NIPT⁃plus 筛查染色体MMS 的应用评价

陈英 童晓青 余学高 黄浩 黄彬 陈培松★

无创产前基因检测（noninvasive prenatal test⁃ing，NIPT）是目前用于胎儿非整倍体筛查的重要手段，对羊水穿刺及胎儿染色体核型分析具有重要的指导作用［1⁃2］。其还被扩展到相关染色体片段位置的微缺失/重复综合征（micro deletion/micro duplication syndrome，MMS）［3］116 种等的筛查，即扩展性无创产前基因检测（expanded non⁃invasive prenatal testing，NIPT⁃plus）。有研究显示NIPT 用于筛查唐氏综合征［4］，但对部分染色体微重复/微缺失的诊断价值低，常出现漏诊，而NIPT⁃plus 通过加深测序深度、增大检测范围，在胎儿染色体非整倍体筛查中具有较高的价值［5］。本研究通过对中山大学附属第一医院就诊的单胎妊娠孕妇3 860 例接受无创产前检测的检查结果进行分析，探讨NIPT⁃plus 技术筛查染色体微缺失/重复综合 征（micro deletion/micro duplication syndrome，MMS）早期诊断和预防中的应用价值，为临床医生和孕妇选择NIPT⁃plus 提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018 年1 月至2020 年12 月在中山大学附属第一医院接受NIPT 筛查的孕妇3 860 例及2022 年CNV 质评样本10 例，其中行侵入性产前诊断的孕妇有24 例。在生育前均进行了B 超检测，7 例显示胎儿部分结构异常；20 例进行了NT 值检测，1 例NT 值为2.7 mm，为临界指标，另19 例NT值均小于2.5 mm。孕妇年龄为（24～44）岁，平均年龄为33.58 岁，平均孕周为（15+0.875）周。研究对象排除一年内接受过异体输血、移植手术、干细胞治疗、免疫治疗。对比分析两组对象的NIPT 及NIPT⁃plus 的胎儿DNA 浓度、测序数据量、产前诊断结果和妊娠结局等。本研究已通过院医学伦理委员会的审查，研究对象均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂

DA8600 二代基因测序仪（广州达安基因股份有限公司）、油包水PCR 仪（Ion One Touch2）、模板富集仪（Ion One TouchES）、DNA 提取试剂盒（磁珠法，广州市达瑞生物技术股份有限公司）、测序反应通用试剂盒（半导体法，广州市达瑞生物技术股份有限公司）、微阵列分析系统（Affymetrix GeneChip Scanner 3000Dxv.2），包括Thermo Fisher Scientific SNP array 平台，芯片类型为CytoScan HD或CytoScan 750K 芯片，数据分析软件为Thermo Fisher Scientific ChAS 软件，人类参考基因组版本为（GRCh37/hg19）。

1.3 方法

1.3.1 标本处理

①EDTA 抗凝管收集孕妇外周血6 mL，先4℃1 600 g 离心力低速离心10 min，再4℃16 000 g 离心力高速离心10 min，取血浆800 μL于-80℃冰箱保存。

②DNA提取，得浓度＞0.05 ng/μL 的DNA溶液。

③文库构建：1）末端修复；2）末端加接头；3）PCR扩增DNA片段。NIPT文库浓度≥0.2 ng/μL，NIPT⁃plus 用磁珠富集＜160 bp 的DNA 片段，文库浓度≥1.0 ng/μL，否则重新提取DNA 和建库。

1.3.2 NIPT 与NIPT⁃plus 检测

①Pooling 文库；②模板制备；③模板富集；④采用ION PROTON DA8600 二代测序仪进行测序。运用Tmap 比对算法，将测序所得的序列与人类基因组参考序列图谱进行比对。使用广州达瑞生物公司的分析系统，采用生物信息学对数据进行分析，计算Z 值，利用Z 值来评估胎儿患病风险（cut off：|Z|=3）。Z＞3 代表该染色体可能是三倍体，Z＜⁃3 代表该染色体可能是单倍体或存在缺失。

1.3.3 侵入性产前诊断

根据NIPT 检测结果选择进行侵入性产前诊断，抽取羊水10 mL。CMA 分析：提取DNA，应用芯片对全基因组已知的拷贝数变异进行分析，对检测结果进行公共数据库查询，包括DECIPHER数据库（https：//decipher.sanger.ac.uk/index）、DGV（https//dgv.tcag.ca/dgv/app/home）、ClinGen（https：//dosage.clinicalgen/ome.org）、CNV Pathogenicity Calculator（http：// cnvcalc.clinicalgenome.org/ cnv⁃calc）、OMIM（https：//omim.org）等。

2 结果

2.1 测序数据量

24 例孕妇及10 例质评样本NIPT 和NIPT⁃plus检测cffDNA 浓度均达到分析要求（cffDNA≥5%）。见图1、3。孕妇血浆NIPT 和NIPT⁃plus 检测总测序数据量和有效测序数据量均值分别为6.74 Mb，4.90 Mb；9.37 Mb，5.86 Mb。见 图2。10 例质评样本NIPT 和NIPT⁃plus 检测总测序数据量和有效测序数据量均值分别为6.61 Mb，4.63 Mb；10.47 Mb，6.21 Mb。见图4。

图1 24 例样本cffDNA 浓度Figure 1 cffDNA concentration of 24 samples

图2 24 例样本总测序数据量和有效测序数据量Figure 2 Total Sequencing Data Amount and Effective Sequencing Data Amount of 24 Samples

