大豆7S 蛋白-壳聚糖自组装核壳纳米颗粒的载体性质研究

刘玲玲，刘思琪，刘 晨，陈培鑫，班兆军

（浙江科技学院生物与化学工程学院 浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心 杭州 310023）

近年来，姜黄素因其氧化、抑菌、抗炎、抗癌、神经保护和伤口愈合等药理作用而备受关注[1]。然而，姜黄素较差的水溶性和化学不稳定性，导致其生物利用度极低[2]。研究表明，具有高载药量和智能递送特性的“核-壳”型颗粒，可有效改善难溶活性物质的水溶性和稳定性。与普通的纳米粒子相比，“核-壳”型纳米颗粒具有更多的优势，如更高的分散性、更好的控制释放特性、更强的消化稳定性等[3-5]。目前，已有多种“核-壳”型多糖-蛋白质材料被成功制备，作为活性成分的递送和控释载体[6-8]。Zhu 等[9]介绍了1 种壳寡糖和酪蛋白磷酸肽“核-壳”型微粒，该颗粒不仅显著提高了钙结合能力，还实现对姜黄素的控制释放。Tan 等[10]利用反相微乳液聚合法制备的多糖-蛋白质“核-壳”型纳米粒子用于包封花青素，表现出较高的包封效率和抗环境干扰能力，同时具有良好的生物相容性和细胞吸收能力。

通过一定的诱导手段，具有亲水基团和疏水基团的两亲性聚合物在水溶液中可自发形成“核-壳”型纳米颗粒[11-12]。鉴于此，本文利用大豆7S 蛋白和CS 分子的亲水性差异，通过具有盐溶效应的尿素调控分子间相互作用力，最终形成具有“核-壳” 型结构的纳米输送载体。利用原子力显微镜（AFM）、等温滴定微量热仪（ITC）、红外光谱仪（FTIR）、动态光散射技术（DLS）及透射电子显微镜（TEM）等仪器表征相关纳米颗粒的形貌及结构，并对其在模拟胃肠环境中的释放特性和抗肿瘤活性进行测定，以期为食品医药领域的实际应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

大豆7S 蛋白利用脱脂豆粕实验室自制。壳聚糖（Mw=200 ku，脱乙酰度≥90%），阿拉丁公司。姜黄素（～98%）、猪胆汁提取物（B8631）、胰酶（P1750）、胃蛋白酶（P7000），美国Sigma 公司，其它化学品均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

Nano-ZS 型激光动态粒度扫描仪，英国Malvern 公司；原子力显微镜，德国Bruker 公司；F-7000 型荧光分光光度计，日本Hitachi 公司；圆二色谱仪，英国AplliedPhotophysics 有限公司；等温量热滴定仪，美国MicroCal 公司。

1.3 制备方法

大豆7S（d-7S）和壳聚糖（d-CS）的解离：将7S（200 mg）和CS（200 mg）分别溶解在20 mL 解离溶液（0.5%冰醋酸，6 mol/L 尿素）中。完全溶解后，用乙酸将最终pH 值调至5.5，并在4 ℃下孵育10 h以上以完全解离。

大豆7S-壳聚糖“核-壳”型颗粒（SCP）和负载姜黄素的大豆7S-壳聚糖 “核壳” 型颗粒（Cur-SCP）的制备：将d-7S 和d-CS 溶液等比例混合，使用分子质量为8.0～14 ku 的透析管在4 ℃下用去离子水透析2 d 以去除尿素。将透析完成后的混合液离心（8 000×g，20 min），上清液即为SCP 溶液。制备负载姜黄素的Cur-SCP 颗粒溶液，需要在与d-CS 溶液混合前，将姜黄素乙醇溶液添加到20 mL d-7S 溶液中。其它步骤同SCP 的制备方法。

