品检定研究院；对照品牛磺鹅去氧胆酸，批号16F-FVB-66-0，质量分数≥98%，Panphy 公司；三氟乙酸，色谱纯，批号S6786162816，Merck KGaA公司；乙腈，色谱纯，批号B2122101000，云南新蓝景化学工业有限公司；无水甲醇、无水乙醇、丙酮、三氯甲烷、醋酸乙酯，分析纯，批号分别为B211109、B211123、B211008、B211109、B211012，西陇科学股份有限公司。

1.3 样品

收集不同产地、不同厂家生产的熊胆粉样品共10 批，详细信息见表1。各样品均经山东中医药大学李峰教授鉴定，符合要求。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的配制

精密称取“1.3”项下的样品各0.1 g，置100 mL圆底烧瓶中，分别精密加入醋酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、无水乙醇、乙腈各50 mL，水浴回流2 h，综合回收滤液，蒸干，用甲醇定容至50 mL 量瓶中，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.2 对照品溶液的配制

分别精密称取牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸的对照品适量，置于同一量瓶中，加无水甲醇溶解、定容、混匀，制成上述成分质量浓度分别为0.50、0.51、0.49、0.50 mg/mL 的混合对照品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.5%三氟乙酸溶液，梯度洗脱程序：0～24 min，10%～42%乙腈；24～30 min，42%～73%乙腈；30～40 min，73%～90%乙腈；40～50 min，90%～10%乙腈；50～60 min，10%乙腈；体积流量0.5 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL。按上述色谱条件，分别吸取对照品溶液和供试品溶液，进样测定，记录色谱峰，结果见图1。

图1 混合对照品 (A) 和熊胆粉各极性部位 (S1, B) 的HPLC 图Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A) and different polar parts from Fel Ursi powder (S1, B)

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 分别取“2.1”项下S1 样品的5 种不同溶剂提取所得的供试品溶液各1 份，按“2.3”项下对应色谱条件分别连续进样6 次，记录HPLC 图，计算得醋酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、无水乙醇、乙腈部位色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 依次为1.4%、1.6%，2.3%、2.1%，1.3%、1.5%，2.1%、1.8%，2.0%、1.3%，结果表明仪器的精密度良好。

2.4.2 重复性试验 分别取“2.1”项下S1 样品的5 种不同溶剂提取所得的供试品溶液各6 份，按“2.3”项下对应的色谱条件连续进样6 次进行检测，记录HPLC 图，计算得醋酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、无水乙醇、乙腈部位色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 依次为1.3%、1.6%，1.4%、2.7%，1.8%、1.5%，1.8%、2.3%，2.2%、1.4%，结果表明该试验重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 分别取“2.1”项下S1 样品的5 个极性部位的供试品溶液各1 份，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样分析，记录共有峰的保留时间和峰面积，计算得醋酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、无水乙醇、乙腈部位色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 依次为1.4%、1.5%，2.1%、2.3%，1.3%、1.5%，2.1%、2.4%，2.2%、1.4%，结果表明各极性部位的供试品溶液在24 h 内稳定。

2.5 不同极性部位指纹图谱分析

2.5.1 醋酸乙酯部位指纹图谱 分别取10 批醋酸乙酯部位提取物，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，记录HPLC图。将图谱输入到“中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2004A 版）”中，得到10 批不同产地、不同厂家熊胆粉醋酸乙酯部位指纹图谱叠加图（图2），以S1 的指纹图谱为参照图谱，对S1～S10 的指纹图谱相关参数进行多点校正并自动匹配，设定时间宽度为0.2 min，按平均数法生成对照指纹图谱（R），共标定6 个共有峰，其中1～3、5 号峰分别与牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸对照品的保留时间相一致。计算10 批醋酸乙酯提取物指纹图谱与R 的相似度，结果见表2。可见，S1～S3、S5～S8、S10 的相似度均达到0.95以上；S4 与S9 的相似度达到0.95，但与其他厂家相比略有不同。

图2 不同熊胆粉样品醋酸乙酯部位的HPLC 指纹图谱叠加图及其对照指纹图谱 (R)Fig.2 HPLC fingerprint overlay of ethyl acetate extracts of different Fel Ursi powder samples and its control fingerprint (R)

