染色体核型分析联合CNV-Seq检测在高龄孕妇产前诊断中的应用

马海霞,冯丽云,郭苑青,何丽梅△

上海市长宁区妇幼保健院:1.检验科;2.产筛中心,上海 200051

高龄孕妇是指年龄≥35岁的孕妇。孕妇高龄是胎儿染色体异常的重要因素之一[1]。胎儿染色体异常可引起胎儿组织、器官发育异常等。高龄可造成卵子老化、卵巢功能衰退,从而增加受精卵或生殖细胞减数分裂时染色体不分离的风险[2]。一直以来传统的染色体核型分析技术作为实验室产前诊断的金标准,除了可以检测出染色体数目异常外,还可以检测出大片段的结构异常,但同时也存在耗时、耗力、培养周期长、只能检测5 Mb以上的异常等缺点[3]。近年来,随着二代测序技术的快速发展,低深度全基因组拷贝数变异测序(CNV-Seq)被广泛应用于产前诊断领域,与传统的染色体核型分析技术相比,其有检测范围广、精准、通量高、成本低、操作简便等诸多优势,为染色体畸变及染色体拷贝数变异(CNV)检测提供了新的手段,但只能检测总体染色体数目的改变而不能检测结构的重排。本研究回顾性分析2020年1月至2022年12月本院723例高龄孕妇的羊水细胞染色体核型及CNV-Seq检测结果,探讨二者在高龄孕妇产前诊断中联合应用的意义,以期为临床医生提供参考依据,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2020年1月至2022年12月本院产前诊断中心就诊的723例高龄孕妇为研究对象。纳入标准:(1) 孕妇年龄≥35岁;(2)均为单胎妊娠。排除标准:(1) 既往有不良孕产史;(2) 孕期接触过有毒、有害物质。所有孕妇孕周18～26周,年龄35～44岁,孕妇均签署知情同意书后进行羊膜腔穿刺术,同时进行染色体核型分析和CNV-Seq检测。

1.2方法

1.2.1羊膜腔穿刺 B超定位下严格无菌操作,经腹壁进行羊膜腔穿刺术,每例孕妇均抽取3试管羊水,每管10 mL,共30 mL,其中2管进行细胞培养染色体核型分析,1管进行CNV-Seq检测。

1.2.2染色体G显带染色体核型分析 2管羊水分装于两支15 mL无菌离心管中,1 500 r/min离心10 min,留取0.5～1.5 mL沉淀,加5 mL Gibco培养基混匀后,进行细胞接种,培养7 d后观察细胞是否贴壁,如贴壁进行换液,当贴壁细胞生长旺盛可见5～8个大克隆时,加入10 μg/mL秋水仙素60 μL,作用3.0～3.5 h后收获细胞制片并进行G显带,按照人类细胞遗传学国际命名体制 (ISCN2016) 标准进行分析诊断,嵌合体通常计数100个细胞,必要时做C带分析。

1.2.3CNV-Seq检测 抽取10 mL羊水,送至华大基因公司完成分析。实际检测中主要针对染色体非整倍体变异和100 kb以上的CNV,方法如下:按照试剂盒说明书从羊水细胞中提取分离并纯化基因组DNA,并以此作为起始模板,构建DNA文库,进行测序。使用比对软件将读序信息与人类参考基因组(GRCh37,UCSC release hg19) 进行比对分析,并通过检索ISCA、Decipher、Clinvar 等数据库,参照美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG) 遗传变异分类标准与指南[4]对检测到的CNV的致病性进行评估。结果分为5类:致病、可能致病、临床意义未明、可能良性、良性。

1.3统计学处理 采用Excel 2007软件进行数据处理及统计分析。

2 结 果

723例高龄孕妇中检出染色体异常共29例,异常检出率为4.0%。723例高龄孕妇中,染色体核型分析检出核型异常21例,异常检出率为2.9%,CNV-Seq检测结果异常24例,异常检出率为3.3%;核型异常中包括染色体非整倍体13例,染色体嵌合体3例,染色体结构异常5例;CNV-Seq检测结果异常包括染色体非整倍体13例,染色体嵌合3例,致病性染色体拷贝数变异(pCNVs)8例。

723例高龄孕妇中检出染色体非整倍体13例,包括21-三体7例,18-三体1例,性染色体非整倍体5例,其中47,XXX 2例、47,XYY 2例、47,XXY 1例,染色体核型分析结果与CNV-Seq结果均一致。见表1。723例高龄孕妇中检出染色体嵌合3例,包括性染色体嵌合2例,常染色体嵌合1例。染色体核型分析结果与CNV-Seq检测结果在嵌合比例上均不一致。见表1。

表1 723例高龄孕妇中羊水染色体核型分析异常与CNV-Seq检测结果比较

723例高龄孕妇中检出染色体结构异常5例,包括染色体倒位3例,染色体易位2例。染色体核型分析结果与CNV-Seq检测结果均不一致,其中CNV-Seq检测结果均未见异常。见表1。

723例高龄孕妇中检出pCNVs 8例,包括染色体微重复1例,染色体微缺失7例。染色体核型分析结果与CNV-Seq检测结果均不一致,其中染色体核型分析结果均未见异常。见表1。

