黑豆纳豆激酶粗提取物的免疫调节作用

田玥玮，张永坡*，高春艳，赵晋忠，杜维俊

（1 山西农业大学基础部 山西晋中030801 2 山西农业大学农学院 山西晋中 030801）

纳豆是以煮熟的大豆为原料，通过接种纳豆菌发酵而成的一种传统保健食品[1]，除了含有纳豆激酶、SOD、异黄酮等多种活性物质外，还富含氨基酸、有机酸、寡聚糖等有益于人体肠道健康的营养成分[2]。近年来，由于人们越来越关注纳豆类产品的保健功能，国内外学者研究了纳豆及其主要活性物质纳豆激酶的多种功能作用[3]，结果发现其具有治疗心血管疾病[4]、溶解血栓[5]、降血压[6]、抗癌[7]、抗氧化[8]等保健功能。黑豆含有多酚、花色苷、黄酮等多种活性物质，相对于黄豆含量更高，因此黑豆更具药用价值[9]。研究表明，食用黑豆能够增加多酚浓度，有助于改善血管功能，并通过减少人体氧化应激，从而降低患心血管疾病的风险[10]。本文以壶关大黑豆为原料，发酵制备提取纳豆激酶粗提取物，得到黑豆纳豆激酶粗提取物（Black bean nattokinase crude extract，BNCE）。

动物实验表明，纳豆激酶通过口服给药能减少大鼠颈动脉形成的血栓质量，具有显著的溶栓效果[11]。本文以不同浓度的BNCE 进行处理，研究其对小鼠的体外溶栓作用，以期为黑豆纳豆激酶溶栓作用的深入研究提供数据支持。

除此之外，有研究发现许多天然产物成分对RAW264.7 细胞具有免疫促进[12]或免疫抑制[13]或二者兼具的双向免疫调节作用[14]。目前关于纳豆激酶的免疫调节作用尚未见报道。为研究BNCE对细胞免疫调节的影响，本研究以RAW264.7 细胞为试验模型，研究BNCE 对正常状态及脂多糖（LPS）激活状态下RAW264.7 细胞的免疫调节作用，以期为纳豆激酶的免疫调节作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

壶关大黑豆，山西农业大学遗传与种质创新实验室；RAW264.7 细胞，天津医科大学。

1.2 主要试剂

纳豆菌粉，尚川生物科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO），阿拉丁公司；氯化钠、硫酸铵、溴化钾、乙醇、冰乙酸，天津大茂化学试剂厂；纤维蛋白原、尿激酶、凝血酶、琼脂、RPMI Medium 1640 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、脂多糖（LPS）、噻唑蓝（MTT）、中性红染色液、小鼠白细胞介素-6 试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子-α 试剂盒、小鼠白介素-1β试剂盒，北京索莱宝有限公司。

1.3 主要仪器与设备

仪器及设备详见表1。

表1 仪器及设备一览表Table 1 List of instruments and equipment

1.4 试验方法

1.4.1 BNCE 的制备、提取与分离 将黑豆仔细挑选并称取25 g，用蒸馏水清洗2～3 遍以除去表面杂质，加入100 mL 蒸馏水浸泡过夜。浸泡好的黑豆放入高压蒸汽灭菌锅，121 ℃灭菌30 min 后取出，冷却至30～40 ℃。称取0.3 g 纳豆菌粉，采用直投式纳豆芽孢杆菌的方法，用40 ℃左右的蒸馏水溶解纳豆菌粉，充分溶解后均匀地接种到黑豆上以保证黑豆表面均有菌液。将接种后的黑豆放入恒温恒湿培养箱，设置温度37 ℃，湿度70%，发酵18 h。把发酵好的黑豆放入4 ℃冰箱后熟24 h，得到黑纳豆成品。

将黑纳豆成品放入-20 ℃冰箱预冻后进行冷冻干燥，干燥后用粉碎机打粉并过筛得到黑纳豆冻干粉。称取适量黑纳豆冻干粉，并与生理盐水按照1∶10（g/mL）的料液比混匀，混匀后的溶液放入4 ℃冰箱静置12 h。之后在4 ℃，10 000 r/min 条件下离心10 min，弃掉沉淀，保留上清，即为黑豆纳豆激酶粗提取液。