表2 不同熊胆粉醋酸乙酯部位指纹图谱与R 的相似度Table 2 Similary between fingerprint of ethyl acetate extracts from different Fel Ursi powder samples and its control fingerprint

2.5.2 三氯甲烷部位指纹图谱 分别取10 批三氯甲烷部位提取物，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，记录HPLC 图。将图谱输入到“中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2004A 版）”中，得到10 批不同产地、不同厂家熊胆粉三氯甲烷部位指纹图谱叠加图（图3），以S1的指纹图谱为参照图谱，对S1～S10 的指纹图谱相关参数进行多点校正并自动匹配，设定时间宽度为0.2 min，按平均数法生成对照指纹图谱（R），共标定8 个共有峰，其中3、4、6、7 号峰分别与牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸对照品的保留时间相一致。计算10 批三氯甲烷提取物指纹图谱与R 的相似度，结果见表3。可见，除S8 与S9 略有差别外，S1、S4～S10 的相似度均达到0.9 以上；S2 与S3 的相似度达到0.9 以上，但与其他厂家相比略有不同。

图3 不同熊胆粉样品三氯甲烷部位的HPLC 指纹图谱叠加图及其对照指纹图谱 (R)Fig.3 HPLC fingerprint overlay of chloroform extracts of different Fel Ursi powder samples and its control fingerprint (R)

表3 不同熊胆粉三氯甲烷部位指纹图谱与R 的相似度Table 3 Similary between fingerprint of chloroform extracts from different Fel Ursi powder samples and its control fingerprint

2.5.3 丙酮部位指纹图谱 分别取10 批丙酮部位提取物，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，记录HPLC 图。将图谱输入到“中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2004A版）”中，得到10 批不同产地、不同厂家熊胆粉丙酮部位指纹图谱叠加图（图4），以S1 的指纹图谱为参照图谱，对S1～S10 的指纹图谱相关参数进行多点校正并自动匹配，设定时间宽度为0.2 min，按平均数法生成对照指纹图谱（R），共标定8 个共有峰，其中3、4、6、7 号峰分别与牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸的对照品的保留时间相一致。计算10 批丙酮提取物指纹图谱与R 的相似度，结果见表4。可见，S1～S4、S6、S7、S10 的相似度均达到0.9 以上；S8 除与S3、S4、S9 略有差别外，与其他厂家熊胆粉的相似度也均达到0.9 以上；S5 与S9 和其他厂家相比差别较大。

图4 不同熊胆粉样品丙酮部位的HPLC 指纹图谱叠加图及其对照指纹图谱 (R)Fig.4 HPLC fingerprint overlayof acetone extracts of different Fel Ursi powder samples and its control fingerprint (R)

表4 不同熊胆粉丙酮部位指纹图谱与R 的相似度Table 4 Similary between fingerprint of acetone extracts from different Fel Ursi powder samples and its control fingerprint

2.5.4 乙腈部位指纹图谱 分别取10 批乙腈部位提取物，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，记录HPLC 图。将图谱输入到“中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2004A版）”中，得到10 批不同产地、不同厂家熊胆粉乙腈部位指纹图谱叠加图（图5），以S1 的指纹图谱为参照图谱，对S1～S10 的指纹图谱相关参数进行多点校正并自动匹配，设定时间宽度为0.2 min，按平均数法生成对照指纹图谱（R），共标定10 个共有峰，其中4、6、8、9 号峰分别与牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸对照品的保留时间相一致。计算10 批乙腈提取物指纹图谱与R 的相似度，结果见表5。可见，除S4 与S5 略有差别外，S1～S8、S10 的相似度均达到0.9 以上；S9 除与S5、S7 略有差别外，与其他厂家熊胆粉的相似度均达到0.9 以上。

图5 不同熊胆粉样品乙腈部位的HPLC 指纹图谱叠加图及其对照指纹图谱 (R)Fig.5 HPLC fingerprint overlay of acetonitrile extracts of different Fel Ursi powder samples and its control fingerprint (R)

表5 不同熊胆粉乙腈部位指纹图谱与共有模式相似度Table 5 Similary between fingerprint of acetonitrile extracts from different Fel Ursi powder samples and common mode

