枯草芽孢杆菌发酵对豆类中酚类物质及抗氧化活性的影响

唐双庆，鲁慧琪，李秀丽，邱怡君，王 敏，徐 媛，王红波，2*

（1 江汉大学生命科学学院 食品营养与安全研究中心 武汉430056 2 湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心 武汉 430056）

豆类不仅含有碳水化合物和蛋白质等营养成分，还含有多酚、多肽和低聚糖等生物活性成分[1]。植物多酚是广泛存在于植物体内的次生代谢物，主要存在于植物的果、皮、根、叶等组织器官中，具有抗氧化、抗糖尿病、降低胆固醇、护肝以及抗心脑血管疾病等功效，植物多酚已引起食品研究领域的广泛关注[2-5]。发酵豆制品是我国居民喜食的传统豆类食品，微生物发酵可提高豆类的营养特征和生物活性功能[6]。目前，枯草芽孢杆菌、乳酸菌和少量真菌等微生物菌种可应用于豆类发酵[7]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）常用于食品和动物饲料产品的加工。枯草芽孢杆菌所产纳豆激酶在体内、外均具有溶栓活性，且对机体无毒性，经枯草芽孢杆菌发酵的豆类食品营养价值和生物活性能得到显著改善[8]。Sanjukt 等[9]研究表明枯草芽孢杆菌发酵大豆和黑豆，其总酚含量分别从1.93 mg GAE/g 和1.64 mg GAE/g 增至7.9～8.4 mg GAE/g和6.9～7.5 mg GAE/g，且大豆的DPPH 自由基清除率从1.3 mg AAE/g 增至29.9 mg AAE/g。Limón等[10]研究发现菜豆经枯草芽孢杆菌发酵后，可溶性酚类含量在48 h 和96 h 分别提升96%和126%，且氧自由基清除能力从170 mg TE/g 最高增至540 mg TE/g。自由基的氧化应激对生物细胞具有毒害作用，抗氧化活性物质有利于清除氧化自由基，酚类物质含量与抗氧化能力显著相关[11]。国内外现有研究报道多集中在微生物发酵对1～5种常见豆类酚类含量及抗氧化活性的比较研究，而研究豆类种类偏少，且不同酚类物质含量变化研究也不充分。本研究评价枯草芽孢杆菌ATCC 6051 发酵对绿豆、蚕豆、豇豆、红豆、菜豆、豌豆、大豆以及扁豆总酚含量，19 种多酚类物质组成和抗氧化活性的影响，为中国传统发酵豆类食品的开发和推广提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

8 种豆类（绿豆、蚕豆、豇豆、红豆、菜豆、豌豆、大豆、扁豆），湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心。菌种枯草芽孢杆菌ATCC 6051 保藏于江汉大学食品营养与安全研究中心。

6-羟基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、芦丁、2，4，6-三（2-吡啶基）-1，3，5-三 嗪（2，4，6-Tri（2-pyridyl）-1，3，5-triazine，TPTZ），北京索莱宝公司；氢化肉桂酸等19 种标准品，美国Sigma 公司；2，2’-联氮双-（3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸）二胺盐（2，2’-Azinobis（3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），麦克林公司；LB（Luria-Bertani）肉汤培养基，海博生物技术有限公司；没食子酸等分析纯级试剂均购于国药集团。

1.2 仪器与设备

YRE-201D 旋转蒸发器（配有SHZ-DⅢ循环水式真空泵），予华仪器有限责任公司；SPX-150B-Z 型生化培养箱，上海博讯实业有限公司；Freezone 6 Plus 冷冻干燥机，LABCONCO；Vanquish 超高液相色谱-质谱联用（配电喷雾离子源以及TraceFinder 数据处理系统）、Multiskan Go 1510 全波长酶标仪，Thermo 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化 制备LB 肉汤和固体培养基，于121 ℃条件下灭菌15 min。将冻藏于-80 ℃条件下的Bacillus subtilis ATCC 6051 菌种接种划线，于37 ℃下培养24 h 后，挑取单菌落进行振荡培养，得到种子液。

1.3.2 发酵处理 参考Li 等[12]和Saharan 等[13]的发酵方法。将8 种豆类分别磨成粉末状，每种豆粉称取10 g，置入洁净发酵瓶，转移至灭菌锅，灭菌条件为121 ℃/15 min，冷却后，按照5%体积分数接入种子液，发酵温度设置为37 ℃，发酵时间设置为7 d。发酵结束后，将样品置于-80 ℃冰箱冷冻干燥12 h，于-20 ℃储存待测。

1.3.3 酚类物质提取 参考王何柱等[14]酚类物质提取方法。称取1 g 冻干样品于试管中，加入80%丙酮溶液20 mL，剧烈振荡10 min，取上清液通过0.22 μm 滤膜过滤，重复此操作2 次。收集滤液蒸干至10 mL，加入蒸馏水定容至25 mL，置于-20℃下冷藏待分析。