向20 mL 黑豆纳豆激酶粗提取液中缓慢加入固体硫酸铵使其终浓度达到20%饱和度（110 g/L）[11]，放入4 ℃冰箱静置12 h。之后在4 ℃，10 000 r/min 条件下离心10 min，弃掉沉淀，保留上清。向上述得到的上清中缓慢加入固体硫酸铵使其终浓度达到60%饱和度（360 g/L），同样静置、离心，弃掉上清，保留沉淀。将最终得到的沉淀进行冷冻干燥，然后在-20 ℃条件下保存备用，即可得到黑豆纳豆激酶粗提取物（Black bean nattokinase crude extract，BNCE）。

1.4.2 BNCE 的结构初探 通过红外光谱分析和扫描电镜探究BNCE 的结构。称取适量BNCE 样品与溴化钾粉末按质量比1∶100 混合，充分研磨后压片，用红外光谱仪在波长400～4 000 cm-1范围内扫描采集数据，通过傅里叶红外光谱法测定BNCE 的特征吸收峰。将冷冻干燥后的BNCE 粉末粘到铜质样品台上，吹去未粘牢的样品粉末，然后对样品表面进行喷金，通过扫描电镜观察BNCE 的表面形状和结构。

1.4.3 BNCE 酶活的测定 采用纤维蛋白平板法测定BNCE 的酶活。称取25 mg 纤维蛋白原并用10 mL 生理盐水充分溶解，缓慢均匀地加入并不断搅拌至澄清，得到乳白色的纤维蛋白原溶液（2.5 mg/mL）。称取0.15 g 琼脂粉用10 mL 生理盐水溶解，加热使琼脂粉完全溶解得到琼脂溶液（1.5%），并于60 ℃水浴保温。向装有1 000 U 的凝血酶粉末管中加入1 mL 生理盐水，充分溶解并稀释得到25 U/mL 的凝血酶溶液。

先将上述配好的10 mL 纤维蛋白原溶液和10 mL 琼脂溶液混匀后倒入培养皿，后向培养皿中加入1 mL 凝血酶溶液，并快速搅拌使其混匀，在搅拌过程中要防止气泡产生。静置冷却，待培养皿中溶液完全凝固方可制成纤维蛋白平板。点样时，在平板上打出小孔并吸出小孔里的液体，再向打好的小孔中加入20 μL 待测溶液。点样完成后，将纤维蛋白平板放于恒温恒湿培养箱中，设置温度37 ℃，湿度70%，反应18 h。反应结束后对平板上小孔周围溶解圈的直径进行测量，并根据标准曲线计算酶活。

以尿激酶作为阳性对照，把酶活为50 000 U/g的尿激酶粉末用生理盐水分别配制成1 000，800，600，400，200，100，50 U/mL 的浓度。按照上述方法，打好小孔后，每孔加入20 μL 尿激酶溶液，反应后对溶解圈的直径进行测量，计算面积并绘制标准曲线。

1.4.4 BNCE 的溶栓率测定 动物血块法检测BNCE 的体外溶栓作用。取多份新鲜小鼠血液于2 mL 离心管中，静置使其凝固，将血凝块吸干多余水分后分别称重，并同时放入相应的离心管中。称取适量BNCE 样品，用生理盐水溶解稀释至156.25，312.5，625，1 250，2 500，5 000 μg/mL，以生理盐水作为对照。将配制好的样品溶液各取1 mL加入装有血凝块的离心管中，于37 ℃条件下水浴，在作用4 h 和8 h 后，将血凝块取出吸干多余水分，分别称重并计算样品作用4 h 和8 h 后的溶栓率。溶栓率计算公式如下：

式中，m——溶解前血凝块质量（g）；m0——溶解后血凝块质量（g）。

1.4.5 BNCE 对RAW264.7 细胞增殖的影响 采用MTT 比色法探究BNCE 对RAW264.7 细胞增殖的影响。RAW264.7 细胞用1640 培养基于37℃，5%CO2条件下培养，待细胞生长至培养瓶的80%～90%时，消化传代，2～3 代后方可进行试验处理。将细胞按1×105个/mL 接种于96 孔细胞培养板中，贴壁后分组。1）正常状态下的细胞：①空白对照组：只加培养基；②LPS 组：加入终浓度为2.5 μg/mL 的LPS；③BNCE 处理组：加入不同质量浓度的BNCE 进行处理（经过试验初筛最终选取6个BNCE终质量浓度：15.625，30.25，62.5，125，250，500 μg/mL）；2）LPS 激活状态下的细胞：①空白对照组：只加培养基；②LPS 组：加入终质量浓度为2.5 μg/mL 的LPS；③LPS+BNCE 处理组：加入与正常状态BNCE 处理组相同浓度的BNCE 进行处理后，再加入终质量浓度为2.5 μg/mL 的LPS。细胞培养一段时间后，向每孔加入10 μL 的MTT（5 mg/mL），继续培养4 h。取出培养板弃去培养液，向每孔中加入100 μL 的DMSO，振荡10 min 后，使用酶标仪在570 nm 波长处对其吸光度进行检测，计算细胞相对增殖率，每孔设置3 个复孔取平均值。细胞相对增殖率计算公式如下：