2.5.5 乙醇部位指纹图谱 分别取10 批乙醇部位提取物，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，记录HPLC 图。将图谱输入到“中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2004A 版）”中，得到10 批不同产地、不同厂家熊胆粉乙醇部位指纹图谱叠加图（图6），以S1 的指纹图谱为参照图谱，对S1～S10 的指纹图谱相关参数进行多点校正并自动匹配，设定时间宽度为0.2 min，按平均数法生成对照指纹图谱（R），共标定16 个共有峰，其中6、9、13、15 号峰分别与牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸对照品的保留时间相一致。计算10 批乙醇提取物指纹图谱与R的相似度，结果见表6。可见，S1～S10 的相似度均达到0.95 以上。

图6 不同熊胆粉样品乙醇部位的HPLC 指纹图谱叠加图及其对照指纹图谱 (R)Fig.6 HPLC fingerprint overlay of ethyl alcohol extracts of different Fel Ursi powder samples and its control fingerprint (R)

表6 不同熊胆粉乙醇部位指纹图谱与共有模式相似度Table 6 Similary between fingerprint of ethyl alcohol extracts from different Fel Ursi powder samples and common mode

2.5.6 5 种不同溶剂提取指纹图谱 选取样品S1、S7、S10 的醋酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、乙腈以及乙醇部位提取物的HPLC 图，从5 种不同提取部位中共得到15 个指纹色谱图（z1～z3 为醋酸乙酯部位，z4～z6 为三氯甲烷部位，z7～z9 为丙酮部位，z10～z12 为乙腈部位，z13～z15 为乙醇部位），将图谱输入到“中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2004A 版）”中，得到5 种不同溶剂提取部位指纹图谱叠加图（图7），以z14 的指纹图谱为参照图谱，对z1～z15 的指纹图谱相关参数进行多点校正并自动匹配，设定时间宽度为0.2 min，按平均数法生成对照图谱，共标定8 个共有峰。其中3～5、7 号分别与牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸对照品的保留时间相一致。

图7 不同熊胆粉样品不同极性提取部位的HPLC 指纹图谱及其对照指纹图谱 (R)Fig.7 HPLC fingerprint of different extraction site of different Fel Ursi powder samples and its control fingerprint (R)

将z1～z15 各色谱峰的峰面积数据导入SPSS 21.0 统计软件，进行显著性差异分析，发现在保留时间为4.696（共有峰1）、4.834（共有峰2）、25.412（共有峰3）、26.89、29.266（共有峰4）、29.695 min时，不同极性溶剂之间P≤0.05，说明不同极性部位间化学成分含量差异明显。

2.6 化学模式识别

2.6.1 聚类分析 采用SPSS 21.0 软件将10 批熊胆粉样品醋酸乙酯部位6 个共有峰，三氯甲烷部位8个共有峰，丙酮部位8 个共有峰，乙腈部位10 个共有峰，乙醇部位16 个共有峰的峰面积进行标准化处理，分别得到10×6、10×8、10×8、10×10、10×16 阶的原始数据矩阵；综合醋酸乙酯部位、三氯甲烷部位、丙酮部位、乙腈部位、乙醇部位共有峰峰面积的标准化数据，得到10×48 的原始数据矩阵，对标准化后的数据，采用组间连接法，以平方欧氏距离为分类依据，对样品进行系统聚类分析，综合聚类结果见图8。当平方欧氏距离为5 时，10 批熊胆粉样品被分为5 类，S1、S2、S7、S10 聚为一类，S6、S8、S3 聚为一类，S4、S5、S9 分别被单独聚为一类；当平方欧氏距离为10 时，10 批熊胆粉样品被分为3 类，S1～S3、S6～S8、S10 聚为一类，S4、S9 聚为一类，S5 单独聚为一类；当平方欧氏距离为15 时，10 批熊胆粉样品被分为2 类，S1～S3、S5～S8、S10 聚为一类，S4、S9 聚为一类。由于S1～S3 产地是四川，S4～S7 产地是云南，S8、S9 产地是吉林，S10 产地是福建，通过聚类结果可知，相同产地的熊胆粉，受不同厂家加工方法不同的影响，也存在一定的质量差异。

