急性髓系白血病多次输血患者血清存在抗-M、抗-Jka和抗-Wra抗体的鉴定、基因分析及配血策略

马思飞,张建伟,杨红梅

常州市中心血站,江苏常州 213000

急性髓系白血病 (AML) 是一类来源于造血干细胞来源的克隆性血液系统疾病,患者骨髓、外周血和组织中往往存在大量异常白血病细胞,临床上以感染、出血、贫血和髓外组织器官浸润为主要表现。随着红细胞降低、血红蛋白水平降至60 g/L以下且机体出现乏力、心慌气促等贫血症状时,则需要输注血液制品[1]。因多次输血产生复杂意外抗体的患者数量呈现逐年增长趋势,成为临床输血部门面临的新挑战。血液输注是临床救治患者的常规手段,不同血型红细胞具有不同血型抗原,当患者与供血者的血型不合,则同种异体红细胞进入患者体内,会刺激机体产生免疫性抗体,并引起同种免疫排斥,导致输血反应发生。意外抗体是指不符合ABO系统Landsteiner法则的抗体,包括非ABO血型系统抗体和ABO亚型抗体[2]。多次输血的患者可能会产生复杂的意外抗体,特异性抗体确定困难,且患者外周血中出现不同供血者的红细胞而导致抗原分型困难。笔者发现1例因多次输血导致配血不合的AML患者,经鉴定,该患者血清中存在抗-M、抗-Jka和抗-Wra抗体,本研究就复杂意外抗体的鉴定、基因分析及配血策略进行分析,现报道如下。

1 资料与方法

1.1病例简介 患者,女,46岁,因AML急性变而进入某三甲医院治疗,既往有妊娠史和多次输血史,最近一次输血日期为2023年2月28日。此患者因乏力、心慌加剧就诊于江苏省某三甲医院,血红蛋白35 g/L,就诊医院抗体筛查阳性,交叉配血不合,故于2023年3月20日送至本站做抗体鉴定及交叉配血,申请洗涤红细胞6 U。

1.2标本采集 采集患者血液标本并分离血清。将患者红细胞洗涤3次制备2%～5%的红细胞悬液。

1.3仪器与试剂 使用主要仪器包括久保田KA-2200血清学专用离心机、贝索2020-2低速离心机、长春博研FYQ型试剂卡孵育器、贝索毛细管离心机2403及ORTHO工作站。使用主要试剂包括抗-A、抗-B单克隆抗体,抗-C、抗-c、抗-E、抗-e抗体,ABO血型反定型红细胞(上海血液生物医药有限责任公司,批号:20220101、20220101、20223001、20223101、20223203、20223301、20235307),抗-D(IgM)单克隆抗体(北京金豪制药股份有限公司,批号:20220601102),抗Jka、抗Jkb抗体(德国CE免疫诊断公司,批号:220-1、136-1),抗-M、抗-N抗体(上海血液生物医药有限责任公司,批号:20220725、20200709);IgG型抗-Wra抗体(德国CE免疫诊断公司,MWraM033),进口抗体筛选细胞、谱细胞1(REAGENS公司,批号:702303、732303);谱细胞2(Sanquin公司,批号:8000458616);抗IgG+C3d、抗IgG和抗C3d试剂(上海血液生物医药有限责任公司,批号:20215001、20215103、20225201),凝聚胺试剂(珠海贝索生物技术有限公司,批号:A211203),2-巯基乙醇(上海血液生物医药有限责任公司),ORTHO抗球蛋白试剂卡(批号:AHC284H)。

1.4方法 直接抗球蛋白试验、抗体筛选试验、2种谱细胞抗体鉴定、酸放散试验、抗体效价测定、吸收放散试验、毛细管离心法及交叉配血试验等步骤严格按照《全国临床检测操作规程》及试剂说明书进行。2-巯基乙醇灭活血清试验步骤参照试剂说明书及文献[3]。设计特异性引物扩增RHCE基因和MN基因。RHCE和MN等位基因命名方法参照ISBT血型抗原等位基因数据库,该试验由天津秀鹏生物技术开发有限公司完成。本研究经过本站医学伦理委员会审批通过(伦理审批号:xz202204)。

1.5统计学处理 采用Excel2007软件进行数据处理及统计学分析。

2 结 果

2.1血清学试验结果 患者血型为B(凝集强度4+)、CcDEe(C凝集强度4+;c凝集强度3+,红细胞呈现混合外观;D凝集强度3+;E凝集强度3+,红细胞呈现混合外观;e凝集强度3+)、Jka-b+、MN(M凝集强度3+,红细胞呈混合外观;N凝集强度3+,红细胞呈混合外观)、Wra-(阴性);E、c、M、N表型呈混合外观,考虑患者近期有输血史,故采用毛细管离心法分离近心端(新生细胞)和远心端(陈旧细胞)细胞,再次进行分型。患者Rh系统分型为CcEe,MN系统分型为MN(M凝集强度变弱,仍呈混合外观),见表1。