1.3.4 总酚含量测定 参考Hung 等[15]总酚含量测定方法。配制不同浓度没食子酸标准溶液。取0.5 mL 标准溶液或样品溶液，加入0.5 mL 福林酚试剂，摇匀，静置30 s，加入3 mL 10 g/100 mL Na2CO3溶液，蒸馏水定容至5.0 mL，黑暗条件下反应30 min。在波长760 nm 处测定吸光度值，绘制标准曲线。结果用毫克没食子酸当量每克干重豆粉表示（mg GAE/g dw）。

1.3.5 酚类物质组成分析 利用超高液相色谱-质谱联用（外标法定量）测定酚类组成。色谱条件和质谱条件参考文献[16]～[18]的方法。色谱条件：色谱柱：Waters HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：A 相为超纯水，B 相为乙腈（A、B 相均含有0.1%乙酸）；流速：0.3 mL/min；柱温：40℃；进样量：2 μL；流动相洗脱梯度程序如下：0.0 min 水∶乙腈（90∶10，V/V）；2.0 min 水∶乙腈（90∶10，V/V）；6.0 min 水∶乙腈（40∶60，V/V）；8.0 min 水∶乙腈（40∶60，V/V）；8.1 min 水∶乙腈（90∶10，V/V）；12.0 min 水∶乙腈（90∶10，V/V）。质谱条件：采用电喷雾离子源，鞘气：40 arb；辅助气：10 arb；离子喷雾电压：-2 800 V；温度：350 ℃；离子传输管温度：320 ℃。扫描模式：单离子检测模式；扫描方式：负离子。样品酚类物质含量对照标准品浓度计算得出。

1.3.6 抗氧化活性测定

1.3.6.1 DPPH 清除活性测定 参考白周亚等[19]DPPH 自由基清除活性测定方法。配制DPPH 溶液和Trolox 系列标准溶液。按照以下方式添加A0、A1和A2待测液进行测定：A0为1 mL DPPH 中加入1 mL 蒸馏水，A1为1 mL 标准液或样品溶液中加入1 mL 无水乙醇，A2为1 mL 标准液或样品溶液中加入1 mL DPPH 溶液，摇匀，于黑暗条件下静置30 min，于波长517 nm 处分别测定A0、A1和A2吸光度值。豆类提取物DPPH 自由基清除活性以清除率表示。DPPH 清除率按公式（1）计算：

1.3.6.2 ABTS+清除活性测定 参考Moghadam等[20]ABTS+自由基清除活性测定方法。提前制备ABTS+清除活性测定工作液，配制不同浓度的Trolox 标准溶液，调整ABTS+工作液吸光度至0.700±0.001。按照以下方式添加Ai和A0待测液进行测定：Ai为100 μL 标准溶液或样品溶液中加入1 mL ABTS 稀释液，A0为100 μL 甲醇中加入1 mL ABTS 稀释液，于黑暗条件下静置10 min，于波长734 nm 处分别测定Ai和A0吸光度值，绘制标准曲线。豆类提取物ABTS+自由基清除活性以每克干重豆粉所含Trolox 当量的微摩尔数表示（μmol TE/g dw）。ABTS+清除率按公式（2）计算：

1.3.6.3 铁离子还原能力测定 参考唐双庆等[21]铁离子还原能力测定方法。提前制备FRAP 工作液，使用前预热至37 ℃。配制不同浓度FeSO4·7H2O 标准溶液。分别取100 μL 标准液或样品溶液，加入1.8 mL FRAP 工作液，混匀，37 ℃水浴反应10 min，于波长593 nm 处测定吸光度值，绘制标准曲线。豆类提取物铁离子还原能力以每克干重豆粉所含硫酸亚铁当量的微摩尔数表示（μmol FE/g dw）。