图8 聚类分析树状图Fig.8 Dendrogram of cluster analysis

2.6.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 采用SIMCA 14.1 软件分别对10 批熊胆粉样品醋酸乙酯部位6 个共有峰，三氯甲烷部位8 个共有峰，丙酮部位8 个共有峰，乙腈部位10 个共有峰，乙醇部位16 个共有峰进行PCA，计算得分图，具体见图9。S1～S3 产地是四川，在得分图中为蓝色点；S4～S7 产地是云南，在得分图中是红色点；S8、S9 产地是吉林，在得分图中是紫色点；S10 产地是福建，在得分图中是绿色点。

图9 熊胆粉不同极性部位PCA 得分图Fig.9 PCA score plot for different polar parts of Fel Ursi powder

从图9 可知，醋酸乙酯部位S1～S3、S7、S8、S10 质量相似，S5、S6 质量相似，S4、S9 质量相似；三氯甲烷部位S4～S6 质量相似，S2、S3 质量相似，S7、S8、S10 质量相似，S1、S9 质量相似；丙酮部位S1、S2、S4、S8、S10 质量相似，S3、S6、S7 质量相似，S5、S9 质量相似，分别单独一类；乙腈部位S1、S2、S6、S7、S10 质量相似，S3、S8、S5 质量相似，S4、S9 质量相似，分别单独一类；乙醇部位S1、S2、S6、S7 质量相似，S5、S8 质量相似，S4、S10 质量相似，S3、S9 质量相似，分别单独一类。根据PCA 结果，可知相同产地的熊胆粉，受不同厂家加工方法不同的影响，也存在一定的质量差异。此结果与聚类分析结果一致。

2.6.3 正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA） 为进一步寻找对熊胆粉质量产生影响贡献较大的成分，采用SIMCA 14.1 软件分别对5 个极性部位的指纹图谱进行OPLS-DA，得到变量重要性投影（variable important in project，VIP）值，结果见图10。其中，醋酸乙酯模型自变量拟合指数RX2＝0.967，因变量拟合指数RY2＝0.957，模型预测指数Q2＝0.914；三氯甲烷模型RX2＝0.981，RY2＝0.791，Q2＝0.664；丙酮模型RX2＝0.965，RY2＝0.825，Q2＝0.739；乙腈模型RX2＝0.952，RY2＝0.824，Q2＝0.717；乙醇模型RX2＝0.945，RY2＝0.925，Q2＝0.917。

图10 熊胆粉不同极性部位VIP 图 (OPLS-DA)Fig.10 VIP value of different polar parts of Fel Ursi powder (OPLS-DA)

5 个极性部位的R2和Q2均超过0.5，表示模型拟合结果稳定可靠。如图10 所示，横坐标为共有峰编号，纵坐标为VIP 值，VIP 值越高，对模型贡献率越高，进一步筛选VIP＞1 的共有峰：醋酸乙酯部位为1（牛磺熊去氧胆酸）、2（牛磺鹅去氧胆酸）、5（鹅去氧胆酸）号峰；三氯甲烷部位为1、3（牛磺熊去氧胆酸）、4（牛磺鹅去氧胆酸）号峰；丙酮部位为1、3（牛磺熊去氧胆酸）、4（牛磺鹅去氧胆酸）号峰；乙腈部位为1、2、4（牛磺熊去氧胆酸）、6（牛磺鹅去氧胆酸）号峰；乙醇部位为6（牛磺熊去氧胆酸）、10、13（熊去氧胆酸）、15（鹅去氧胆酸）号峰。结果表明，上述色谱峰所代表的化学成分分别是熊胆粉各极性部位质量差异的标志性成分。其中，牛磺熊去氧胆酸是5 种极性部位共同的质量差异标志性成分。经过200 次置换检验，5 种极性溶剂模型Q2回归线与纵轴的相交点均小于0，说明模型不存在过拟合，模型验证有效，认为该结果可用于熊胆粉质量差异的标志性成分的筛选。

4 讨论

中药是由多种成分组成的复合体，HPLC 指纹图谱的研究角度很多，是考察单一溶剂处理的提取物的指纹图谱，掩盖了不同极性部位指纹图谱的差别[16-19]，本研究建立熊胆粉5 个极性部位HPLC 指纹图谱，利用多种化学模式识别方法综合分析不同极性部位的指纹图谱信息[20-22]，更加客观地反映熊胆粉内在质量，深入研究熊胆粉中化学成分分布情况，为其临床用药的合理性及进一步的药性研究提供研究依据。