1.4.6 时间对RAW264.7 细胞增殖的影响 采用MTT 比色法探究时间对RAW264.7 细胞增殖的影响。按照上述试验分组，加入相对应的药物处理后，分别培养12，24，36 h。再向每孔中加入10 μL的MTT（5 mg/mL）继续培养4 h。取出培养板弃去培养液，向每孔中加入100 μL DMSO，振荡10 min 后，使用酶标仪在570 nm 波长处检测吸光度，并计算细胞相对增殖率，每孔设置3 个复孔取平均值，比较不同培养时间分别对细胞增殖的影响。细胞相对增殖率按式（2）计算。

1.4.7 BNCE 对RAW264.7 细胞吞噬率的影响

采用中性红染色法探究BNCE 对RAW264.7 细胞吞噬率的影响。将细胞按1×105个/mL 接种于96 孔细胞培养板中，贴壁后按照上述试验分组，加入相对应的药物处理，培养24 h。取出培养板弃去培养液，向每孔100 μL 0.1%中性红溶液继续培养，30 min 后弃去培养液，用PBS 洗涤2～3 次。再向每孔加入100 μL 裂解液（乙醇∶冰乙酸体积比为1∶1），4 ℃静置过夜，使用酶标仪在540 nm波长处检测吸光度。细胞吞噬率计算公式如下：

1.4.8 BNCE 对RAW264.7 细胞分泌IL-6、TNFα 和IL-1β 的影响 采用ELISA 法探究BNCE 对RAW264.7 细胞分泌白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）的影响。细胞按照上述方法进行培养处理，收集上清液，按照ELISA 试剂盒说明书操作，测定细胞各因子的浓度水平。

1.4.9 数据分析 试验结果采用Excel 和Graph Pad Priam 8 分析，结果均以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 BNCE 的结构

BNCE 的红外光谱吸收峰如图1 所示，3 342.94 cm-1宽峰是N-H 键伸缩振动峰，2 928.99 cm-1处的峰是C-H 键伸缩振动峰。1 655.21，1 553.89，1 243.78 cm-1出现的吸收峰分别是蛋白质酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带和酰胺Ⅲ带，进一步说明分离出的BNCE 成分具有蛋白质的化学结构[15]。1 402 cm-1处的峰是C-H 键的变形振动峰，1 079.39 cm-1是C-O 伸缩振动吸收峰。在900 cm-1以下，有619.19 cm-1一个指纹特征峰。

图1 BNCE 的红外光谱图Fig.1 Infrared spectra of BNCE

扫描电镜下BNCE 表观形貌如图2 所示。400 倍下，BNCE 呈团状分布，表面附着微小碎片；3 500 倍下，BNCE 表观呈大小不同且无规则的碎片形状，碎片表面光滑。

图2 BNCE 的扫描电镜图Fig.2 SEM images of BNCE

2.2 BNCE 的酶活

按照1.4.3 的方法制备所得的纤维蛋白平板，初始为不透明的乳白色，点样后小孔周围呈现透明的溶解圈，其原因是纤溶性物质会逐渐溶解纤维蛋白，从而导致乳白色消失[16]。以尿激酶酶活（U/mL）为横坐标，尿激酶在纤维蛋白平板上的溶解圈面积（mm2）为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：y=0.189x+349.55。不同尿激酶浓度所对应的溶解圈面积如表2 所示，尿激酶酶活的标准曲线如图3 所示。该方程表明尿激酶酶活与纤维蛋白平板上的溶解圈面积呈线性关系，因此可以作为衡量样品纤溶活性的指标。BNCE 在纤维蛋白平板上的溶解圈如图4 所示。将BNCE 在纤维蛋白平板上的溶解圈面积代入方程，计算得到BNCE 酶活为6 148 U/g。