3 讨 论

近年来,伴随“三孩”政策的落地,高龄孕妇比例不断增多。《低深度全基因组测序技术在产前诊断中的应用专家共识》[5]为CNV-seq技术在产前诊断中的规范应用提供了指导建议。本研究通过回顾性分析723例高龄孕妇产前诊断中胎儿染色体核型分析及CNV-Seq异常检出情况,探讨二者联合检测在高龄孕妇产前诊断中的临床应用价值,为临床医生提供参考依据。

染色体非整倍体异常可引起严重的出生缺陷,是产前诊断中最为常见的胎儿染色体异常,染色体核型分析与CNV-Seq都可提示胎儿染色体非整倍体异常,二者联合应用可相互验证。本研究中723例高龄孕妇中检出染色体非整倍体13例,包括21-三体7例,18-三体1例,性染色体非整倍体5例,染色体核型分析和CNV-Seq 检测结果一致,提示染色体核型分析和CNV-Seq都可以准确地检测胎儿染色体的非整倍体异常。同时使用两种原理不同的检测技术可以相互验证其结果的准确性,以最大限度地降低缺陷儿的出生,减少漏诊、误诊。

本研究中723例高龄孕妇中检出染色体嵌合3例,包括性染色体嵌合2例,常染色体嵌合1例,但嵌合比例核型与 CNV-Seq检测结果均不一致。性染色体嵌合中1例核型分析结果为45,X嵌合比例为5.5%,而CNV-Seq检测结果为45,X,嵌合比例为19%,1例核型分析结果为45,X和46,X,i(X)(q10)的嵌合比例分别为19%和81%,而CNV-Seq检测结果为X染色体短臂缺失,1例常染色体嵌合中核型分析结果为47,XY,+9的嵌合比例为45%,而CNV-Seq检测结果为9号染色体,嵌合比例为18%。提示由于染色体核型分析和CNV-Seq原理不同,在染色体嵌合体诊断中及嵌合比例分析中存在差异。有研究报道,CNV-Seq联合染色体核型分析可弥补单一检测方法诊断嵌合体出现误诊的不足[6],CNV-Seq可检测低至5%的嵌合体[7]。染色体核型分析和CNV-Seq检测结果不一致的标本可通过荧光原位杂交(FISH) 、多重连接依赖式探针扩增技术(MLPA) 等第3种方法进行验证,为临床提供最准确的依据。

染色体核型分析可以检测染色体倒位、易位及罗伯逊易位的类型,CNV-Seq可以检测有无致病性遗传物质的增多或减少,二者联合应用可明确胎儿染色体大片段重排的类型及意义。本研究中723例高龄孕妇中染色体核型分析检出染色体结构异常5例,包括染色体倒位3例,易位2例,而CNV-Seq检测结果未见异常。有研究表明产前诊断标本中染色体罗氏易位和相互易位占比约为0.89%和1.82%[8],若胎儿易位或倒位来自父母双亲之一,且没有总遗传物质的丢失或增加,则不影响胎儿的表型和智力发育[9],孕妇可继续妊娠。若新发易位或倒位在发生重排的同时发生其他拷贝数变异,涉及致病性遗传物质的增多或减少,则孕妇需进行相应的遗传咨询决定是否继续妊娠。因此,倒位或相互易位的胎儿携带者需联合CNV-Seq检测确定染色体在发生重排的同时总体遗传物质是否发生了改变,以提高产前诊断的精准度,减少误诊、漏诊。

CNV-Seq是一项基于高通量测序技术的基因组拷贝数变异检测,可通过改变分辨率、调整测序深度检测不同大小的CNV,其优势主要包括操作简便、检测范围广、分辨率高、周期短、所需DNA样本量低[10],WANG等[11]报道该技术与染色体核型分析比较,对致病性或可能致病的CNV检出率由1.8%提高至2.8%,可靠性和准确性较好,且适用性较好。本研究中所用的方法分辨率为100 kb,可很好地弥补染色体核型分析分辨率低的不足。本研究723例高龄孕妇中CNV-Seq检出pCNVs 8例,包括染色体微重复1例,染色体微缺失7例,染色体核型分析均未见异常。CNV-Seq检测可额外诊断染色体微缺失/微重复综合征,发病率为1/50 000～1/400[12]。染色体微缺失/微重复综合征会导致一些复杂临床表型,如智力发育异常、生长发育迟缓、内分泌异常、内脏器官畸形等,是染色体疾病中的常见类型,目前已发现67种染色体微缺失/微重复综合征。研究证实CNV-Seq能明显提高致病性染色体微缺失/微重复的检出率,是检测该种染色体畸变的有效方法,因此,对高龄孕妇的产前诊断联合应用染色体核型分析和CNV-Seq有很重要的临床意义[13-15]。

综上所述,在对高龄孕妇实施产前诊断时,染色体核型分析和CNV-Seq检测两种方法各自有独特的优势,联合使用可以相互验证,互补不足,染色体核型分析可比较直观地检测出染色体结构变异,而 CNV-Seq可检测出染色体微缺失、微重复,有效提高染色体异常检出率,减少遗传缺陷患儿的出生,为临床的产前咨询提供有效、可靠的依据。