实验最初选取了石油醚、醋酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、无水乙醇、乙腈、无水甲醇、纯化水、正丁醇9 种溶剂，以绿野厂家的熊胆粉为样本进行实验。通过HPLC 法发现石油醚提取出来的化学成分极少，且无水乙醇、无水甲醇、纯化水、正丁醇4 种溶剂提取出来的化学成分相似，故只采用醋酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、无水乙醇、乙腈作为实验试剂。实验最初选用超声法进行熊胆粉有效成分的提取，对比回流提取，发现超声提取的醋酸乙酯部位、丙酮部位、乙腈部位熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸含量明显低于回流提取，故实验最终选用回流法进行熊胆粉有效成分的提取。

通过对不同批次的熊胆粉不同极性溶剂提取物中的成分进行了指纹图谱方法考察，比较5 个指纹图谱共有模式可清晰地观察到不同极性部位的化学成分种类不同，且每个极性部位间化学成分含量差异明显。10 批熊胆粉醋酸乙酯共有模式共标记6 个共有峰，三氯甲烷共有模式共标记8 个共有峰，丙酮共有模式共标记8 个共有峰，乙腈共有模式共标记10 个共有峰，乙醇共有模式共标记16 个共有峰，5 个极性部位均指认了4 个指纹峰（牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸）；采用5 种不同极性溶剂对熊胆粉进行提取，不同溶剂提取所得的成分种类有所不同，分析不同极性部位的共有模式可知，3～5、7、8 号峰在5 种溶剂中均被提取出，而1、2 号峰在醋酸乙酯部位未被提取出，其峰主要来源于三氯甲烷、丙酮、乙腈、乙醇部位；6 号峰主要来源于醋酸乙酯、乙醇部位。

采用5 种不同极性溶剂对熊胆粉进行提取，不同溶剂提取所得的成分含量差异明显，按成分含量从高到低排序，醋酸乙酯部位依次为鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸，且熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸的成分含量显著大于牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸；三氯甲烷部位依次为牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸，且牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸的成分含量显著大于熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸；丙酮部位依次为牛磺熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸，且牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、鹅去氧胆酸的成分含量显著大于熊去氧胆酸；乙腈部位依次为牛磺鹅去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸，且牛磺鹅去氧胆酸的成分含量显著大于牛磺熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸，熊去氧胆酸的含量最少；乙醇部位为牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸，且牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸的成分含量显著大于熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸。

由此可见，在不同极性溶剂下，熊胆粉中所提取出的主要成分种类和含量也有所不同。在此条件下，可通过谱效关系的研究方法，将熊胆粉不同极性溶剂的指纹图谱与药理药效结果进行灰色关联分析，探究熊胆粉不同功效的质量标志物（quality marker，Q-Marker），从而为熊胆粉谱效关系的研究提供了实验基础。

熊胆粉按产地划分可分为东胆（东北）和南胆（云、贵、川），尤以云南产的品质最佳。但是，对熊胆粉进行聚类分析和PCA，发现即使是相同产地的熊胆粉，也存在一定程度上的质量差异，不同产地的熊胆粉也会有质量相近的情况。主要原因可能是不同厂家对熊胆汁引流加工的工艺不同[23-24]，从而产生质量上的差异。现代生产的熊胆粉大多来源于养殖熊，因此，按产地条件来挑选野生熊胆粉的方法已不再科学严谨。通过比较5 种不同溶剂提取的熊胆粉指纹图谱，发现不同极性部位的指纹图谱差异较大，归因于各厂家对熊胆汁引流加工的工艺不同。

对熊胆粉进行OPLS-DA，发现熊胆粉质量差异的主要标志性成分是牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、未知成分乙醇部位10 号峰、乙腈部位1、2 号峰。但哪些成分是熊胆粉主要功效的Q-Marker，仍有待进一步研究。本实验主要考察了熊胆粉不同极性部位指纹图谱的差别，并确认了各化学成分峰的归属，为熊胆粉谱效关系的研究提供一定依据。

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