1.4 7S 和CS 解离过程的表征

用乙酸-乙酸钠缓冲液（10 mmol/L pH 5.5）将待测样品稀释至20 μg/mL，滴加在云母片上，于37 ℃烘箱中干燥30 min 后进行AFM 观察。驱动频率设置为300 kHz，扫描速率为1.2 Hz。图像由Digital Nanoscope 软件处理。

1.5 颗粒的表征

1.5.1 颗粒的平均粒径、电位及微观形貌 根据动态光散射（DLS）技术测量了样品的平均粒径及光散射强度。测量前，溶液用经0.22 μmol/L PES水系滤膜过滤的PBS 溶液（10 mmol/L，pH 7.0）稀释至1 mg/mL。蛋白颗粒的电位用Nano zs 仪测定，测量温度为25 ℃。颗粒的微观形貌用TEM 和AFM 进行观察。

1.5.2 CS 和7S 的相互作用 利用低容量纳米ITC 仪在25 ℃对样品进行ITC 测量，得到大豆7S和CS 复合过程的热力学性质。将300 μL d-7S（1 mg/mL）溶液加入样品池中，参考池中加入同体积的去离子水，注射器中加入50 μL 质量浓度为5 mg/mL 的d-CS。所有样品在测试前真空脱气20 min。校正试验为d-CS 溶液滴定6 mol/L 尿素pH=5.5 乙酸缓冲液。通过扣除样品滴定缓冲液的稀释热得到相应的d-CS 滴定d-7S 的反应热。

SCP 颗粒的结构特性则采用傅里叶变换红外分析仪测定，测定条件为：扫描范围400～4 000 cm-1，扫描分辨率4 cm-1。

1.5.3 颗粒的载体性质 被包封在SCP 纳米颗粒中的姜黄素可以通过以下公式计算：

未结合的姜黄素是指透析后离心所得的沉淀物中姜黄素的含量，该沉淀物用乙酸乙酯充分溶解后，离心取上清液，用紫外-分光光度计测定在波长420 nm 处的吸光值并计算所得。

1.6 释放特性及抗肿瘤活性

使用体外模拟胃（1 h）、小肠（2 h）消化模型评估Cur-SCP 中姜黄素的释放特性[13]。在不同消化时间点，取0.5 mL 消化液离心（15 000×g，30 min），并测量上清液中残留的姜黄素。

取Caco-2 细胞悬液接种到96 孔培养板中，置于培养箱中（37 ℃，5%CO2）孵化24 h，丢弃培养介质，并用100 μL PBS 清洗。之后，向96 孔培养板中分别加入用培养液稀释成原浓度0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%（V/V）的SCP、Cur-SCP 和游离姜黄素消化液，置于培养箱中培养24 h 后，使用倒置荧光显微镜观察细胞形态，并用亚甲基蓝法读取细胞在波长570 nm 处的OD 值，按照下述公式计算消化后结肠腺癌细胞Caco-2 对样品的存活率。

式中，As——样品的吸光度；而Ac——空白对照组的吸光度。

1.7 数据分析

除特别说明，每次试验进行3 次重复。试验数据通过数据分析软件SPSS 进行方差分析，并用Duncan 多重比较分析不同处理间的显著性差异（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 大豆7S 蛋白和CS 的解离及重组过程

有机大分子的簇集和自卷现象是其很重要的性质之一。通过自卷的方式，有机大分子的疏水基团聚集于分子内部，而亲水基团包围在分子外部，以形成在水相中稳定存在的结构。具有盐溶效应的尿素可以降低溶剂的促簇能力（Solvent aggregation power），将包裹在分子内部的疏水基团彻底暴露出来，为疏水活性物质提供更多的结合位点[14]。CS 和大豆7S 在低pH 值（4.5～6）下会形成不溶性凝聚物。从AFM 微观图观察到，单独的7S 和CS 在pH=5.5 条件下会自聚集成较大颗粒（图1，～93 nm 和187 nm），这与Yuan 等[15]在低pH 条件下观察的结果一致。尿素分子可以通过破坏分子间氢键和疏水相互作用力，从而使大分子发生解离。图1 显示，经尿素处理的7S 和CS 粒径大大降低（～16 nm 和41 nm），并由团聚的颗粒状态转变为柔顺的线条状或棒状，说明7S 和CS 发生了解离。