图3 尿激酶酶活标准曲线Fig.3 Standard curve of urokinase activity

图4 BNCE 在纤维蛋白平板上的溶解圈Fig.4 The dissolving ring of BNCE on a fribin plate

表2 不同浓度的尿激酶所对应的溶解圈面积Table 2 Fribin plate area corresponding to urokinase of different concentrations

2.3 BNCE 的溶栓作用

不同质量浓度BNCE 样品对小鼠体外血凝块的溶解时间与溶栓率见图5。由图5 可见，随着质量浓度的增加，BNCE 的溶栓作用逐渐增强，表现出一定的浓度依赖性；随着时间的延长，BNCE的溶栓作用也逐渐增强，表现出一定的时间依赖性。因此，BNCE 具有一定的体外溶栓作用。

图5 不同浓度的BNCE 对小鼠体外血凝块的溶解率Fig.5 Thrombolysis rate of BNCE with different concentration on blood clot in vitro in mice

2.4 BNCE 对RAW264.7 细胞增殖的影响

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO 能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪测定其吸光度（OD）值，可间接反映活细胞数量。在一定范围内，MTT 结晶形成的量与细胞数成正比，OD 值越大，说明活细胞的数量越多[17]。表3 的结果表明，在正常状态下，随着BNCE 质量浓度的升高，RAW264.7 细胞的相对增殖率呈上升趋势。加入LPS 刺激后，RAW264.7 细胞的相对增殖率仍具有浓度依赖性。MTT 试验结果表明，在正常状态和LPS 激活状态下，BNCE 质量浓度在15.625～500 μg/mL 范围内，各浓度对RAW264.7 细胞均有促增殖作用，无细胞毒性。

表3 BNCE 对RAW264.7 细胞增殖的影响Table 3 Effects of BNCE on the proliferation in RAW264.7 cells

表4 BNCE 对RAW264.7 细胞吞噬率的影响Table 4 Effects of BNCE on the phagocytosis rate of RAW264.7 cells

2.5 时间对RAW264.7 细胞增殖的影响

基于BNCE 对细胞会促增殖且无毒性的影响，进而研究了在正常状态和LPS 激活状态下，时间对RAW264.7 细胞增殖的影响。结果如图6 所示，无论在正常状态（a）还是LPS 激活状态（b）下，24 h 时RAW264.7 细胞的增殖率均为最大。因此，选取24 h 为最佳作用时间。

图6 时间对RAW264.7 细胞增殖的影响Fig.6 Effects of time on the proliferation in RAW264.7 cells

2.6 BNCE 对RAW264.7 细胞吞噬率的影响

RAW264.7 细胞是一种具有重要功能的吞噬细胞，在清除异物和病原体方面发挥重要作用。在病原体入侵或自身组织发生病理性变化时，它能发挥细胞内杀伤作用从而消灭抗原。吞噬率是衡量RAW264.7 细胞活性的一个重要指标[18]。由表6可得，LPS（2.5 μg/mL）刺激后的细胞吞噬率是对照组的1.5 倍。与对照组相比，BNCE 在质量浓度为15.625～500 μg/mL 时，RAW264.7 细胞的吞噬率增加且具有浓度依赖性。以上结果说明BNCE能够增强RAW264.7 细胞的吞噬率，对机体的免疫调节具有重要作用。

2.7 BNCE 对RAW264.7 细胞分泌炎症IL-6、TNF-α 和IL-1β 的影响

炎症细胞因子是指参与炎症反应的各种细胞因子。众多炎症细胞因子中，在免疫应答和炎症调节中起主要作用的是IL-6、TNF-α、IL-1β[19]等。

IL-6 是一种具有多种功能的细胞因子，主要由巨噬细胞、T 淋巴细胞、B 淋巴细胞产生，它参与机体的免疫调节及炎症反应，对机体的防御起重要作用[20]。由图7 可见，与对照组相比，随着BNCE质量浓度的增加，IL-6 的分泌量逐渐降低，表明BNCE 对RAW264.7 细胞分泌IL-6 具有抑制作用。与LPS 组相比，随着BNCE 质量浓度的增加，IL-6 的分泌量先降低后增加，在质量浓度为125 μg/mL 时，IL-6 的分泌量达到最小值，且质量浓度为62.5～500 μg/mL 时，IL-6 分泌量的水平均没有高于LPS 组，表示BNCE 能够降低IL-6 分泌量的水平，并能抑制LPS 诱导RAW264.7 细胞的炎症反应。

