萍乡地区1 241 例孕妇脊髓性肌萎缩症携带者筛查及产前诊断分析

甘建玲 朱艺艺 刘旺 丁芳骐

脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）是由运动神经元存活基因1（motor neuron survival gene 1，SMN1）缺陷导致的一种罕见神经肌肉疾病，主要特征是脊髓前角运动神经元退化，患者主要症状为进行性肌无力和肌萎缩，主要累及躯干和近端肢体（大臂、上臂），并由此产生全身多系统功能受损。SMA 为常染色体隐性遗传病，发病率为1/10 000～1/6 000［1］，携带者频率为1/50～1/40，在儿童致死性常染色体遗传疾病中位于第二位［2］，具有发病年龄早，进展快，死亡率高的特点。

指南表示88%～95%的中国SMA 患者是由携带SMN1基因第7 外显子纯合缺失导致，其中大部分同时合并第8 外显子的缺失，极少部分为SMN1第7外显子杂合缺失合并SMN1基因杂合性点突变或其他变异导致［3］，因此在SMA 携带者筛查中首选检测SMN1基因E7 缺失情况，但也有文献报道少量SMA 患者仅存在SMN1基因E8 纯合缺失［4-6］，为此本研究对SMN1基因E7、E8 缺失情况进行检测，完善检测机制。SMA 患儿的出生给家庭带来巨大的经济和精神压力，但SMA 致病基因明确，携带率高，可以通过产前筛查的方式来预防SMA 患儿的出生，减轻家庭及社会负担，因此，本研究对萍乡地区1 241 例孕妇进行SMN1基因筛查，为遗传咨询和产前诊断提供参考证据，并对高风险胎儿进行介入性产前基因诊断，有效避免SMA 患儿的出生。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2022 年3 月至2023 年2 月在萍乡市妇幼保健院医学优生门诊就诊的孕妇为研究对象，进行SMA 携带者筛查，共1 241 例。纳入标准：年龄16～47 岁，孕周＜22 周，均无SMA 表型生育史和家族史。排除标准：有过SMA 生育史及家族史的孕妇。本研究经受检者和医院伦理委员会同意和批准（L20220507）。

1.2 方法

1.2.1 携带者筛查流程

依据产前检查孕妇意愿对孕妇进行SMN1基因E7、E8 外显子进行检测，若为携带者，则对其配偶进行SMN1基因检测，若双方都为携带者，胎儿依据夫妻双方意愿进行胎儿SMA 产前诊断，筛查仅限于SMN1基因E7、E8 外显子的缺失情况。

1.2.2 样本采集

对接受携带者筛查的孕妇采集外周静脉血2～3 mL，收集于EDTA 抗凝管；对进行产前诊断的孕妇抽取羊水10 mL 同时采集母体外周血。

1.2.3 DNA 提取

外周血采用西安天隆科技有限公司的全血提取试剂（SMA⁃磁珠法）及GeneRotex 96 全自动核酸提取仪提取DNA，严格按照说明书进行。

1.2.4 基因检测方法

1.2.4.1 孕妇携带者筛查 采用PCR⁃熔解法对SMN1基因E7、E8 外显子的拷贝数进行定量检测，该方法基于实时荧光定量PCR，结合了竞争性PCR、饱和荧光染料、熔解曲线分析技术，具有高特异性，高准确性的特点［7］。实验过程严格按照西安天隆科技有限公司人运动神经元存活基因1（SMN1）检测试剂盒说明书进行。

1.2.4.2 高风险胎儿产前诊断 在知情同意选择和遗传咨询的基础上，行羊水穿刺，进行SMN1产前检测。产前诊断羊水与母体外周血样本进行QF⁃PCR 分析短串联重复（short tandem repeat，STR）位点比对，排除母源污染之后，用多重链接探针扩增技术（multiplex ligation⁃dependent probe am⁃plification，MLPA）方法检测SMN1基因，由湖南家辉遗传专科医院完成，实验方法参见文献［8］。

1.3 统计学方法

携带率采用SMN1基因E7 杂合缺失突变数/筛查总数得出，STR 结果使用GeneMapper5.0 软件进行分析，MLPA 结果采用Coffalyser 软件进行分析。

2 结果

2.1 筛查结果

在1 241 例孕妇中，SMN1基因E7 正常型1 225 例，其中E7、E8 正常型1 218 例，单纯E8杂合缺失7 例，检出SMN1基因E7 杂合缺失突变16 例，其中E7、E8 同时杂合缺失15 例，单纯E7 杂合缺失1 例，携带率为1.29%（16/1241）。见表1。

2.2 产前诊断结果

对上述16 名携带者孕妇配偶进行告知并进行基因检测，同意做基因检测的有14 名，发现配偶同为SMN1基因E7 杂合缺失突变者1 例，QF⁃PCR 分析STR 位点比对结果显示所检测的样本无母源细胞污染。见图1。最终确认该胎儿SMN1基因E7、E8 纯合缺失，为SMA 患儿。见图2。实验时对夫妻双方基因复检。见图3、4。