图1 天然7S（A）、CS（B）和解离7S（d-7S，A′）、CS（d-CS，B′）的AFM 图像（a）和机理图（b）Fig.1 Typical AFM 2D images（a）and mechanograms（b）of particles in nature 7S（A），CS（B）and denatured 7S（A′），CS（B′）

本试验利用ITC 技术定量分析d-7S 和d-CS混合时形成复合物的饱和浓度[16]。如图2 显示，热流量随着滴定时间的延长而降低，这说明在这个环境中，两种滴定物之间存在相互作用，且两者形成复合物的过程是一个放热过程，放热焓变值为8 kcal/mol。此外，滴定反应在CS 与大豆7S 比例达到0.5 g/g 时达到平衡，这说明7S-CS 复合物在这一比例下达到饱和，这个现象与其他研究者的报道乳球蛋白与壳聚糖的结果类似。因此，当体系中CS∶7S 小于0.5 g/g，体系中主要以解离的蛋白亚基和复合物组成；当体系中CS∶7S 大于0.5 g/g，体系中主要以解离的CS 和复合物组成。

图2 d-CS 与d-7S 的结合的ITC 测定结果Fig.2 ITC determination of the binding of d-CS to d-7S

2.2 SCP 颗粒的形成与结构表征

为了获得重组SCP 颗粒，对7S-CS 解离溶液进行缓慢透析，并监测透析过程中重组颗粒的Dz及光散射强度变化（图3a）。在0～36 h 的透析过程中，溶液的Dz值和光散射强度均呈逐渐增加的趋势，说明颗粒正在发生重组装行为。当透析时间进一步延长到48 h，溶液的Dz和光散射强度变化则逐渐平稳，这说明溶液在透析时间为48 h 时，可以形成稳定的重组颗粒。经DLS 技术测定，重组颗粒的平均粒径为197 nm，微观图见图4。利用粒子表面电荷直接相关的电位研究7S 蛋白与CS 之间的相互作用，得到图3b 所示结果。从图中可以看出，SCP 颗粒的ζ 电位值在CS 和7S 之间，并且更趋于CS 的ζ 电位值，说明CS 和7S 发生了相互作用，并且重组颗粒的表面更大可能由CS 覆盖[17]。

图3 透析时间对重组SCP 颗粒的平均粒径和光散射强度的影响（a）；pH 对7S、CS 及SCP 颗粒ζ-电位的影响（b）Fig.3 Effect of dialysis on SCP particle size and derived count rate（a）；the ζ-potentials of the 7S，CS and SCP as function of pH（b）

图4 d-7s/d-cs 复合物、SCP、Cur-SCP 颗粒的TEM 和AFM 2D 图像Fig.4 Typical TEM and AFM 2D images of d-7s/d-cs complex，SCP and Cur-SCP

大豆7S 和CS 在共溶剂（6 mol/L 尿素，pH 5.5）中的亲水性不同，其中CS 是亲溶剂的，7S 因带有较多疏水氨基酸而具有一定的疏水性。当CS∶7S 比例为1∶1 时（大于0.5 g/g），在透析缓慢去除共溶剂尿素过程中，复合物在7S 的疏水牵引下优先发生聚集，而多余的d-CS 则在静电左右下吸附在复合物聚集颗粒的附近形成亲溶剂的微区，从而阻止更大聚集体的产生，最终得到以7S 相对集中的核和以CS 相对集中的壳的组装颗粒，其形成机理如图4 所示。