图3 10 例质评样本cffDNA 浓度Figure 3 cffDNA concentration of 10 quality assessment samples

图4 10 例质评样本总测序数据量和有效测序数据量Figure 4 Total Sequencing Data and Effective Sequencing Data of 10 Quality Evaluation Samples

2.2 染色体异常胎儿生育情况及相关检测结果

24 例孕妇均接受羊水穿刺，22 例诊断为MMS，另有2 例重复程度接近三体。见表1。通过本院病历系统查知：2 例提示三体高风险孕妇均放弃胎儿；1 例生育情况不明；剩下21 例均产下新生儿。其中9 例有不同程度缺陷，如先天性唇裂、β 地中海贫血、α 地中海贫血等，其余12 例均体健。NIPT⁃plus 提示1 例18⁃三体，1 例21⁃三体，2 例MMS；NIPT 提示1 例18⁃三体，1 例21⁃三体。10 例质评样本NIPT⁃plus 提示9 例MMS。见表2。主要有del22、dup20、del5、del1。见图5～9。同时第9 号样本存在MMS 的情况下亦提示SCAs；NIPT 仅提示第9 号样本为SCAs。24 例临床样本和10 例质评样本NIPT⁃plus 筛查MMS，结果提示其敏感度可达35.5%。见表3。

表1 24 例临床样本相关结果Table 1 Relevant results of 24 clinical samples

表2 10 例质量评价样本相关结果Table 2 relevant results of 10 quality evaluation samples

表3 24 例临床样本和10 例质评样本NIPT⁃plus 结果及产前诊断Table 3 NIPT plus results and prenatal diagnosis of 24 clinical samples and 10 quality evaluation samples

图5 22q11 缺失综合征Figure 5 22q11 deletion syndrome

图6 20p 三体综合征Figure 6 Trisomy 20p Syndrome

图7 22q11.2 缺失综合征Figure 7 22q11.2 deletion syndrome

图8 猫叫综合征Figure 8 Cattle howling syndrome

图9 1p36 缺失综合征Figure 9 1p36 deletion syndrome

3 讨论

MMS 是指染色体上缺失或增加片段较小，一般小于10 Mb，但可引起一系列复杂多样且严重的临床症状［6］，包括三百多种已知疾病，常表现为智力障碍、发育迟缓、内脏器官畸形、面部特征、精神行为改变等。据统计MMS 占新生儿先天畸形2%左右，是除染色体非整倍体异常外的另一大类新生儿出生缺陷，此外大约12%的原因不明的智力低下，多种畸形和发育迟缓的病例是由MMS 引起的［7］。孕早期联合试验（血清学和超声筛查）对染色体非整倍体检测率虽较高，但在妊娠早期不易检测到染色体MMS［8］。介入性有创检测可检出整个染色体异常或大范围染色体变异，诊断准确率高，然而羊膜穿刺术有严格的适应症和禁忌症，有前置胎盘、先兆流产等孕妇不适合羊水产前诊断［9⁃10］。而NIPT⁃plus 灵敏度高，不仅对染色体非整倍体有良好的筛查价值［8，11］，还可增加对MMS 的检出率，相较于超声可检测出MMS，对比有创诊断降低了流产等风险，与NIPT 比较能够更有效精准地筛查胎儿染色体拷贝数异常。

本研究结果显示，：NIPT⁃plus 的cffDNA 浓度明显高于NIPT，其测序数据量接近NIPT 的1.2～1.6 倍。24 例临床样本NIPT⁃plus 的SEN可达16.67%（4/24），NIPT 仅8.33%（2/24）；10 例质评样本其SEN 高为100%，NIPT 仅10%。总体而言NIPT⁃plus 对MMS 的SEN 可达35.5%。根据产前诊断及室间质评结果可见NIPT⁃plus 能有效提高染色体病的检出率，尤其是对MMS 的检出率。据多项研究数据［12］，每项NIPT⁃plus 研究报告的MMS 检测阳性预测值差异显著，从低（11%～18%）到中等（29%～77%）不等。在Wang 等［13］2018 年1月至2020 年4 月对39 002 名孕妇进行NIPT 结果显示，对MMS 的PPVs 为49.02%。而在本研究中，NIPT⁃plus 和NIPT 的总体PPVs 均为100%，该结果与以上研究资料不符是因本次研究所取的对象多为CMA 阳性标本所致。

NIPT 可用于针对研究明确的MMS 进行检测［14］，在相关研究中，对于致病性MMS 的检测，NIPT⁃plus 筛查灵敏度可达98.25%。在本研究中，10 例质评样本NIPT⁃plus 能够提示全部MMS 和SCAs，表明NIPT⁃plus 在性能上值得推广借鉴。虽然在本研究中对于已明确意义的CNVs，NIPT⁃plus 的SEN 较高，但在临床样本中SEN 仍低于现有的研究数据，假阴性较高，除了因本研究样本量少有关外，结合现有资料，本研究中NIPT⁃plus 假阴性的原因可能还有胎儿低比例嵌合未被检出、限制性胎盘嵌合体、及本身技术缺陷等。因此正确看待NIPT⁃plus的适用范围和检测结果、提高NIPT⁃plus 技术至关重要。

综上所述，建议孕妇和临床医生有必要选择NIPT⁃plus，以提高常见染色体三体、SCAs、和MMS 检出率。对于染色体病和其他先天性疾病采用多种产前筛查技术相互配合，取长补短，提高疾病检出率，降低出生缺陷发生率。