2.2RhCE基因序列分析 根据 ISBT 网站提供的(ISBT 004) RHCE blood group alleles v6.2-31-MAR-2022,以 RHCE*01(RHCE*ce,NG_009208.3)为参考序列,测序结果显示该标本RHCE基因在外显子1～10的情况,其中在外显子2和外显子5位上存在碱基突变,见图1。

注:箭头所指表示此处波峰异常,碱基突变。测序结果提示该标本为RHCE*CcEe,但值得注意的是缺少c.48G>C的突变,该突变并未被 ISBT 数据库收录,其血清学意义值得进一步探索。

2.3MN血型基因测序结果 参照ISBT发布的 Names for MNS (ISBT 002)blood group alleles v4.1 170119,以GYPA*01基因(NG_007470.3)为参考序列,发现MN血型基因特异性关键位点在GYPA基因的第2外显子的第59号位、第71号位和第72号位。证实该患者血液标本属于GYPA*N型纯合标本,其MN血型的表型为NN,见图2。

注:箭头所指表示此处波峰异常,碱基突变。

2.4直接抗球蛋白试验 患者多抗(IgG+C3d)弱阳性,抗-IgG阴性,抗-C3d弱阳性。对患者红细胞酸放散液与抗体筛查细胞进行检测,酸放散试验未检出意外抗体。

2.5抗体筛选试验 盐水介质中,患者血清与含M抗原的细胞凝集,考虑存在IgM型抗-M抗体。根据剂量效应(即纯合子基因编码的抗原量多于杂合子的抗原量),在抗球蛋白、凝聚胺介质中患者血清与M杂合子细胞凝集,而M纯合子未出现凝集,与盐水介质下格局不符,考虑患者血清中存在其他系统IgG型抗体。

2.6抗体特异性鉴定试验 将患者血清与谱细胞1中细胞反应,结果见表2。在盐水介质下,经离心出现2、6、8号(M纯合子)弱凝集,由于抗-M 抗体存在剂量效应,与纯合子细胞反应明显强于杂合子细胞,且血清中抗-M抗体与红细胞反应较血浆中弱,出现假阴性的结果或不反应,易漏检,故再次用血浆与谱细胞1反应,格局符合抗-M抗体,借助谱细胞1可确认患者存在抗-M抗体。患者血清经2-巯基乙醇灭活后与谱细胞1细胞加入抗球蛋白试剂卡结果显示3、9和11号出现弱凝集,提示存在其他系统抗体。剂量效应发现3、9和11号为Jka纯合子,考虑可能存在抗-Jka,但谱细胞1中凝集强度较弱不能确定,此时患者血清较足量且抗体复杂,需借助谱细胞2完成抗体鉴定。谱细胞2显示抗-Jka抗体存在,但值得注意的是患者血清中还存在抗-Wra抗体。患者红细胞MN、Kidd系统分型及Wra抗原见图1,与血清中检出结果吻合。结合以上结果,判断患者血清中存在抗-M、抗-Jka和抗-Wra,共3种意外抗体。

表2 患者血清与谱细胞1反应格局及结果

2.7吸收放散试验 血型系统抗体可能会干扰谱细胞试验而影响反应格局,为确定患者血清中抗体特异性,笔者继续进行吸收放散试验,挑选M抗原阴性、Jka抗原阳性的细胞与患者血清结合,采用热吸收酸放散(37 ℃,30 min吸收),将放散液与吸收后的血清再次进行谱细胞试验,试验表明患者血清中存在抗-M和抗-Jka抗体。遗憾的是该试验无法筛选到M-/Jka-/Wra+的献血者,无法对抗-Wra进行吸收放散试验。

2.8效价测定 采用试管法对血浆/血清进行倍比稀释,总体系为100 μL,抗-M效价室温(IS)为4,4 ℃为8,抗球蛋白介质<1。抗球蛋白介质中抗-Jka效价为2。抗-Wra抗体未进行效价测定。本站以出现±的最低稀释倍数为最终效价。

2.9交叉配血试验 患者就诊医院先后3次送检患者标本至本站,共筛选6袋B型洗涤红细胞(分型为NN、Jka-、Wra-)与该患者进行交叉配血,主侧在盐水、抗球蛋白及凝聚胺介质中均无凝集、无溶血。回访医院,得知患者发生输血无不良反应。