图1 胎儿羊水与母体外周血样本STR 比对Figure 1 Comparison of STR between fetal amniotic fluid and maternal peripheral blood samples

图2 胎儿SMN1 基因E7、E8 拷贝数Figure 2 Copy numbers of E7 and E8 of the SMN1 gene in the fetal

图3 母亲SMN1 基因E7、E8 拷贝数Figure 3 Copy numbers of E7 and E8 of the SMN1 gene in the mother

图4 父亲SMN1 基因E7、E8 拷贝数Figure 4 Copy numbers of E7 and E8 of the SMN1 gene in the father

3 讨论

SMA 是一种导致婴幼儿死亡的最常见常染色隐性遗传疾病之一，人群携带率高，致病基因明确，通过产前诊断的方式可以有效避免SMA 患儿的出生，因此具有进行携带者筛查的可行性。目前临床上有效治疗该病的药物有限，在中国上市的药物仅有诺西那生钠注射液和利司扑兰，价格昂贵且需要终身治疗，并且对于SMA 患儿来说，还需要多学科的管理以提高生活质量，减轻疾病带来的负面影响［9］，因此对孕妇进行SMN1基因突变筛查和对高风险胎儿进行产前诊断显得尤其重要。

研究表明［10］，基于高分辨率熔解曲线实时PCR 的方法是一种灵敏、高通量、低成本、低人工的方法，适用于大规模的SMA 携带者筛查。但要注意的是该方法学存在一定的技术局限性，基于目前的技术，只能检查较常见的“1+0”型携带者，对于少见的“2+0”“1+1d”和“2+1d”型携带者无法检测出，存在一定的残余风险，因此在筛查咨询及产前诊断要全面告知残余风险的存在。

本研究采用PCR⁃溶解曲线法对萍乡地区1 241例孕妇进行SMN1基因筛查，共检出SMN1基因E7杂合缺失者16 例，显示携带率为1.29%。由于SMA为常染色隐性遗传性疾病，同为携带者夫妇生育SMA 患儿的概率为25%，因此对16 例携带者的配偶进行基因检测和遗传咨询，丈夫同为携带者1 例，对高风险胎儿行产前诊断，排除胎儿标本中的母体细胞污染是保证产前诊断结果准确性的重要保证［11］，因此检测时首先对母体外周血样本和羊水样本进行QF⁃PCR 分析STR 位点比对，确定没有母源细胞污染后，再用MLPA 的方法对SMN1E7、E8 进行拷贝数定量，最终发现该胎儿是SMN1基因E7 纯合缺失者，诊断为SMA 患病胎儿，经遗传咨询建议终止妊娠，该夫妇选择引产，避免了SMA患儿的出生。

基于目前的指南及专家共识，临床诊断以SMN1基因E7 拷贝数为依据，其中SMN1基因7 号外显子与8 号外显子在绝大多数人群中基因拷贝数一致，但也有少部分群体二者拷贝数存在不一致的情况，所以，SMN1基因E8 的检测可有效作为E7检测结果的内参，提升检测结果的准确性，若出现不一致的情况，考虑做复检进一步确认结果准确性。另外，有少量SMA 患者仅存在第8 外显子纯合缺失的报道，但样本数量太少，目前的研究还未能完全佐证是8 外显子缺失致病还是存在其他变异情况，所以若出现E7 非0，E8 为0 的情况，要考虑E7 是否存在微小变异，以进一步降低患儿发生概率。因此SMN1基因E8 检测有其相对意义，本研究检测了1 241 例孕妇SMN1基因E7、E8 拷贝数，以确保结果准确性及指导是否要做进一步检测。

综上，本研究通过对1 241 例孕妇样本的筛查，初步确定萍乡地区SMA 突变携带情况，为遗传咨询和产前诊断提供重要的临床依据，通过筛查筛选出同为携带者的夫妇，对高风险胎儿进行产前诊断确定胎儿基因型，做到早诊断、早干预。对脊髓性肌萎缩症进行携带者筛查有效避免了SMA 患儿的出生，对降低家庭和社会负担有重要意义。同时，我们也要思考，遗传性疾病防控的完善性。在二级预防来说，基于目前的方法学确实有漏检的可能，即使是当前公认检测技术金标准多重连接探针扩增技术（MLPA）也仅能给出SMN1与SMN2 的拷贝数信息，无法对SMN 基因的单倍型提供更多有价值的信息，因此，我们考虑补充SMA 三级预防，即新生儿筛查，作为对二级预防的补充。目前《脊髓性肌萎缩症中国三级预防指南》［12］已出台，对于SMA 新生儿筛查流程与相关问题有了相应规范与指导，因此在二级预防的基础上去进行三级预防有一定可行性，但也要根据二级预防的覆盖率去全面考虑这个问题。目前，在广东地区，江苏地区，云南地区等也作了区域孕妇携带者筛查的研究，对地区的出生缺陷防控有重要的临床意义。