1.3.7 数据分析 试验均设置3 组重复，结果按照“平均值±标准差”表示。采用SPSS 26 分析数据的显著性和相关性，Origin Pro 2021 绘图。

2 结果与分析

2.1 豆类总酚含量变化

图1 为发酵前、后8 种豆类总酚含量变化。发酵前扁豆、豌豆、绿豆、大豆、蚕豆、菜豆、红豆和豇豆总酚含量依次为（1.16±0.05），（1.39±0.17），（1.55±0.06），（1.58±0.11），（1.85±0.13），（2.85±0.13），（4.63±0.30），（5.56±0.59）mg GAE/g dw，豇豆和红豆总酚含量较高，豌豆和扁豆总酚含量较低。发酵绿豆、豇豆、红豆、菜豆、蚕豆、豌豆、大豆和扁豆总酚含量分别达到（4.23±0.54），（3.86±0.24），（5.75±0.58），（4.50±0.15），（4.14±0.19），（6.16±0.55），（5.14±0.06），（4.64±0.55）mg GAE/g dw。发酵豇豆总酚含量下降了30.58%，可能由于枯草芽孢杆菌在发酵过程中多酚氧化酶活力较高，导致酚类化合物被氧化分解，豇豆总酚含量降低[22]。发酵红豆、菜豆、蚕豆、绿豆、大豆、扁豆和豌豆总酚含量分别增加24.19%，57.89%，123.78%，172.90%，225.32%，300.00%和343.17%。发酵豆类总酚含量增加与枯草芽孢杆菌发酵过程产生β-葡萄糖苷酶有关，这种酶可以水解以共轭形式存在的酚苷的β-葡萄糖苷键，使之成为相应的酚苷元，从而增加游离总酚含量[23]。Jhan 等[24]研究也发现发酵红豆总酚含量从（2.59±0.01）mg GAE/g 增加至（3.63±0.03）mg GAE/g。Ali 等[25]研究发现发酵绿豆、大豆和蚕豆总酚含量增加。

图1 8 种豆类发酵前、后总酚含量变化Fig.1 Changes in the total phenol content of 8 kinds of beans before and after fermentation

2.2 豆类酚类物质组成分析

图2 为19 种酚类物质标准品离子流色谱图。表1 为发酵前、后8 种豆类19 种酚类化合物含量。发酵豇豆、蚕豆、绿豆、豌豆、菜豆、红豆、大豆和扁豆游离苯丙氨酸含量分别增加了706.92%，806.94%，878.97%，1041.82%，1489.77%，1645.47%，1 910.11%和4 077.23%，发酵大豆具有最高的苯丙氨酸含量，达到（174.88±9.09）μg/g。苯丙氨酸是一种人体必需氨基酸，发酵过程中微生物分泌水解蛋白酶是游离苯丙氨酸含量提高的原因[26]。3，4-二羟基苯甲酸、苯甲酸和对香豆酸是常见的防腐剂[27]，发酵后8 种豆类3，4-二羟基苯甲酸和苯甲酸含量上升，对香豆酸含量下降，发酵红豆3，4-二羟基苯甲酸含量最高达到（14.96±0.78）μg/g，发酵大豆苯甲酸含量最高达到（5.19±0.82）μg/g。3，4-二羟基苯甲醛、丁香醛和香草醛3 类醛类化合物在微生物发酵过程中，易被氧化生成相应的酸类化合物，发酵后均未被检出。儿茶素、表儿茶素、水杨酸和芥子酸是8 种豆类中具有抗氧化功能的酚酸[28-29]。发酵能影响豆类中儿茶素、表儿茶素、水杨酸和芥子酸的含量。发酵红豆和豇豆中儿茶素、表儿茶素含量增加，分别达到（21.64±2.77）μg/g 和（13 .90 ±1 .48）μg/ g，（5 .00 ±0 .28）μg/ g 和（2 .38±0.37）μg/g。发酵红豆的水杨酸含量上升，达到（1.15±0.19）μg/g；而菜豆芥子酸含量下降了87.80%。

表1 8种豆类发酵前、后酚类化合物组成Table 1 Phenolic composition of 8 kinds of beans before and after fermentation

图2 19 种酚类化合物标准品离子流色谱图Fig.2 Ion chromatography of 19 phenolic compound standards

2.3 豆类提取物抗氧化活性变化

2.3.1 豆类提取物DPPH 清除活性图3a 为发酵前、后8 种豆类提取物DPPH 清除活性变化。发酵前红豆、豇豆和菜豆提取物DPPH 清除活性较高，分别达到95.10% ± 0.24%，95.37% ± 0.40%和81.82%± 2.40%。发酵后豇豆和菜豆DPPH 自由基清除活性分别下降了20.48%和39.86%。抗氧化活性与总酚含量显著相关，豇豆总酚含量下降，导致DPPH 自由基清除活性下降[30]。豆类抗氧化活性组分主要有酚类化合物和类胡萝卜素等，菜豆提取物DPPH 自由基清除活性下降，可能与发酵过程中具有抗氧化活性成分含量下降的原因有关[31]。发酵后绿豆、豌豆、蚕豆、扁豆和大豆提取物DPPH 自由基清除活性均有提高，其中豌豆和大豆提高最多，分别增加了118.00%和106.94%。Li 等[12]研究发现干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）发酵大豆48 h 后大豆提取物DPPH 自由基清除活性增加至61.10%。Jeon 等[32]利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）P229发酵大豆，也获得了较高的DPPH自由基清除率。

图3 8 种豆类发酵前、后抗氧化活性变化Fig.3 Changes in antioxidant activity of 8 kinds of beans before and after fermentation