3 讨 论

AML是较慢性淋巴细胞白血病异质性更强的血液系统恶性肿瘤,是成人中最常见的急性白血病,具有恶性程度高、易复发、并发症多和预后差的临床特点。输血是临床支持治疗的重要手段。目前,红细胞血型已命名了 45个血型系统,共有360种红细胞血型抗原。多次输血可产生多种意外抗体,导致抗体鉴定的难度增加,为避免输血不良事件发生,需要能够准确鉴定抗体以确定患者红细胞各系统表型分型的技术手段。当单一谱细胞难以鉴定出全部意外抗体的特异性时,需要采取抗体筛查细胞结合多种谱细胞的方案。在中国合格评定国家认可委员会制定的《医学实验室质量和能力认可准则在输血医学领域的应用说明》中也提到抗体筛查必须至少使用2种以上的谱细胞。当患者体内检出的意外抗体与患者红细胞抗原表型不吻合,这时需借助毛细管离心法分离新生细胞和陈旧细胞,进一步鉴定其表型,但该类患者可能因近期多次输血导致外周血循环中出现不同供血者的红细胞,毛细管离心法也不能准确分型时,需进行基因测序。但有研究报道,碱基测序技术进行基因分型易产生假阴性或假阳性[4],虽然笔者并未观察到该现象,但从输血安全考虑假阴性可接受,还需进一步研究。

MNSs血型系统在临床上的重要性仅次于ABO血型系统和Rh血型系统[5]。抗-M抗体多为天然产生,大多数为IgM型,少数为IgG型,4 ℃活性最强。红细胞保存温度为2～6 ℃,输入M抗原阳性的供血者红细胞极易与高效价的抗-M抗体结合,从而引起溶血,若此时补体参与,则可加剧红细胞的溶解破坏,严重时可危及患者生命[6]。近年来,关于Kidd和Diego血型系统抗体的研究越来越多。抗-Jka抗体属于Kidd系统,常为IgG型,少见IgG和IgM混合物,该抗体的产生多由输血引起[7]。长期不受抗原刺激的Kidd系统抗体效价会很快降低,临床极易因其效价低而漏检,且随着抗体的消逝,输血风险随之增加,此时输注抗原阳性血液会很快引起记忆反应,抗体效价激增,结合补体则可引起严重的溶血反应[8]。因此,当抗体筛查细胞或1种谱细胞不能排除抗-Jka抗体的存在时,需结合另1种谱细胞,保证该类患者再次输血时选取的是抗原阴性的血液。值得注意的是,血浆中由于含有去钙抗凝剂,可能会掩盖该抗体的检出,故本站在抗体鉴定时应用的是患者血清。Wra(DI3)是Diego血型系统中的低频抗原,抗原频率<0.01%,抗-Wra是一种相对常见的抗体,可以是37 ℃以下,由IgM类抗体导致的凝集,也可以只是抗球蛋白介质中IgG类抗体导致的凝集,常合并其他抗体出现,但也有抗-Wra单独引起输血性溶血和新生儿溶血反应的报道[9],这提示即使诱导的是非免疫性抗体的低频抗原,在临床血液输注及鉴定中也应提高警惕。笔者发现REAGENS抗体筛查细胞和谱细胞中没有该抗原,极易漏检,所以,输血实验室有必要配备至少2种谱细胞,才能提高抗体特异性鉴定的精准性,保障输血安全。

本例患者患病3个月,既往抗体筛查试验阴性,交叉配血相合,因多次输血产生抗-M、抗-Jka和抗-Wra3种意外抗体。遗憾的是医院在此期间并未送检该患者标本,所以本站无法知晓3种抗体是否同时产生。且笔者推测在抗-M抗体和抗-Jka抗体产生初期,效价低,抗体筛查极易漏检,配血结果也相合,此时临床很可能输注M抗原和Jka抗原阳性血液而使抗体效价升高,加重溶血。因患者血红蛋白下降至35 g/L,乏力、心慌加剧,急需输血,故送标本至本站检测,本站先进行交叉配血试验。由于该患者RH系统C、c、E、e 4种分型皆有,故选取的献血者暂不考虑RH分型,筛选NN、Jka-和Wra-阴性红细胞与患者血液标本进行配血。M抗原的抗原频率与Jka抗原频率相似。本站配血方案先筛选M阴性红细胞,再筛选Jka阴性红细胞,后进行交叉配血,相合的血液再鉴定低频抗原Wra。将相合血液且Wra阴性血液紧急发往医院救治患者,追踪临床得知患者输血效果良好。针对该患者后续配血试验,本站会关注其抗体筛查情况、监测抗体效价,做到持续追踪记录。针对患者E、c、M、N分型呈现混合外观继续进行基因测序分析,确定患者自身红细胞抗原分型,保证试验的完整性、可靠性。缺乏c.48G>C突变是否影响RhCE血清学试验分型结果尚未可知,笔者将在后续的研究中进一步探索其意义。

意外抗体的产生原因中,输血因素往往大于妊娠因素,对于临床上多次输血的患者需要额外注意,鉴定其意外抗体时应多种试验联合进行,将基因测序与血型血清学试验相结合,以便更加准确鉴定抗体并做到同型输注,避免或延缓意外抗体的产生,一旦病情恶化急需输血时,无或者较少的意外抗体患者较容易找到相合血液,可争取最佳抢救时间。