图7 BNCE 对RAW264.7 细胞分泌IL-6 的影响Fig.7 Effects of BNCE on the production of IL-6 in RAW264.7 cells

TNF-α 是一种单核因子，主要由活跃的巨噬细胞和单核细胞分泌，并且能促进这些细胞分泌及表达IL-6、IL-1β、胶原酶和黏附分子等，更能反映机体的炎症反应，在免疫功能中起着至关重要的作用[21]。由图8 可见，与对照组相比，随着BNCE 质量浓度的增加，TNF-α 的分泌量先增加后降低，在质量浓度为250 μg/mL 时，TNF-α 的分泌量达到最大值，且质量浓度为62.5～250 μg/mL时，TNF-α 的分泌量有浓度依赖性，表明BNCE 对RAW264.7 细胞分泌TNF-α 具有促进作用。与LPS 组相比，随着BNCE 质量浓度的增加，TNF-α的分泌量降低并呈现出浓度依赖性，表示BNCE能够有效降低TNF-α 分泌量的水平，并有效抑制LPS 诱导RAW264.7 细胞的炎症反应。

图8 BNCE 对RAW264.7 细胞分泌TNF-α 的影响Fig.8 Effects of BNCE on the production of TNF-α in RAW264.7 cells

IL-1β 既参与多种细胞活动，如细胞增殖、分化和凋亡，还可活化T 细胞、B 细胞，促进多种免疫分子相关基因表达，是炎症反应的重要介质[22]。由图9 可见，与对照组相比，随着BNCE 质量浓度的增加，IL-1β 的分泌量增加并呈现出浓度依赖性，表明BNCE 对RAW264.7 细胞分泌IL-1β 具有促进作用。与LPS 组相比，随着BNCE 质量浓度的增加，IL-1β 的分泌量降低并呈现出浓度依赖性，表示BNCE 能够有效降低IL-1β 分泌量的水平，并有效抑制LPS 诱导RAW264.7 细胞的炎症反应，与其对TNF-α 的抑制作用结果类似。

图9 BNCE 对RAW264.7 细胞分泌IL-1β 的影响Fig.9 Effects of BNCE on the production of IL-1β in RAW264.7 cells

RAW264.7 细胞活化后会产生多种细胞因子、酶类和促炎介质，对微生物和肿瘤细胞具有强大的杀伤作用，然而若受到过多内毒素的刺激，可能会出现颅脑损伤、心肌缺血、局部或全身炎症反应以及某些其它疾病。有研究发现，部分天然产物成分对人体有一种双向的免疫调节功能，可使机体的免疫功能从过高或过低的水平恢复到正常水平[23]。这些天然产物不仅是一种免疫激活剂，可提高机体的免疫水平，同时也可以作为一种免疫抑制剂，能够在一定程度上避免机体的免疫系统因免疫过度而受损。上述结果显示，BNCE 对RAW264.7 细胞分泌TNF-α 和IL-1β 具有类似的双向免疫调节作用。

3 结论

从黑豆纳豆中提取得到的BNCE 具有蛋白质的化学结构，表观呈现大小不同且无规则的碎片形状，具有一定的纤溶活性。体外溶栓作用试验结果表明：BNCE 的溶栓作用具有一定的浓度依赖性和时间依赖性。以RAW264.7 细胞作为试验模型，研究BNCE 对RAW264.7 细胞的免疫调节作用。结果表明：1）BNCE 在质量浓度为15.625～500 μg/mL，作用时间为24 h 时，可以促进正常状态以及LPS 激活状态下RAW264.7 细胞的增殖，无细胞毒性，并且能增强RAW264.7 细胞的吞噬率，具有浓度依赖性；2）BNCE 在质量浓度为62.5～500 μg/mL 时，可以活化正常状态下的RAW264.7 细胞，从而促进细胞因子TNF-α 和IL-1β 的分泌，具有一定的浓度依赖性，这表明BNCE 能够提高机体的免疫水平，是一种免疫激活剂；3）BNCE 在质量浓度为62.5～500 μg/mL 时，不仅能抑制正常状态下的RAW264.7 细胞IL-6 的分泌，也能抑制LPS 激活状态下RAW264.7 细胞IL-6、TNF-α 和IL-1β 的分泌，这表明BNCE 在一定程度上也能够防止免疫过度造成的机体损伤，是一种免疫抑制剂。有关溶栓作用和免疫调节的进一步作用机制，仍需通过后续试验继续探究。