2.3.2 豆类提取物ABTS+清除活性图3b 为发酵前、后8 种豆类提取物ABTS+清除活性变化。发酵前蚕豆、红豆和豇豆提取物ABTS+自由基清除活性较高，分别达到（36.18±1.70），（40.29±1.93），（47.86±1.93）μmol TE/g dw。发酵后豇豆和蚕豆提取物ABTS+自由基清除活性分别下降了54.91%和60.59%。豇豆提取物ABTS+自由基清除活性与发酵后其总酚含量下降相关。研究发现少孢根霉发酵也会导致蚕豆提取物ABTS+清除活性下降[33]。发酵后绿豆、大豆、扁豆和豌豆提取物的ABTS+清除活性上升，分别提高了241.34%，176.29%，244.95%和570.60%，其中豌豆ABTS+清除活性上升最高。Yu 等[34]研究发现利用蛹虫草（Cordyceps militaris）SN-18 发酵绿豆，其ABTS+清除活性提升了2.1 倍。

2.3.3 豆类提取物铁离子还原能力 图3c 为发酵前、后8 种豆类提取物铁离子还原能力变化。发酵前红豆和豇豆提取物铁离子还原能力较高，分别达到（47.60±0.72），（59.49±0.97）μmol FE/g dw。发酵后绿豆、扁豆、豌豆和大豆提取物铁离子还原能力分别提高了69.07%，188.63%，279.87%和297.12%。发酵后豇豆、红豆和菜豆提取物铁离子还原能力下降，其中豇豆最多下降了61.35%。Muhialdin 等[35]研究发现发酵苦豆提取物铁离子还原能力下降了6.75%。

利用3 种不同抗氧化活力评价方法比较分析8 种豆类发酵前、后抗氧化功能变化。研究结果表明：大豆、绿豆、豌豆和扁豆适宜于利用枯草芽孢杆菌发酵制备高抗氧化活力的豆类食品。

2.4 不同豆类总酚含量及酚类组成与抗氧化活性的相关性分析

由表2 可知，总酚含量与DPPH 自由基清除活性、ABTS+清除活性和铁离子还原能力均极显著相关（P＜0.01）。刘婷婷等[36]对不同杂豆总酚和抗氧化活性的研究表明，总酚与总抗氧化之间呈极显著正相关。本研究发现儿茶素、水杨酸和反式肉桂酸与DPPH、FRAP 呈极显著正相关，芥子酸与DPPH 呈极显著正相关（P＜0.01）；表儿茶素与DPPH 呈显著正相关，水杨酸与ABTS 呈显著正相关，3，4-二羟基苯甲酸和氢化肉桂酸与DPPH、FRAP 呈显著正相关（P＜0.05）。多酚化合物清除自由基抗氧化活性主要通过顺序质子损失电子转移、氢原子转移和单电子转移等机制实现[37]。儿茶素和水杨酸等酚类化合物可以通过给出氢离子与自由基结合或直接给出电子将自由基转化为反应活性低的阴离子，还可以先给出质子转化为阴离子，再由阴离子给出电子将自由基转化为阴离子去清除自由基[38-39]。苯丙氨酸、香草酸、香草醛、没食子酸、丁香酸、丁香醛、咖啡酸、4-羟基苯甲酸、对香豆酸、反式阿魏酸和苯甲酸与抗氧化相关性较低。王何柱等[40]对不同花色芸豆的酚类化合物与抗氧化进行相关性分析，发现没食子酸、咖啡酸、4-羟基苯甲酸、对香豆酸和阿魏酸也与抗氧化的相关性较低。

表2 总酚、酚类组成与抗氧化活性的相关性Table 2 Correlation between total phenols，phenolic composition and antioxidant activity

3 结论

本试验利用枯草芽孢杆菌ATCC 6051 发酵绿豆和红豆等在内的8 种常见豆类。发酵后绿豆、红豆、蚕豆、菜豆、大豆、豌豆和扁豆7 种豆类多酚含量增加，其中发酵豌豆总酚含量提高了343.17%，达到（6.16±0.55）mg GAE/g dw。发酵后8 种豆类游离苯丙氨酸、3，4-二羟基苯甲酸和苯甲酸含量增加。发酵绿豆、豌豆、蚕豆、扁豆和大豆提取物DPPH 自由基清除率上升，其中豌豆上升最多。发酵绿豆、大豆、豌豆和扁豆提取物ABTS+清除活性增加，其中豌豆增加最多为570.60%。发酵绿豆、扁豆、豌豆和大豆提取物铁离子还原能力提高，其中大豆增加最多为297.12%。总酚含量与3 个抗氧化指标均极显著相关（P＜0.01）。大豆、绿豆、豌豆和扁豆是利用枯草芽孢杆菌发酵制备高抗氧化活力食品的理想豆类食品原料。