2.3 SCP 颗粒的载体性质

为了探究SCP 颗粒的载体性质，考察了在7S和CS 质量浓度均为10 mg/mL 条件下，制备的SCP 对姜黄素的包封率（EE%）和荷载量（LA）的影响。如图5 所示，当[Cur]=2.0 mg/mL 时，包封率为91.5%±4.7%，每100 g 7S 可荷载18.3 g 的姜黄素（图5a）。显著高于经加热超声处理的大豆分离蛋白（14.45%）纳米复合物中姜黄素的最大荷载量[18]，以及酪蛋白纳米胶囊中姜黄素的最大LA（0.19%）[19]。

图5 SCP 颗粒中姜黄素的包封率和荷载量（a）及姜黄素在模拟胃肠液中的释放规律（b）Fig.5 Encapsulation rate and loading of curcumin in SCP particles（a）and curcumin release pattern in simulated gastrointestinal fluid（b）

通过评估姜黄素在体外模拟消化过程中的释放速率，来评估SCP 颗粒对姜黄素的生物可及性（图5b）。如图所示，游离姜黄素（预先溶于乙醇中）在消化液中遇水会发生结晶，导致其在整个消化过程中的释放速率低于5%。对照组包封的姜黄素在消化过程中快速释放并达到最大释放量，这是因为CS 和7S 在模拟胃液中均带有正电荷，两者间的作用力由静电引力变为静电斥力，颗粒完整性遭到破坏，姜黄素被快速释放[20]。而SCP 颗粒在整个消化过程中均匀缓慢释放，这是因为CS 壳层可以保护7S 内核不被胃蛋白酶水解，而在肠消化过程中，却能因pH 转变完全有效的水解达到与对照样品同样的生物可及性。

2.4 消化后姜黄素对Caco-2 细胞的增殖抑制活性

用培养液将稀释后的消化液样品作用于Caco-2 细胞，发现没有添加姜黄素的SCP 消化液对Caco-2 细胞没有明显的细胞毒性，说明其具有在功能食品上应用的可能性（图6）。Cur-SCP 和游离姜黄素（溶解于DMSO）消化液对Caco-2 细胞的增殖抑制作用呈现剂量依赖关系，随着作用浓度升高细胞增殖抑制活性增大（图6），两者对Caco-2 细胞的增殖抑制活性没有显著性差异。通过对Caco-2 细胞形态的观察（图7），发现在含有SCP培养液的细胞形态没有发生明显变化，而Cur-SCP 和游离姜黄素在姜黄素浓度大于60 μmol/L时，细胞均出现更多的边圆、细胞核固缩等细胞凋亡特征。以上结果说明，SCP 的包埋并没有损害姜黄素的抗肿瘤活性，利用该组装方法可以很好的提高姜黄素的溶解性，为开发预防肿瘤的功能食品或药品提供良好的途径。

图6 SCP、Cur-SCP 和游离姜黄素消化液对结肠腺癌细胞Caco-2 的增殖抑制作用Fig.6 The proliferation inhibition of Caco-2 by SCP，Cur-SCP and free curcumin digests

图7 用SCP、Cur-SCP 和游离姜黄素消化液孵育的Caco-2 癌细胞的细胞形态Fig.7 Cell morphologies of Caco-2 cancer cells incubated in the digestion juice of SCP，Cur-SCP and free curcumin

3 结论

本文利用尿素调控7S 和CS 的解离与重组过程，提出了1 种简单且适用于蛋白质和多糖等生物大分子的“核-壳”型纳米颗粒的制备方法。通过对组装颗粒的表面性质、微观形态、结构特性、消化性、体外活性等进行表征和分析，发现该粒子具有较高的包封率和消化稳定性。多糖壳层可以保护大豆7S 内核，避免其在消化道过早水解，同时减缓姜黄素在小肠中的释放速率。组装颗粒对姜黄素的包埋仍然保留了姜黄素原有的抗肿瘤活性，因此这种特点非常适用于开发以共组装纳米颗粒为输送载体的口服营养物质产品，对于即载药物的持续释放和药物的智能输送有重大借鉴意义。